Протокол анализа минимальной ингибирующей концентрации (MIC)

Анализ минимальной ингибирующей концентрации (MIC) на основе биопленки является важным методом оценки эффективности антимикробных препаратов против микроорганизмов, ассоциированных с биопленкой, которые демонстрируют повышенную устойчивость благодаря своему защитному внеклеточному матриксу. Решающим этапом в этом анализе является разрушение биопленочных структур для высвобождения встроенных клеток для точной оценки жизнеспособности. Многолуночный ультразвуковой аппарат UIP400MTP облегчает этот процесс, используя сфокусированный ультразвук для создания контролируемой кавитации, эффективно отделяя клетки биопленки и диспергируя их в однородную суспензию. Это точное и воспроизводимое разрушение биопленки повышает надежность и производительность анализов MIC, что делает UIP400MTP важным инструментом в продвижении исследований биопленки.

Ультразвуковая обработка при отслоении биопленки

Анализ MIC на основе биопленки обычно измеряет жизнеспособность бактерий или ингибирование роста с помощью таких методов, как гальваническое покрытие, подсчет колоний или измерение оптической плотности. Ультразвуковая обработка является важнейшим этапом анализа МПК на основе биопленки при оценке антимикробной восприимчивости микроорганизмов, ассоциированных с биопленкой. Его основная функция заключается в отделении и диспергировании клеток, встроенных в биопленочный матрикс, в однородную суспензию для точного анализа.
Биопленки значительно более устойчивы к противомикробным агентам по сравнению с планктонными клетками, что делает надлежащую отслойку критически важной для точного анализа. Во время этого процесса ультразвуковые волны генерируют контролируемую кавитацию, разрушая матрицу биопленки и высвобождая встроенные клетки в однородную суспензию в восстановительной среде. Этот шаг позволяет точно оценить жизнеспособность клеток, диспергированных в биопленке, с помощью таких методов, как осаждение, разведение и подсчет колоний. Надлежащее разрушение биопленки с помощью ультразвука предотвращает защиту клеток оставшимися компонентами матрикса, что в противном случае могло бы привести к недооценке антимикробной активности. Для этой цели особенно хорошо подходит многолуночный ультразвуковой аппарат UIP400MTP, который предлагает точные и воспроизводимые условия ультразвуковой обработки для обеспечения надежной и высокопроизводительной подготовки аналитических пластин.

Почему ультразвук необходим при анализах минимальной ингибиторной концентрации на основе биопленки

Для измерения жизнеспособности и подсчета клеток требуется полное и надежное отделение и диспергирование отдельных клеток. UIP400MTP способствует равномерному, не повреждающему отслоению биопленки и диспергированию клеток для получения надежных результатов анализа.

• Сложность биопленки: Биопленки представляют собой структурированные микробные сообщества, заключенные во внеклеточную матрицу полимерного вещества (ЭПС), которая защищает микроорганизмы и делает их более устойчивыми к антимикробным агентам.
• Равномерная дисперсия: Чтобы точно измерить жизнеспособность клеток, встроенных в биопленку, или их чувствительность к противомикробным препаратам, биопленку необходимо сначала вытеснить и разбить на однородную суспензию.

Протокол анализа минимальной ингибирующей концентрации на основе биопленки

Анализ минимальной ингибирующей концентрации (MIC) определяет самую низкую концентрацию противомикробного агента, необходимую для подавления видимого роста микроорганизмов. Этот протокол разработан для микроорганизмов, ассоциированных с биопленкой, UIP400MTP с использованием многолуночного ультразвукового аппарата для разрушения биопленки.

Шаг 1: Приготовление бактериального посева

1. Приготовьте бактериальную суспензию:
   Выращивайте бактерии в соответствующих средах до среднелогарифмической фазы.
   Разбавьте культуру для достижения стандартизированной клеточной плотности (например, 0,5 по стандарту Макфарланда или OD600 ~0,1).
2. Приготовьте противомикробные растворы:
   Разбавьте противомикробный агент в подходящей среде для получения диапазона концентраций (например, двукратное серийное разведение).
3. Выдавите в планшет 96well:
   Добавьте антимикробные растворы в лунки стандартного 96-луночного планшета, с конечным объемом лунки ~150–200 μл.
   Включите контроль роста (без противомикробных препаратов) и контроль стерильности (без бактериального инокулята).

Шаг 2: Образование биопленки на колышковой крышке

• Прикрепите колышковую крышку:
  Поместите специальную крышку с колышком на инокулированные лунки, убедившись, что колышки полностью погружены в бактериальную суспензию.
• Инкубируйте тарелку:
  Инкубируйте при соответствующей температуре (например, 37°C) в течение определенного времени (например, 24 часа) в статических условиях, чтобы обеспечить образование биопленки на колышках.

Шаг 3: Воздействие противомикробных препаратов

• Промойте колышки:
  Снимите колышек крышки с бактериальной суспензии и аккуратно промойте в стерильном физрастворе или PBS для удаления слабо прикрепленных планктонных клеток.
• Подвергайте воздействию противомикробных препаратов:
  Переложите колышковую крышку в новую пластину 96well с противомикробными разведениями, приготовленными ранее.
  Инкубируйте в течение определенного периода времени (например, 24 часа) в статических условиях, чтобы позволить противомикробному агенту воздействовать на биопленки.

Шаг 4: Ультразвуковая обработка с помощью ультразвукового аппарата Microplate UIP400MTP

Этап ультразвуковой обработки имеет решающее значение для отделения биопленок от колышковых крышек для оценки жизнеспособности. Выполните следующие действия для UIP400MTP ультразвукового аппарата:

1. Подготовьте установку:
   Заполните свежую 96-луночную пластину восстановительной средой (например, нейтрализующим бульоном или стерильной средой для роста) в каждой лунке.
2. Переложите колышек крышкой:
   Снимите колышковую крышку с пластины для антимикробной обработки.
   Промойте крышку колышка в стерильном физрастворе или PBS для удаления остатков противомикробных агентов.
3. Расположите пластину в ультразвуковом аппарате:
   Прикрепите колышковую крышку к пластине для восстановительной среды.
   Поместите пластину для восстановительной среды в ультразвуковой аппарат UIP400MTP, убедившись, что пластина сидит по центру и устойчиво, как в описанном руководстве.
4. Настройте параметры ультразвука:
   Установите параметры ультразвука на UIP400MTP (настройки могут быть подстроены под биопленку):
   Амплитуда: 70–100%.
   Время ультразвуковой обработки: 1–3 минуты (регулируется в зависимости от структуры биопленки) в режиме цикла.
5. Ультразвуковая обработка:
   Запустите процесс обработки ультразвуком. Ультразвуковые волны разрушают матрицу биопленки и вытесняют клетки в восстановительную среду.
6. Контролируйте процесс:
   Используйте вставной датчик температуры для контроля температуры проб в лунках. UIP400MTP можно подключить к лабораторному охладителю для охлаждения.
7. Работа с постультразвуковой обработкой:
   Немедленно переложите восстановительную среду, содержащую отделившиеся биопленки, в свежую стерильную тарелку для последующего анализа.

(A) Планшет, содержащий TSB с 2% глюкозой, используемый для образования биопленки, восстановления клеток и определения MIC и MBEC; (Б) Крышка со штифтами для образования стафилококковых биопленок.
Образующиеся на штифтах биопленочные клетки вытесняли с помощью ультразвуковой обработки (ультразвуковая технология Hielscher) в течение 5 мин в 96-луночных планшетах, содержащих свежую питательную среду для восстановления клеток.
(Фото и исследование: ©де Оливейра и др., 2016)

Шаг 4: Оценка жизнеспособности

Планшетные и культуральные обособленные биопленки:

1. Выполняйте серийное разведение восстановительной среды и планшета на агаре для подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ).
2. Оцените MIC:
   Определите МПК как самую низкую концентрацию противомикробных препаратов, которая полностью подавляет видимый рост микроорганизмов в восстановительной среде.

Минимальная ингибиторная концентрация MIC: пример микротитровального планшета и интерпретация результатов микроразведения.
(Исследование и изображение: ©Jaskiewicz et al. 2019)

Проектирование, производство и консалтинг – Качество «Сделано в Германии»

Ультразвуковые аппараты Hielscher хорошо известны своими высочайшими стандартами качества и дизайна. Надежность и простота в эксплуатации позволяют без проблем интегрировать наши ультразвуковые аппараты в промышленные объекты. Гидроакустические аппараты Hielscher легко справляются с суровыми условиями и требовательными условиями окружающей среды.

Hielscher Ultrasonics является компанией, сертифицированной по стандарту ISO, и уделяет особое внимание высокопроизводительным ультразвуковым аппаратам, отличающимся самыми современными технологиями и удобством в использовании. Конечно, ультразвуковые аппараты Hielscher соответствуют требованиям CE и соответствуют требованиям UL, CSA и RoHs.

О том, как используется UIP400MTP для отсоединения биопленки в протоколе ASTM E2799, читайте здесь. – Тестирование эффективности дезинфицирующего средства против биопленки Pseudomonas aeruginosa с использованием анализа MBEC.