Протокол пробирного анализа MBEC с использованием 96-луночного планшетного ультразвукового аппарата UIP400MTP

Анализ MBEC используется для определения концентрации противомикробных агентов, необходимых для устранения биопленок, образующихся на крышках колышков. Чтобы оценить жизнеспособность биопленки, биопленки должны быть сначала отделены от колышковых крышек 96-луночного планшета. Ультразвуковая обработка является наиболее надежным и эффективным методом для этой отслойки. Многолуночный ультразвуковой аппарат UIP400MTP специально разработан для обработки пробирных планшетов с максимальной эффективностью и удобством, оптимизируя и ускоряя высокопроизводительные анализы MBEC.

Ультразвуковая обработка при отслоении биопленки

Ультразвуковая обработка является важным этапом в анализах минимальной концентрации уничтожения биопленки (MBEC), обеспечивая эффективное вытеснение биопленочных клеток из их поверхностного прикрепления. Биопленки по своей сути представляют собой структурированные сообщества микроорганизмов, заключенные во внеклеточный матрикс, что делает их значительно более устойчивыми к антимикробным препаратам по сравнению с планктонными клетками. Во время анализа MBEC ультразвуковая обработка использует ультразвуковые волны для создания контролируемой кавитации, разрушая матрицу биопленки и высвобождая встроенные клетки в суспензию. Этот этап обеспечивает равномерное распределение биопленочных клеток в восстановительной среде, что способствует точной оценке жизнеспособности с помощью гальванического покрытия, разбавления или спектрофотометрических методов. Без надлежащего отделения биопленки остаточные компоненты матрикса могут экранировать клетки, что приводит к недооценке антимикробной эффективности. Таким образом, ультразвуковая обработка незаменима для получения надежных и воспроизводимых значений MBEC, отражающих истинный потенциал эрадикации тестируемых агентов. Многолуночный планшетный ультразвуковой аппарат UIP400MTP позволяет легко и с высокой пропускной способностью готовить образцы в пробирных планшетах.

Протокол анализа минимальной концентрации для уничтожения биопленки (MBEC)

Шаг 1: Образование биопленки

1. Приготовьте бактериальную суспензию:
   Выращивайте бактерии в подходящих средах для логарифмического роста.
   Разбавьте бактериальную культуру до определенной оптической плотности (например, OD600 ~0,1).
2. Инокулируйте 96-луночный планшет:
   Добавьте бактериальную суспензию (например, 150–200 мкл) в каждую лунку стандартного 96-луночного микротитровального планшета.
3. Прикрепите колышковую крышку:
   Поместите крышку с колышком на инокулированную пластину, чтобы обеспечить образование биопленки на поверхностях колышков.
4. Инкубируйте тарелку:
   Инкубируйте установку при соответствующей температуре (например, 37°C) в течение 24–48 часов, не встряхивая, чтобы стимулировать рост биопленки.

Шаг 2: Лечение противомикробными препаратами

• Приготовьте противомикробные растворы:
  Приготовьте различные концентрации противомикробных препаратов в свежих средах.
  Подвергают биопленки воздействию противомикробных средств:
  Снимите колышек с бактериальной культуры и промойте ее в стерильном физрастворе или PBS для удаления планктонных клеток.
  Поместите колышковую крышку в новую 96-луночную пластину, содержащую противомикробные растворы.
• Инкубируйте тарелку:
  Инкубируйте в течение определенного периода времени (например, 24 часа), чтобы обеспечить воздействие противомикробных препаратов.

Шаг 3: Ультразвуковая обработка с помощью 96-луночного планшетного ультразвукового аппарата UIP400MTP

Этап ультразвуковой обработки имеет решающее значение для отделения биопленок от колышковых крышек для оценки жизнеспособности. Выполните следующие действия для UIP400MTP ультразвукового аппарата:

1. Подготовьте установку:
   Заполните свежую 96-луночную пластину восстановительной средой (например, нейтрализующим бульоном или свежей средой для выращивания) в каждой лунке.
2. Переложите колышек крышкой:
   Снимите колышковую крышку с пластины для антимикробной обработки.
   Промойте крышку колышка в стерильном физрастворе или PBS для удаления остатков противомикробных агентов.
3. Расположение пластины и ультразвуковой аппарата:
   Прикрепите колышковую крышку к пластине для восстановительной среды.
   Поместите пластину для восстановительной среды на платформу ультразвукового аппарата UIP400MTP, убедившись, что пластина отцентрирована и устойчива.
4. Настройте параметры ультразвука:
   Установите параметры ультразвука на UIP400MTP (настройки можно подстроить под биопленку):
   Амплитуда: 70–100%.
   Время ультразвуковой обработки: 1–3 минуты (регулируется в зависимости от прочности биопленки) в циклическом режиме.
5. Ультразвуковая обработка:
   Запустите процесс обработки ультразвуком. Ультразвуковая вибрация вытесняет биопленки с поверхностей штифтов в восстанавливающую среду.
6. Контролируйте процесс:
   Используйте вставной датчик температуры для контроля температуры проб в лунках. UIP400MTP можно подключить к лабораторному охладителю для охлаждения.
7. Работа с постультразвуковой обработкой:
   Немедленно перенесите среду для восстановления (теперь содержащую отделенные биопленки) в свежую стерильную тарелку для последующего анализа.

(А) Планшет, содержащий БЭТ с 2% глюкозой, используемый для образования биопленки, восстановления клеток, и
определение MIC и MBCB; (Б) Крышка со штифтами для образования стафилококковых биопленок. определение MIC и MBCB; (Б) Крышка со штифтами для образования стафилококковых биопленок.
Образующиеся на штифтах биопленочные клетки вытесняли с помощью ультразвуковой обработки (ультразвуковая технология Hielscher) в течение 5 мин в 96-луночных планшетах, содержащих свежую питательную среду для восстановления клеток.
(Фото и исследование: ©де Оливейра и др., 2016)

Шаг 4: Оценка жизнеспособности

Планшетные и культуральные обособленные биопленки:

1. Выполняйте серийное разведение восстановительной среды и планшета на агаре для подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ).
   В качестве альтернативы можно использовать колориметрический или флуоресцентный анализ жизнеспособности.
2. Рекордные результаты:
   Определите MBEC как самую низкую концентрацию противомикробного препарата, которая уничтожает обнаруживаемую жизнеспособность биопленки.

Проектирование, производство и консалтинг – Качество «Сделано в Германии»

Ультразвуковые аппараты Hielscher хорошо известны своими высочайшими стандартами качества и дизайна. Надежность и простота в эксплуатации позволяют без проблем интегрировать наши ультразвуковые аппараты в промышленные объекты. Гидроакустические аппараты Hielscher легко справляются с суровыми условиями и требовательными условиями окружающей среды.

Hielscher Ultrasonics является компанией, сертифицированной по стандарту ISO, и уделяет особое внимание высокопроизводительным ультразвуковым аппаратам, отличающимся самыми современными технологиями и удобством в использовании. Конечно, ультразвуковые аппараты Hielscher соответствуют требованиям CE и соответствуют требованиям UL, CSA и RoHs.

Читайте здесь, как UIP400MTP используется для отслоения биопленки в качестве этапа подготовки образца в соответствии с протоколом ASTM E2799 для проверки эффективности дезинфицирующего средства против биопленки Pseudomonas aeruginosa с использованием анализа MBEC.