Протокол определения минимальной ингибирующей концентрации (MIC)

Определение минимальной ингибирующей концентрации (MIC) для биоплёнок – важнейший метод оценки эффективности антимикробных средств против микроорганизмов, ассоциированных с биоплёнками и проявляющих повышенную устойчивость благодаря защитному внеклеточному матриксу. Ключевой этап этого анализа – отделение структур биоплёнки для высвобождения заключённых в ней клеток и точной оценки их жизнеспособности. Ультразвуковой аппарат UIP400MTP для многолуночных планшетов облегчает этот процесс: сфокусированный ультразвук создаёт контролируемую кавитацию, эффективно отделяющую клетки биоплёнки и диспергирующую их в однородную суспензию. Такое точное и воспроизводимое разрушение биоплёнки повышает надёжность и производительность анализов MIC, делая UIP400MTP незаменимым инструментом для развития исследований биоплёнок.

Зачем использовать обработку ультразвуком при определении MIC?

• Точные, воспроизводимые данные: Получайте однородные клеточные суспензии, исключающие защитное действие матрикса, чтобы результаты подсчёта колоний и измерения оптической плотности действительно отражали эффективность антимикробного средства.
• Высокая производительность: Обрабатывайте весь 96-луночный планшет одновременно всего за 1–3 минуты, заменяя медленное ручное соскабливание с непостоянными результатами упорядоченным рабочим процессом.
• Сохранение жизнеспособности клеток: Бережно отделяйте заключённые в биоплёнке клетки без физических повреждений, вызываемых соскабливанием, сохраняя более высокую выживаемость для надёжных расчётов MIC/MBEC.
• Нулевой риск перекрёстного загрязнения: Используйте преимущества бесконтактной конструкции с чашечным сонотродом, которая обеспечивает равномерную обработку всех лунок без соприкосновения зондов с отдельными образцами или лунками.
• Соответствие требованиям стандартов: Приведите свою методику в соответствие с валидированными отраслевыми протоколами, такими как ASTM E2799-22, чтобы повысить достоверность данных для регуляторных целей или публикации.
• Уверенный скрининг препаратов и методов лечения: Опирайтесь на достоверные результаты определения чувствительности, чтобы принимать более обоснованные решения об эффективности антимикробных средств, профилировании устойчивости или разработке методов лечения.

Обработка ультразвуком для отделения биоплёнок

При определении MIC для биоплёнок обычно измеряют жизнеспособность бактерий или ингибирование роста с помощью таких методов, как посев, подсчёт колоний или измерение оптической плотности. Обработка ультразвуком – ключевой этап определения MIC для биоплёнок при оценке чувствительности ассоциированных с биоплёнками микроорганизмов к антимикробным средствам. Её основная задача – отделить клетки, заключённые в матриксе биоплёнки, и диспергировать их в однородную суспензию для точного анализа.
Биоплёнки значительно более устойчивы к антимикробным средствам, чем планктонные клетки, поэтому правильное отделение биоплёнок имеет решающее значение для точности анализа. В ходе этого процесса ультразвуковые волны создают контролируемую кавитацию, разрушая матрикс биоплёнки и высвобождая заключённые в нём клетки в однородную суспензию в среде для восстановления клеток. Этот этап позволяет точно оценивать жизнеспособность клеток, диспергированных из биоплёнки, с помощью таких методов, как посев, разведение и подсчёт колоний. Правильное разрушение биоплёнки посредством обработки ультразвуком предотвращает защитное действие остаточных компонентов матрикса на клетки, которое иначе могло бы привести к недооценке антимикробной активности. Ультразвуковой аппарат UIP400MTP для многолуночных планшетов особенно хорошо подходит для этой цели, обеспечивая точные и воспроизводимые условия обработки ультразвуком для надёжной и высокопроизводительной подготовки планшетов для анализа.

Почему обработка ультразвуком необходима при определении минимальной ингибирующей концентрации для биоплёнок

Для измерения жизнеспособности и подсчёта клеток необходимо полное и надёжное отделение и диспергирование отдельных клеток. UIP400MTP обеспечивает равномерное отделение биоплёнок и диспергирование клеток без повреждения для получения надёжных результатов анализа.

• Сложность биоплёнок: Биоплёнки представляют собой структурированные микробные сообщества, заключённые в матрикс из внеклеточного полимерного вещества (EPS), который защищает микроорганизмы и повышает их устойчивость к антимикробным средствам.
• Равномерное диспергирование: Чтобы точно измерить жизнеспособность клеток, заключённых в биоплёнке, или их чувствительность к антимикробным средствам, биоплёнку необходимо сначала отделить и разрушить до получения однородной суспензии.

Протокол определения минимальной ингибирующей концентрации для биоплёнок

Анализ минимальной ингибирующей концентрации (MIC) определяет наименьшую концентрацию антимикробного средства, необходимую для подавления видимого роста микроорганизмов. Этот протокол разработан для микроорганизмов, ассоциированных с биоплёнками, и предусматривает использование ультразвукового аппарата UIP400MTP для многолуночных планшетов для разрушения биоплёнок.

Этап 1: Подготовка бактериального инокулята

1. Подготовьте бактериальную суспензию:
   Выращивайте бактерии в подходящих средах до середины логарифмической фазы.
   Разведите культуру до стандартизованной плотности клеток (например, стандарт 0,5 МакФарланда или OD600 ~0,1).
2. Подготовьте растворы антимикробного средства:
   Разведите антимикробное средство в подходящей среде, чтобы получить ряд концентраций (например, путём последовательных двукратных разведений).
3. Внесите растворы в 96-луночный планшет:
   Внесите растворы антимикробного средства в лунки стандартного 96-луночного планшета так, чтобы конечный объём в каждой лунке составлял ~150–200 µL.
   Предусмотрите контроль роста (без антимикробного средства) и контроль стерильности (без бактериального инокулята).

Этап 2: Формирование биоплёнки на крышке со штифтами

• Установите крышку со штифтами:
  Установите специальную крышку со штифтами на лунки с инокулятом, убедившись, что штифты полностью погружены в бактериальную суспензию.
• Инкубируйте планшет:
  Инкубируйте при подходящей температуре (например, 37°C) в течение заданного времени (например, 24 часа) в статических условиях, чтобы обеспечить формирование биоплёнки на штифтах.

Этап 3: Воздействие антимикробного средства

• Промойте штифты:
  Извлеките крышку со штифтами из бактериальной суспензии и осторожно промойте в стерильном физиологическом растворе или PBS, чтобы удалить слабо прикреплённые планктонные клетки.
• Проведите обработку антимикробными средствами:
  Перенесите крышку со штифтами в новый 96-луночный планшет, содержащий ранее подготовленные разведения антимикробного средства.
  Инкубируйте в течение заданного времени (например, 24 часа) в статических условиях, чтобы антимикробное средство могло воздействовать на биоплёнки.

Этап 4: Обработка ультразвуком с помощью аппарата UIP400MTP для микропланшетов

Этап обработки ультразвуком имеет решающее значение для отделения биоплёнок от крышек со штифтами с целью оценки жизнеспособности. При использовании ультразвукового аппарата UIP400MTP выполните следующие действия:

1. Подготовьте систему:
   Заполните каждую лунку нового 96-луночного планшета средой для восстановления клеток (например, нейтрализующим бульоном или стерильной питательной средой).
2. Перенесите крышку со штифтами:
   Снимите крышку со штифтами с планшета для обработки антимикробным средством.
   Промойте крышку со штифтами в стерильном физиологическом растворе или PBS, чтобы удалить остатки антимикробных средств.
3. Разместите планшет в ультразвуковом аппарате:
   Установите крышку со штифтами на планшет со средой для восстановления клеток.
   Поместите планшет со средой для восстановления клеток в ультразвуковой аппарат UIP400MTP, убедившись, что планшет расположен по центру и устойчиво, как описано в руководстве.
4. Настройте параметры обработки ультразвуком:
   Задайте параметры обработки ультразвуком на UIP400MTP (настройки могут быть скорректированы с учётом биоплёнки):
   Амплитуда: 70–100%.
   Время обработки ультразвуком: 1–3 минуты (скорректируйте с учётом структуры биоплёнки) в циклическом режиме.
5. Обработайте ультразвуком:
   Запустите обработку ультразвуком. Ультразвуковые волны разрушат матрикс биоплёнки и высвободят клетки в среду для восстановления.
6. Контролируйте процесс:
   Используйте подключаемый датчик температуры для контроля температуры образцов в лунках. Для охлаждения UIP400MTP можно подключить к лабораторному чиллеру.
7. Действия после обработки ультразвуком:
   Немедленно перенесите среду для восстановления клеток, содержащую отделённые биоплёнки, в новый стерильный планшет для последующего анализа.

(A) Планшет, содержащий TSB с 2% глюкозы, используемый для формирования биоплёнок, восстановления клеток и определения MIC и MBEC; (B) Крышка со штифтами для формирования стафилококковых биоплёнок.
Клетки биоплёнки, сформировавшейся на штифтах, отделяли обработкой ультразвуком (Hielscher Ultrasound Technology) в течение 5 min в 96-луночных планшетах, содержащих свежую культуральную среду для восстановления клеток.
(Изображение и исследование: ©de Oliveira et al., 2016)

Этап 4: Оценка жизнеспособности

Выполните посев и культивирование отделённых биоплёнок:

1. Выполните последовательные разведения среды для восстановления клеток и посев на агар для подсчёта колониеобразующих единиц (CFU).
2. Оцените MIC:
   Определите MIC как наименьшую концентрацию антимикробного средства, которая полностью подавляет видимый рост микроорганизмов в среде для восстановления клеток.

MIC – минимальная ингибирующая концентрация: пример микротитрационного планшета и интерпретация результатов микроразведений.
(Исследование и изображение: ©Jaskiewicz et al. 2019)

Кому полезна обработка ультразвуком при определении MIC?

• Производителям медицинских изделий: Для проверки эффективности поверхностных покрытий и валидации протоколов очистки изделий, склонных к образованию биоплёнок.
• Клиническим микробиологам: Для точной диагностики инфекций, связанных с имплантатами (например, PJI), путём извлечения бактерий с медицинских конструкций.
• Разработчикам фармацевтических препаратов: Для оценки эффективности новых антимикробных средств против устойчивых патогенов, заключённых в биоплёнках.
• Научным исследователям: Для проведения высокопроизводительных, воспроизводимых исследований биологии биоплёнок и механизмов устойчивости к антимикробным средствам.
• Промышленным подразделениям контроля качества: Для оценки биообрастания и эффективности дезинфицирующих средств в промышленных условиях (например, с использованием стандартов ASTM E2799-22).

Проектирование, производство и консультирование – качество из Германии

Ультразвуковые аппараты Hielscher известны своими высочайшими стандартами качества и проектирования. Прочность и простота эксплуатации позволяют без затруднений интегрировать наши ультразвуковые аппараты в промышленные предприятия. Ультразвуковые аппараты Hielscher легко справляются с суровыми условиями и сложными эксплуатационными средами.

Hielscher Ultrasonics – компания, сертифицированная по ISO, которая уделяет особое внимание высокопроизводительным ультразвуковым аппаратам, сочетающим самые современные технологии с удобством использования. Разумеется, ультразвуковые аппараты Hielscher соответствуют требованиям CE и удовлетворяют требованиям UL, CSA и RoHs.

Прочитайте здесь, как UIP400MTP используется для отделения биоплёнок в протоколе ASTM E2799 – проверка эффективности дезинфицирующих средств против биоплёнки Pseudomonas aeruginosa с помощью анализа MBEC.