Высокопроизводительная подготовка образцов FFPE: экстракция белка и сдвиг нуклеиновых кислот
С помощью высокопроизводительного ультразвукового UIP400MTP компания Hielscher Ultrasonics решает проблемы фиксации формалина и подготовки тканей с парафином (FFPE). Узнайте, как ультразвук обрабатывает образцы FFPE в больших количествах для депарафинизации FFPE, лизиса тканей, гомогенизации, экстракции белка и сдвига ДНК/РНК! Воспользуйтесь преимуществами ультразвуковой подготовки тканей методом FFPE – Обработка большого количества образцов в многолуночных планшетах! Получите высококачественные образцы и получите большое количество образцов для получения надежных результатов исследований! И последнее, но не менее важное: экономия времени и денег!
Подготовка образцов FFPE благодаря высокопроизводительной ультразвуковой обработке
Фиксация формалином и заделка парафина (FFPE) является наиболее распространенным методом сохранения и архивирования твердых тканей. Экстракция биомолекул из образцов тканей FFPE часто сопряжена со значительными трудностями из-за качества хранимых образцов. Эти образцы, которые являются бесценным активом в молекулярной биологии и клинических исследованиях, являются богатым источником биологической информации для ретроспективных исследований и проверки диагностических биомаркеров. Однако процесс фиксации формалина и встраивания парафина, сохраняя архитектуру и морфологию тканей, затрудняет экстракцию высококачественных нуклеиновых кислот и белков. Формалин индуцирует сшивку нуклеиновых кислот и белков, что приводит к молекулярной фрагментации и химическим модификациям. Узнайте, как высокопроизводительный ультразвуковой UIP400MTP преодолевает трудности, связанные с пробоподготовкой методом FFPE!
Ультразвуковой аппарат для эффективной пробоподготовки FFPE
- Простой в использовании рабочий процесс: упрощенные процессы, удобные для пользователя.
- Депарафинизация, экстракция белка, сдвиг ДНК/РНК
- Быстрая высокопроизводительная обработка: эффективная работа с многолуночными планшетами.
- Эффективная депарафинизация: улучшенная солюбилизация белков.
- Нетоксичные растворители: Позволяет избежать использования вредных органических растворителей, таких как ксилол.
UIP400MTP высокопроизводительный ультразвуковой аппарат для высокопроизводительной обработки образцов FFPE в многолуночных планшетах
Достижения в методах экстракции белка из ткани FFPE
Ультразвуковая технология Hielscher решает проблемы, связанные с высокопроизводительной пробоподготовкой методом FFPE. Ультразвуковая обработка использует ультразвуковые волны для создания механических колебаний и сфокусированной кавитации, эффективно разрушая клеточные структуры и улучшая солюбилизацию биомолекул. Этот метод завоевал популярность благодаря своей способности повышать эффективность и выход нуклеиновых кислот и белков из тканей FFPE, а также сдвигать ДНК и РНК для подготовки библиотек. Очень важно подчеркнуть, что ультразвуковое исследование с использованием ультразвукового аппарата UIP400MTP multiwell plate обеспечивает целостность этих биомолекул для последующих применений.
Сдвиг нуклеиновых кислот с помощью высокопроизводительной ультразвука
Многолуночный ультразвуковой UIP400MTP для использования в условиях высокой пропускной способности выводит подготовку проб FFPE на новый уровень. Этот метод ультразвуковой обработки с несколькими лунками обеспечивает эффективное и надежное решение для одновременной обработки нескольких образцов. Он способствует быстрой и воспроизводимой экстракции ДНК, РНК и белков, которые имеют решающее значение для различных аналитических методов, включая секвенирование нового поколения (NGS), количественную ПЦР и протеомный анализ. Оптимизация параметров ультразвуковой обработки, таких как амплитуда, продолжительность и температура, еще больше повышает качество и количество экстрагируемых биомолекул.
Ультразвуковой аппарат UIP400MTP для многолуночных планшетов обладает значительными преимуществами для фрагментации и среза ДНК и РНК из ткани FFPE. Одной из отличительных особенностей этой системы является ее способность достигать узких размеров фрагментов ДНК и РНК, обеспечивая точную перестройку интенсивности ультразвука для получения коротких фрагментов из 150-200 пар оснований (.н.) или более длинных фрагментов из 15-20 килопар оснований (.н.). Такая универсальность делает UIP400MTP незаменимым как для короткого, так и для длинного секвенирования, обеспечивая высококачественные результаты для секвенирования нового поколения (NGS) и полногеномного секвенирования (WGS). Его точный контроль над размером фрагмента имеет решающее значение для исследователей во всех областях геномики, так как позволяет подготавливать образцы в соответствии со спецификациями.
Свяжитесь с нами для получения передовых решений в области FFPE tissue
Откройте для себя многолуночный ультразвуковой аппарат UIP400MTP для эффективного восстановления биомолекул из образцов FFPE, поддержания целостности экстрагированных нуклеиновых кислот и белков и обеспечения воспроизводимости результатов. Эта технология легко интегрируется с другими препаративными и аналитическими рабочими процессами, оптимизируя и улучшая молекулярные исследования с использованием тканевых архивов FFPE.
Фиксаторы и их эффекты
Фиксация является важным этапом подготовки образца, который сохраняет клеточные структуры, останавливает биохимические реакции и предотвращает деградацию. В зависимости от конкретных экспериментальных требований используются различные фиксаторы. Двумя наиболее распространенными фиксаторами являются формальдегид и параформальдегид, которые сшивают белки и нуклеиновые кислоты, сохраняя морфологию и антигенность клеток и тканей. Другие фиксаторы, такие как этанол, метанол и глутаральдегид, используются для конкретных применений.
Фиксаторы формальдегида и параформальдегида образуют метиленовые мостики между аминогруппами, что приводит к сшивке белков. Этот процесс эффективно иммобилизует клеточные компоненты, сохраняя их целостность на последующих этапах анализа. На эффекты этих фиксаторов могут влиять такие факторы, как концентрация, pH и температура, и оптимизация этих параметров имеет решающее значение для обеспечения оптимального сохранения клеточных структур.
Преимущества ультразвукового препарата FFPE
Ультразвуковое исследование является мощным методом разрушения фиксированных клеток и тканей, который превосходит традиционные методы. Он имеет несколько заметных преимуществ по сравнению с традиционными методами лизиса:
- Скорость и эффективность: Ультразвуковой лизис обеспечивает быстрое разрушение клеток и тканей, значительно сокращая время обработки по сравнению с механическими или химическими методами лизиса. Высокочастотные звуковые волны, генерируемые ультразвуковым зондом, создают механические сдвиговые силы, вызывающие разрушение зафиксированных ячеистых структур. Этот быстрый и эффективный сбой позволяет исследователям обрабатывать большие объемы образцов за короткое время.
- Щадящий и регулируемый: Ультразвуковой лизис обеспечивает мягкий механизм разрушения, который сводит к минимуму повреждение чувствительных биомолекул, таких как белки, нуклеиновые кислоты и ферменты. В отличие от механических методов, которые генерируют чрезмерное тепло или сдвиговые силы, ультразвуковой лизис использует контролируемую кавитацию для разрушения клеток, сохраняя при этом целостность и функциональность внутриклеточных компонентов.
- Многосторонность: Ультразвуковой лизис может применяться к различным фиксаторам, что позволяет исследователям работать с широким спектром фиксированных образцов. Независимо от того, используется ли формальдегид, параформальдегид или альтернативные фиксаторы, ультразвуковой лизис неизменно обеспечивает эффективное разрушение, обеспечивая оптимальное восстановление клеточных компонентов.
- Высокая урожайность и качество: Ультразвуковой лизис способствует получению высоких выходов интактных клеточных компонентов благодаря своей способности равномерно разрушать зафиксированные клетки и ткани. Это позволяет выполнять такие последующие приложения, как анализ белков, экстракция нуклеиновых кислот и ферментативные анализы, для получения надежных и воспроизводимых результатов.
- Совместимость с автоматизацией: Ультразвуковой лизис может быть легко интегрирован в автоматизированные системы, что обеспечивает высокую производительность обработки образцов. Такая совместимость позволяет исследователям оптимизировать рабочий процесс и повысить производительность, особенно в крупномасштабных исследованиях.
96-луночный планшетный ультразвуковой аппарат UIP400MTP для ультразвуковой обработки микротитровых и многолуночных планшетов
Ультразвуковой лизис произвел революцию в разрушении фиксированных клеток и тканей, предложив множество преимуществ по сравнению с традиционными методами лизиса. Его скорость, эффективность, селективность, универсальность, высокая производительность и совместимость с автоматизацией делают его незаменимым инструментом в молекулярной биологии и биотехнологических исследованиях. Предлагая бесконтактные ультразвуковые аппараты, а также ультразвуковые ультразвуковые аппараты зондового типа, Hielscher Ultrasonics предлагает наиболее подходящий ультразвуковой гомогенизатор для вашего применения в медико-биологической отрасли. Независимо от того, хотите ли вы обрабатывать одиночные образцы, несколько образцов или очень большое количество образцов одновременно, мы предложим вам лучший ультразвуковой аппарат, соответствующий вашим требованиям к исследованиям и диагностике.
Узнайте больше о бесконтактных ультразвуковых аппаратах Hielscher для многовыборочной и высокопроизводительной пробоподготовки!
- Единовременная инвестиция
- Используйте собственные расходные материалы
- Отсутствие периодических расходов на фирменные аксессуары и расходные материалы
- Высокая пропускная способность
- Прецизионное управление
- Современные технологии
- надёжность & робастность
- Регулируемое, точное управление процессом
- Промышленный класс: может непрерывно работать 24/7
- Простота и безопасность в эксплуатации
- Низкие эксплуатационные расходы
Узнайте больше о применении ультразвуковых аппаратов в медико-биологических науках!
Планшетный ультразвуковой аппарат UIP400MTP для любых 96-луночных планшетов, микротитровых планшетов и многолуночных планшетов.
Проектирование, производство и консалтинг – Качество «Сделано в Германии»
Ультразвуковые аппараты Hielscher хорошо известны своими высочайшими стандартами качества и дизайна. Надежность и простота в эксплуатации позволяют без проблем интегрировать наши ультразвуковые аппараты в промышленные объекты. Ультразвуковые аппараты Hielscher легко справляются с суровыми условиями и требовательными условиями окружающей среды.
Hielscher Ultrasonics является компанией, сертифицированной по стандарту ISO, и уделяет особое внимание высокопроизводительным ультразвуковым аппаратам, отличающимся самыми современными технологиями и удобством в использовании. Конечно, ультразвуковые аппараты Hielscher соответствуют требованиям CE и соответствуют требованиям UL, CSA и RoHs.
Свяжитесь с нами! / Спросите нас!
UIP400MTP Ультразвуковой аппарат: Высокопроизводительная подготовка образцов FFPE в многолуночном планшете
Вопросы и ответы
Ниже мы отвечаем на часто задаваемые вопросы, которые имеют отношение к препарированию тканей FFPE и ультразвуковому исследованию образцов FFPE.
Как подготавливается ткань FFPE?
Этапы подготовки тканей FFPE: Тщательное обращение и обработка свежей ткани имеют решающее значение для получения высококачественных образцов FFPE. Обеспечение сохранности клеточной архитектуры, нуклеиновых кислот и белков имеет важное значение для точного последующего анализа. Каждый этап — от сбора до встраивания — требует точности для поддержания целостности образца для различных анализов, включая гистологическое исследование, иммуногистохимию и молекулярные исследования. Правильно выполненный процесс фиксации и встраивания гарантирует, что сохраненная ткань точно отражает состояние in vivo, что позволяет получить надежные результаты диагностики и исследований.
Мы проведем вас через 6 основных этапов процесса встраивания образцов тканей FFPE.
- Сбор салфеток
Биопсия живых млекопитающих и тканевые культуры являются жизнеспособными источниками для получения свежей ткани для подготовки образцов FFPE.
Важно использовать асептический метод: используйте стерильные инструменты и перчатки, чтобы избежать загрязнения. В идеале собирайте ткани в стерильной среде, например, в хирургическом кабинете или капюшоне с ламинарным потоком.
Поскольку образец очень хрупкий, его бережное обращение имеет важное значение: сведите к минимуму задержки в обработке и немедленно начните последующую обработку тканей после иссечения. Это имеет решающее значение для предотвращения автолиза и деградации. Держите салфетку при комнатной температуре; Избегайте замерзания, так как это может привести к образованию кристаллов льда и повреждению тканей. - Фиксация тканей
Сначала ткань обрабатывают фиксирующим раствором: используют 10% нейтрально буферизованный формалин (NBF), который эквивалентен 4% формальдегиду в воде, буферизованном до нейтрального pH.
Полностью погрузите ткань в формалин. Обеспечьте соотношение фиксаторов к объему тканей не менее 10:1. Время фиксации обычно составляет от 6 до 24 часов, в зависимости от типа и размера ткани. Важно, чтобы фиксатор мог проникать в ткани основательно. Тем не менее, чрезмерная фиксация может привести к сшивке, что затрудняет извлечение антигена, в то время как недостаточная фиксация может привести к плохой сохранности тканей. - Обрезка тканей
Во-вторых, обрежьте ткань до толщины около 3-5 мм, чтобы обеспечить адекватное проникновение фиксатора. Обеспечьте правильную ориентацию ткани для захвата соответствующих гистологических структур. Это облегчает процесс извлечения, когда ткань позже используется для анализа. - Обработка зафиксированного образца
Теперь неподвижная ткань должна быть обезвожена: после фиксации ткань должна быть обезвожена, чтобы обеспечить тщательное проникновение парафина. Пропустите ткань через градуированный ряд этанола (70%, 80%, 90% и 100%), чтобы удалить воду.
Очищение ксилолом: Парафин нерастворим в воде, но растворим в ксилоле. Поэтому воду в тканях необходимо заменить на ксилол. Однако ксилол сам по себе нерастворим в воде, но растворим в спирте, что требует промежуточного этапа, на котором вода сначала заменяется спиртом. Погрузите ткань в ксилол или заменитель ксилола, чтобы удалить этанол и подготовить ткань к инфильтрации парафина.
Инфильтрация с помощью парафина: Погрузите ткань в расплавленный парафин, обеспечив полную инфильтрацию. Этот этап обычно включает в себя несколько смен парафина для обеспечения тщательной пропитки. - Встраивание ткани
На этом этапе ткань формуется в тканевый блок: поместите ткань в форму с желаемой ориентацией и полейте ее расплавленным парафином. Дайте парафину застыть, охладив при комнатной температуре или на холодной пластине. - Секционирование и монтаж
Микротомия: Чтобы разрезать встроенную ткань, используйте микротом, чтобы вырезать тонкие срезы (обычно 4-5 микрометров) из парафинового блока. Затем образец монтируют, размещая срезы на предметных стеклах для последующего окрашивания и микроскопического анализа.
Наконец, проверьте качество гистологии: оцените первые срезы под микроскопом, чтобы убедиться в правильной фиксации и обработке. Корректируйте протоколы по мере необходимости в зависимости от типа ткани и наблюдаемого качества.
Ткани FFPE могут быть использованы для восстановления РНК, ДНК и белков, а также для обнаружения признаков рака или других заболеваний. Они могут храниться в течение многих лет и являются неотъемлемой частью того, как исследователи и врачи используют образцы тканей для диагностики и исследований.
Каковы распространенные проблемы и трудности с тканями FFPE?
Фиксированные формалином и залитые парафином (FFPE) образцы тканей широко используются в исследованиях и диагностике, но они сопряжены с рядом трудностей и общих проблем:
- Деградация биомолекул: Длительная фиксация может привести к деградации ДНК, РНК и белков, что затрудняет извлечение высококачественных нуклеиновых кислот или белков для последующего применения. Правильная фиксация (избегание недостаточной и чрезмерной фиксации) имеет важное значение для сохранения тканей.
- Маскировка антигенов: Процесс фиксации может маскировать антигенные сайты, снижая эффективность связывания антител в иммуногистохимии и других иммунологических анализах. Для этого часто требуется забор антигена, процедура, посредством которой маскировка эпитопа обращается вспять и восстанавливается связывание эпитопа-антитела. Однако полная антигенность не всегда может быть восстановлена.
- Переменное качество фиксации: Различия во времени и условиях фиксации могут привести к нестабильному качеству образца, что влияет на воспроизводимость и сопоставимость результатов. Используйте надежные протоколы фиксации и избегайте недостаточной и избыточной фиксации.
- Повреждение и фрагментация ДНК: Фиксация формалином образцов FFPE может вызывать различные типы повреждений ДНК, включая дезаминирование цитозина (мутации C-T), окислительные повреждения (например, 8-оксо-гуанин, приводящий к мутациям G-T), а также физические нарушения, такие как зазубрины, разрывы и аосновные участки, которые препятствуют активности ДНК-полимеразы. Процесс фиксации формалина может привести к фрагментации ДНК, что затрудняет генетический и геномный анализ, такой как ПЦР и секвенирование.
- Качество РНК: РНК, извлеченная из тканей FFPE, часто фрагментируется и химически модифицируется, что затрудняет проведение высококачественных транскриптомных анализов.
- Модификации белка: Формалин может вызывать химические модификации в белках, влияя на их структуру и функцию, что может мешать протеомному анализу.
- Артефакты обработки образцов: В процессе встраивания и секционирования механическое воздействие и тепло могут привести к появлению артефактов и вызвать дальнейшее повреждение ткани.
- Вариативность от партии к партии: Различия в протоколах фиксации и встраивания между различными партиями могут привести к значительной вариабельности результатов, что усложняет сравнение между исследованиями.
- Проблемы с хранением: Длительное хранение блоков FFPE может привести к дополнительной деградации и потере целостности нуклеиновых кислот с течением времени, что влияет на жизнеспособность архивных образцов для ретроспективных исследований.
Сшивка: Фиксация формалина вызывает сшивку белков и нуклеиновых кислот, что может затруднить молекулярный анализ и повлиять на точность иммуногистохимии и других анализов.
Использование оптимизированных протоколов, тщательная обработка образцов и применение передовых методов помогают повысить качество и надежность данных, полученных из тканей FFPE.
В чем разница между FFPE и замороженной тканью?
Ткань FFPE (фиксированный формалином, заложенный парафином) консервируется с помощью формалина для фиксации ткани, а затем погружается в парафин, что позволяет хранить ее при комнатной температуре при сохранении морфологии ткани. Напротив, замороженные ткани быстро сохраняются при замораживании, которое лучше сохраняет целостность нуклеиновых кислот и белков, но требует хранения при очень низких температурах.
Какие химикаты используются для встраивания FFPE?
Химические вещества, используемые для встраивания FFPE, обычно включают формалин для фиксации и парафин для встраивания. Для встраивания FFPE ткани обычно фиксируют с использованием либо 10% (v/v) нейтрального буферизованного формалина (FA), либо свежеприготовленного 4% (w/v) раствора формальдегида (PFA), изготовленного из порошка параформальдегида. Формалин, который представляет собой раствор формальдегида в воде, буферизуется до нейтрального pH для сохранения морфологии тканей и предотвращения чрезмерного сшивания. Раствор на основе параформальдегида также обеспечивает эффективную фиксацию путем сшивания белков, тем самым стабилизируя структуру ткани для последующего встраивания в парафин. Эти химические вещества необходимы для поддержания целостности и морфологии тканей в процессе фиксации и внедрения.
Как удаляется парафин из образцов FFPE?
Для удаления парафина из образцов FFPE срезы тканей обычно подвергают серии промывок ксилолом с последующей регидратацией с помощью градуированной серии спиртов и, наконец, воды. Поскольку ксилол очень токсичен и представляет опасность для здоровья, такую как проблемы с дыханием, раздражение кожи и потенциальные долгосрочные последствия при повторном воздействии, ультразвуковое удаление парафинов становится многообещающей альтернативой во многих лабораториях. Этот метод использует интенсивные ультразвуковые волны для эффективного и безопасного удаления парафина без необходимости использования токсичных растворителей, таких как ксилол, тем самым снижая риск для персонала лаборатории и создавая более безопасную рабочую среду.
Как долго я должен фиксировать ткани для хорошего качества образца FFPE?
Общие рекомендации по продолжительности фиксации обычно предполагают фиксацию образцов тканей в формалине в течение 24-48 часов. Эта продолжительность, как правило, достаточна для сохранения морфологии тканей и клеточных структур при минимизации чрезмерной фиксации, которая может привести к чрезмерному сшиванию и деградации нуклеиновых кислот и белков. Тем не менее, оптимальное время фиксации может варьироваться в зависимости от размера и типа ткани, при этом меньшие или более деликатные образцы требуют более короткого времени фиксации. Крайне важно сбалансировать адекватную фиксацию, чтобы предотвратить аутолиз тканей и деградацию, избегая при этом длительной фиксации, которая может усложнить последующий молекулярный анализ.