Протокол анализа MBEC с использованием ультразвукового устройства UIP400MTP для 96-луночных планшетов

Анализ MBEC используется для определения концентрации антимикробных средств, необходимой для уничтожения биоплёнок, сформировавшихся на крышках со штифтами. Для оценки жизнеспособности биоплёнок их сначала необходимо отделить от крышек со штифтами 96-луночного планшета. Обработка ультразвуком – самый надёжный и эффективный метод такого отделения. Ультразвуковое устройство UIP400MTP для многолуночных планшетов специально разработано для обработки аналитических планшетов с максимальной эффективностью и удобством, что упрощает и ускоряет высокопроизводительное проведение анализов MBEC.

Обработка ультразвуком для отделения биоплёнок

Обработка ультразвуком – важнейший этап анализов минимальной концентрации, уничтожающей биоплёнку (MBEC), позволяющий эффективно отделять клетки биоплёнки от поверхности, к которой они прикреплены. Биоплёнки по своей природе представляют собой структурированные сообщества микроорганизмов, заключённых во внеклеточный матрикс, который делает их значительно более устойчивыми к антимикробным средствам по сравнению с планктонными клетками. При проведении анализов MBEC обработка ультразвуком использует ультразвуковые волны для создания контролируемой кавитации, разрушающей матрикс биоплёнки и высвобождающей заключённые в нём клетки в суспензию. Этот этап обеспечивает равномерное распределение клеток биоплёнки в среде для восстановления, способствуя точной оценке жизнеспособности методами посева, разведения или спектрофотометрии. Без надлежащего отделения биоплёнки остаточные компоненты матрикса могут защищать клетки, приводя к недооценке эффективности антимикробных средств. Поэтому обработка ультразвуком незаменима для получения надёжных и воспроизводимых значений MBEC, отражающих истинный потенциал исследуемых средств в отношении уничтожения биоплёнок. Ультразвуковое устройство UIP400MTP для многолуночных планшетов позволяет легко выполнять высокопроизводительную подготовку образцов в аналитических планшетах.

Протокол анализа минимальной концентрации, уничтожающей биоплёнку (MBEC)

Этап 1: Формирование биоплёнки

1. Подготовьте бактериальную суспензию:
   Выращивайте бактерии в подходящих средах до логарифмической фазы роста.
   Разведите бактериальную культуру до заданной оптической плотности (например, OD600 ~0,1).
2. Инокулируйте 96-луночный планшет:
   Добавьте бактериальную суспензию (например, 150–200 µL) в каждую лунку стандартного 96-луночного микротитрационного планшета.
3. Установите крышку со штифтами:
   Поместите крышку со штифтами на инокулированный планшет, чтобы обеспечить формирование биоплёнок на поверхностях штифтов.
4. Инкубируйте планшет:
   Инкубируйте собранную систему при подходящей температуре (например, 37°C) в течение 24–48 часов без встряхивания, чтобы способствовать росту биоплёнок.

Этап 2: Обработка антимикробными средствами

• Подготовьте растворы антимикробных средств:
  Приготовьте растворы антимикробных средств в диапазоне концентраций в свежих средах.
  Подвергните биоплёнки воздействию антимикробных средств:
  Снимите крышку со штифтами с планшета с бактериальной культурой и промойте её в стерильном физиологическом растворе или PBS для удаления планктонных клеток.
  Поместите крышку со штифтами в новый 96-луночный планшет, содержащий растворы антимикробных средств.
• Инкубируйте планшет:
  Инкубируйте в течение заданного периода (например, 24 часов), чтобы обеспечить воздействие антимикробных средств.

Этап 3: Обработка ультразвуком с помощью устройства UIP400MTP для 96-луночных планшетов

Этап обработки ультразвуком имеет решающее значение для отделения биоплёнок от крышек со штифтами с целью оценки жизнеспособности. При использовании ультразвукового устройства UIP400MTP выполните следующие действия:

1. Подготовьте систему:
   Заполните каждую лунку нового 96-луночного планшета средой для восстановления (например, нейтрализующим бульоном или свежей питательной средой).
2. Перенесите крышку со штифтами:
   Снимите крышку со штифтами с планшета для обработки антимикробными средствами.
   Промойте крышку со штифтами в стерильном физиологическом растворе или PBS для удаления остаточных антимикробных средств.
3. Разместите планшет и ультразвуковое устройство:
   Установите крышку со штифтами на планшет со средой для восстановления.
   Поместите планшет со средой для восстановления на платформу ультразвукового устройства UIP400MTP, убедившись, что планшет расположен по центру и устойчив.
4. Настройте параметры обработки ультразвуком:
   Установите параметры обработки ультразвуком на UIP400MTP (настройки можно адаптировать к биоплёнке):
   Амплитуда: 70–100%.
   Время обработки ультразвуком: 1–3 минуты (корректируйте с учётом прочности биоплёнки) в циклическом режиме.
5. Обработайте ультразвуком:
   Запустите процесс обработки ультразвуком. Ультразвуковые колебания отделят биоплёнки от поверхностей штифтов и перенесут их в среду для восстановления.
6. Контролируйте процесс:
   Используйте подключаемый датчик температуры для контроля температуры образцов в лунках. Для охлаждения UIP400MTP можно подключить к лабораторному охладителю.
7. Действия после обработки ультразвуком:
   Немедленно перенесите среду для восстановления (теперь содержащую отделённые биоплёнки) в новый стерильный планшет для последующего анализа.

(A) Планшет, содержащий TSB с 2% глюкозы, используемый для формирования биоплёнок, восстановления клеток и
определения MIC и MBCB; (B) Крышка со штифтами для формирования стафилококковых биоплёнок. определение MIC и MBCB; (B) Крышка со штифтами для формирования стафилококковых биоплёнок.
Клетки биоплёнок, сформировавшихся на штифтах, отделяли обработкой ультразвуком (ультразвуковая технология Hielscher) в течение 5 min в 96-луночных планшетах, содержащих свежую культуральную среду для восстановления клеток.
(Изображение и исследование: ©de Oliveira et al., 2016)

Этап 4: Оценка жизнеспособности

Выполните посев и культивирование отделённых биоплёнок:

1. Выполните последовательные разведения среды для восстановления и посев на агар для подсчёта колониеобразующих единиц (CFU).
   В качестве альтернативы используйте колориметрический или флуоресцентный анализ жизнеспособности.
2. Запишите результаты:
   Определите MBEC как самую низкую концентрацию антимикробного средства, при которой была устранена обнаруживаемая жизнеспособность биоплёнки.

Проектирование, производство и консультирование – качество, произведённое в Германии

Ультразвуковые устройства Hielscher хорошо известны высочайшими стандартами качества и проектирования. Прочность и простота эксплуатации позволяют беспрепятственно интегрировать наши ультразвуковые устройства в промышленные объекты. Ультразвуковые устройства Hielscher легко справляются с суровыми условиями и сложной эксплуатационной средой.

Hielscher Ultrasonics – компания, сертифицированная по ISO, которая уделяет особое внимание высокопроизводительным ультразвуковым устройствам с передовыми технологиями и удобством использования. Разумеется, ультразвуковые устройства Hielscher соответствуют требованиям CE и отвечают требованиям UL, CSA и RoHs.

Узнайте здесь, как UIP400MTP используется для отделения биоплёнок на этапе подготовки образцов в рамках протокола ASTM E2799 для проверки эффективности дезинфицирующих средств против биоплёнки Pseudomonas aeruginosa с помощью анализа MBEC.