Высокопроизводительная подготовка образцов FFPE: экстракция белков и сдвиговая фрагментация нуклеиновых кислот
С помощью высокопроизводительного ультразвукового аппарата UIP400MTP компания Hielscher Ultrasonics решает задачи подготовки тканей, фиксированных формалином и залитых в парафин (FFPE). Узнайте, как обработка ультразвуком позволяет обрабатывать большое количество образцов FFPE для депарафинизации, лизиса тканей, гомогенизации, экстракции белков и сдвиговой фрагментации ДНК/РНК! Воспользуйтесь преимуществами ультразвуковой подготовки тканей FFPE – обработки большого количества образцов в многолуночных планшетах! Получайте высококачественные образцы в большом количестве для достоверных результатов исследований! И наконец, что немаловажно, экономьте время и деньги!
Упрощение подготовки образцов FFPE с помощью высокопроизводительной обработки ультразвуком
Фиксация формалином и заливка в парафин (FFPE) – наиболее распространённый метод сохранения и архивного хранения плотных тканей. Экстракция биомолекул из образцов тканей FFPE часто сопряжена со значительными трудностями из-за качества хранящихся образцов. Эти образцы, представляющие неоценимую ценность для молекулярной биологии и клинических исследований, служат богатым источником биологической информации для ретроспективных исследований и валидации диагностических биомаркеров. Однако процесс фиксации формалином и заливки в парафин, сохраняя архитектуру и морфологию тканей, затрудняет экстракцию высококачественных нуклеиновых кислот и белков. Формалин вызывает образование поперечных сшивок нуклеиновых кислот и белков, что приводит к молекулярной фрагментации и химическим модификациям. Узнайте, как высокопроизводительный ультразвуковой аппарат UIP400MTP преодолевает трудности подготовки образцов FFPE!
Ультразвуковой аппарат для эффективной подготовки образцов FFPE
- Удобный рабочий процесс: упрощённые процессы, которыми легко пользоваться.
- Депарафинизация, экстракция белков, сдвиговая фрагментация ДНК / РНК
- Быстрая высокопроизводительная обработка: эффективная работа с многолуночными планшетами.
- Эффективная депарафинизация: улучшенная солюбилизация белков.
- Нетоксичные растворители: позволяет избежать использования вредных органических растворителей, таких как ксилол.
Высокопроизводительный ультразвуковой аппарат UIP400MTP для высокопроизводительной обработки образцов FFPE в многолуночных планшетах
Совершенствование методов экстракции белков из тканей FFPE
Hielscher Ultrasonics решает задачи высокопроизводительной подготовки образцов FFPE. При обработке ультразвуком ультразвуковые волны создают механические колебания и сфокусированную кавитацию, эффективно разрушая клеточные структуры и усиливая солюбилизацию биомолекул. Этот метод приобрёл популярность благодаря способности повышать эффективность и выход экстракции нуклеиновых кислот и белков из тканей FFPE, а также обеспечивать сдвиговую фрагментацию ДНК и РНК для подготовки библиотек. Очень важно подчеркнуть, что обработка ультразвуком с использованием аппарата UIP400MTP для многолуночных планшетов сохраняет целостность этих биомолекул для последующего применения.
Сдвиговая фрагментация нуклеиновых кислот с помощью высокопроизводительной обработки ультразвуком
Ультразвуковой аппарат UIP400MTP для многолуночных планшетов, предназначенный для высокопроизводительной работы, выводит подготовку образцов FFPE на новый уровень. Этот метод обработки ультразвуком в многолуночных планшетах обеспечивает эффективное и надёжное решение для одновременной обработки нескольких образцов. Он способствует быстрой и воспроизводимой экстракции ДНК, РНК и белков, имеющих критическое значение для различных аналитических методов, включая секвенирование нового поколения (NGS), количественную ПЦР и протеомный анализ. Оптимизация параметров обработки ультразвуком, таких как амплитуда, продолжительность и температура, дополнительно повышает качество и количество экстрагируемых биомолекул.
Ультразвуковой аппарат UIP400MTP для многолуночных планшетов обеспечивает значительные преимущества при фрагментации и сдвиговом расщеплении ДНК и РНК из тканей FFPE. Одна из выдающихся особенностей этой системы – способность получать фрагменты ДНК и РНК в узком диапазоне размеров, обеспечивая точную настройку интенсивности обработки ультразвуком для получения коротких фрагментов длиной 150–200 пар оснований (bp) или более длинных фрагментов длиной 15–20 тысяч пар оснований (kbp). Такая универсальность делает UIP400MTP незаменимым для секвенирования как коротких, так и длинных прочтений, обеспечивая высококачественные результаты при секвенировании нового поколения (NGS) и полногеномном секвенировании (WGS). Точный контроль размера фрагментов крайне важен для исследователей во всех областях геномики, поскольку позволяет готовить образцы в соответствии с заданными требованиями.
Свяжитесь с нами для получения передовых решений по работе с тканями FFPE
Откройте для себя ультразвуковой аппарат UIP400MTP для многолуночных планшетов, обеспечивающий эффективное извлечение биомолекул из образцов FFPE с сохранением целостности экстрагируемых нуклеиновых кислот и белков и воспроизводимостью результатов. Эта технология легко интегрируется с другими подготовительными и аналитическими рабочими процессами, упрощая и совершенствуя молекулярные исследования с использованием архивов тканей FFPE.
Фиксаторы и их воздействие
Фиксация – важнейший этап подготовки образцов, сохраняющий клеточные структуры, останавливающий биохимические реакции и предотвращающий деградацию. В зависимости от конкретных требований эксперимента применяют различные фиксаторы. Два наиболее распространённых фиксатора – формальдегид и параформальдегид, которые образуют поперечные сшивки белков и нуклеиновых кислот, сохраняя морфологию и антигенность клеток и тканей. Другие фиксаторы, такие как этанол, метанол и глутаральдегид, используют для конкретных задач.
Фиксаторы на основе формальдегида и параформальдегида образуют метиленовые мостики между аминогруппами, что приводит к образованию поперечных сшивок белков. Этот процесс эффективно иммобилизует клеточные компоненты, сохраняя их целостность на последующих этапах анализа. На воздействие этих фиксаторов могут влиять такие факторы, как концентрация, pH и температура; оптимизация этих параметров крайне важна для обеспечения оптимального сохранения клеточных структур.
Преимущества ультразвуковой подготовки FFPE
Обработка ультразвуком – мощный метод разрушения фиксированных клеток и тканей, превосходящий обычные методы. Он обладает рядом заметных преимуществ перед традиционными методами лизиса:
- Скорость и эффективность: Ультразвуковой лизис обеспечивает быстрое разрушение клеток и тканей, значительно сокращая время обработки по сравнению с механическими или химическими методами лизиса. Высокочастотные звуковые волны, генерируемые ультразвуковым зондом, создают механические сдвиговые силы, вызывающие разрушение фиксированных клеточных структур. Такое быстрое и эффективное разрушение позволяет исследователям обрабатывать большие объёмы образцов за короткое время.
- Щадящее и регулируемое воздействие: Ультразвуковой лизис обеспечивает щадящий механизм разрушения, минимизирующий повреждение чувствительных биомолекул, таких как белки, нуклеиновые кислоты и ферменты. В отличие от механических методов, вызывающих чрезмерное нагревание или сдвиговые силы, ультразвуковой лизис использует контролируемую кавитацию для разрушения клеток с сохранением целостности и функциональности внутриклеточных компонентов.
- Универсальность: Ультразвуковой лизис можно применять к образцам, обработанным различными фиксаторами, что позволяет исследователям работать с широким спектром фиксированных образцов. Независимо от того, используется ли формальдегид, параформальдегид или альтернативные фиксаторы, ультразвуковой лизис неизменно обеспечивает эффективное разрушение, гарантируя оптимальное извлечение клеточных компонентов.
- Высокий выход и качество: Ультразвуковой лизис способствует высокому выходу неповреждённых клеточных компонентов благодаря способности равномерно разрушать фиксированные клетки и ткани. Это позволяет получать достоверные и воспроизводимые результаты при последующем применении таких методов, как анализ белков, экстракция нуклеиновых кислот и ферментативные анализы.
- Совместимость с автоматизацией: Ультразвуковой лизис легко интегрируется в автоматизированные системы, обеспечивая высокопроизводительную обработку образцов. Эта совместимость позволяет исследователям оптимизировать рабочий процесс и повышать производительность, особенно в масштабных исследованиях.
Ультразвуковой аппарат UIP400MTP для 96-луночных планшетов для обработки ультразвуком микротитровальных и многолуночных планшетов
Ультразвуковой лизис произвёл революцию в разрушении фиксированных клеток и тканей, предоставив многочисленные преимущества перед традиционными методами лизиса. Его скорость, эффективность, селективность, универсальность, высокий выход и совместимость с автоматизацией делают его незаменимым инструментом в исследованиях в области молекулярной биологии и биотехнологии. Предлагая как бесконтактные ультразвуковые аппараты, так и аппараты зондового типа, Hielscher Ultrasonics предлагает наиболее подходящий ультразвуковой гомогенизатор для вашей задачи в области наук о жизни. Независимо от того, хотите ли вы обрабатывать отдельные образцы, несколько образцов или очень большое количество образцов одновременно, мы предложим вам лучший ультразвуковой аппарат, соответствующий вашим исследовательским и диагностическим требованиям.
Узнайте больше о бесконтактных ультразвуковых аппаратах Hielscher для подготовки нескольких образцов и высокопроизводительной подготовки образцов!
- единовременные инвестиции
- используйте собственные расходные материалы
- отсутствие повторяющихся затрат на фирменные принадлежности и расходные материалы
- высокая производительность
- точное управление
- самые современные технологии
- надёжность и прочность
- регулируемое, точное управление процессом
- промышленное исполнение: возможна непрерывная работа 24/7
- простая и безопасная эксплуатация
- минимальное техническое обслуживание
Узнайте больше о применении ультразвуковых аппаратов в науках о жизни!
Ультразвуковой аппарат UIP400MTP для любых 96-луночных, микротитровальных и многолуночных планшетов.
Проектирование, производство и консультирование – качество из Германии
Ультразвуковые аппараты Hielscher хорошо известны высочайшими стандартами качества и проектирования. Прочность и простота эксплуатации позволяют легко интегрировать наши ультразвуковые аппараты в промышленные предприятия. Ультразвуковые аппараты Hielscher легко справляются с тяжёлыми условиями и требовательными рабочими средами.
Hielscher Ultrasonics – компания, сертифицированная по ISO, которая уделяет особое внимание высокопроизводительным ультразвуковым аппаратам, сочетающим самые современные технологии и удобство использования. Разумеется, ультразвуковые аппараты Hielscher соответствуют требованиям CE и удовлетворяют требованиям UL, CSA и RoHs.
Свяжитесь с нами! / Задайте нам вопрос!
Ультразвуковой аппарат UIP400MTP: Высокопроизводительная подготовка образцов FFPE в многолуночном планшете
Часто задаваемые вопросы
Ниже мы отвечаем на часто задаваемые вопросы, касающиеся подготовки тканей FFPE и обработки образцов FFPE ультразвуком.
Как подготавливают ткани FFPE?
Этапы подготовки тканей FFPE: тщательное обращение со свежими тканями и их обработка имеют критическое значение для получения высококачественных образцов FFPE. Обеспечение сохранности клеточной архитектуры, нуклеиновых кислот и белков необходимо для точного последующего анализа. Каждый этап – от сбора до заливки – требует точности для сохранения целостности образца для различных анализов, включая гистологическое исследование, иммуногистохимию и молекулярные исследования. При правильном выполнении этот процесс фиксации и заливки обеспечивает точное отражение состояния in vivo в сохранённой ткани, позволяя получать достоверные диагностические и исследовательские результаты.
Мы рассмотрим 6 основных этапов процесса заливки образцов тканей FFPE.
- Сбор тканей
Биопсии живых млекопитающих и культуры тканей являются пригодными источниками свежей ткани для подготовки образцов FFPE.
Важно соблюдать асептику: используйте стерильные инструменты и перчатки, чтобы избежать загрязнения. В идеале собирайте ткани в стерильных условиях, например в операционной или ламинарном боксе.
Поскольку образец очень хрупок, крайне важно бережное обращение с ним: сводите к минимуму задержки в обработке и начинайте последующую обработку ткани сразу после иссечения. Это критически важно для предотвращения аутолиза и деградации. Храните ткань при комнатной температуре; избегайте замораживания, поскольку оно может вызвать образование кристаллов льда и повреждение ткани. - Фиксация тканей
Сначала ткань обрабатывают раствором фиксатора: используйте 10% нейтральный забуференный формалин (NBF), который эквивалентен 4% формальдегиду в воде, забуференному до нейтрального pH.
Полностью погрузите ткань в формалин. Обеспечьте соотношение объёмов фиксатора и ткани не менее 10:1. Продолжительность фиксации обычно составляет от 6 до 24 часов в зависимости от типа и размера ткани. Важно, чтобы фиксатор мог полностью проникнуть в ткань. Однако чрезмерная фиксация может привести к образованию поперечных сшивок, затрудняющих восстановление антигенов, тогда как недостаточная фиксация может привести к плохому сохранению ткани. - Подрезка тканей
Во-вторых, подрежьте ткань до толщины около 3–5 mm, чтобы обеспечить достаточное проникновение фиксатора. Обеспечьте правильную ориентацию ткани, чтобы охватить значимые гистологические структуры. Это облегчает процесс экстракции при последующем использовании ткани для анализа.
- Обработка фиксированного образца
Теперь фиксированную ткань необходимо обезводить: после фиксации ткань нужно обезводить, чтобы обеспечить полное проникновение парафина. Проведите ткань через ряд растворов этанола возрастающей концентрации (70%, 80%, 90% и 100%) для удаления воды.
Просветление ксилолом: парафин нерастворим в воде, но растворим в ксилоле. Поэтому воду в ткани необходимо заменить ксилолом. Однако сам ксилол нерастворим в воде, но растворим в спирте, что требует промежуточного этапа, на котором воду сначала заменяют спиртом. Погрузите ткань в ксилол или его заменитель, чтобы удалить этанол и подготовить ткань к пропитыванию парафином.
Пропитывание парафином: поместите ткань в расплавленный парафин, обеспечив полное пропитывание. Этот этап обычно включает несколько смен парафина для обеспечения тщательной пропитки. - Заливка ткани
На этом этапе из ткани формируют тканевой блок: поместите ткань в форму в нужной ориентации и залейте её расплавленным парафином. Дайте парафину затвердеть, охлаждая его при комнатной температуре или на холодной плите.
- Получение и размещение срезов
Микротомия: для нарезки залитой ткани используйте микротом, чтобы получить тонкие срезы (обычно 4–5 микрометров) из парафинового блока. Затем подготовьте препарат, разместив срезы на предметных стёклах для последующего окрашивания и микроскопического анализа.
Наконец, проверьте качество гистологического препарата: оцените первые срезы под микроскопом, чтобы убедиться в правильности фиксации и обработки. При необходимости корректируйте протоколы с учётом типа ткани и наблюдаемого качества.
Ткани FFPE можно использовать для извлечения РНК, ДНК и белков, а также для обнаружения признаков рака или других заболеваний. Они могут храниться годами и являются важнейшей частью использования образцов тканей исследователями и врачами для диагностики и исследований.
Каковы распространённые проблемы и трудности при работе с тканями FFPE?
Образцы тканей, фиксированных формалином и залитых в парафин (FFPE), широко используются в исследованиях и диагностике, однако с ними связан ряд трудностей и распространённых проблем:
- Деградация биомолекул: Длительная фиксация может привести к деградации ДНК, РНК и белков, затрудняя экстракцию высококачественных нуклеиновых кислот или белков для последующего применения. Правильная фиксация (без недостаточной или чрезмерной фиксации) необходима для сохранения тканей.
- Маскирование антигенов: Процесс фиксации может маскировать антигенные участки, снижая эффективность связывания антител в иммуногистохимии и других иммунологических анализах. Это часто требует восстановления антигенов – процедуры, устраняющей маскирование эпитопа и восстанавливающей связывание эпитопа с антителом. Однако полная антигенность не всегда может быть восстановлена.
- Вариабельность качества фиксации: Различия в продолжительности и условиях фиксации могут приводить к неоднородному качеству образцов, влияя на воспроизводимость и сопоставимость результатов. Используйте надёжные протоколы фиксации и избегайте недостаточной и чрезмерной фиксации.
- Повреждение и фрагментация ДНК: Фиксация образцов FFPE формалином может вызывать различные типы повреждений ДНК, включая дезаминирование цитозина (мутации C в T), окислительные повреждения (например, 8-oxo-guanine, приводящий к мутациям G в T), а также физические повреждения, такие как одноцепочечные разрывы, пробелы и участки без азотистых оснований, препятствующие активности ДНК-полимеразы. Процесс фиксации формалином может вызывать фрагментацию ДНК, затрудняя генетические и геномные анализы, такие как ПЦР и секвенирование.
- Качество РНК: РНК, экстрагированная из тканей FFPE, часто фрагментирована и химически модифицирована, что затрудняет проведение высококачественного транскриптомного анализа.
- Модификации белков: Формалин может вызывать химические модификации белков, влияя на их структуру и функцию, что может мешать протеомному анализу.
- Артефакты обработки образцов: В процессе заливки и получения срезов механическое воздействие и нагрев могут создавать артефакты и вызывать дополнительное повреждение ткани.
- Вариабельность между партиями: Различия в протоколах фиксации и заливки между разными партиями могут приводить к значительной вариабельности результатов, затрудняя сравнение исследований.
- Проблемы хранения: Длительное хранение блоков FFPE может со временем приводить к дополнительной деградации и утрате целостности нуклеиновых кислот, влияя на пригодность архивных образцов для ретроспективных исследований.
Образование поперечных сшивок: Фиксация формалином вызывает образование поперечных сшивок белков и нуклеиновых кислот, что может затруднять молекулярный анализ и влиять на точность иммуногистохимии и других анализов.
Использование оптимизированных протоколов, бережное обращение с образцами и применение передовых методов помогают повысить качество и достоверность данных, получаемых из тканей FFPE.
В чём разница между тканями FFPE и замороженными тканями?
Ткани FFPE (фиксированные формалином и залитые в парафин) сохраняют путём фиксации формалином и последующей заливки в парафин, что обеспечивает длительное хранение при комнатной температуре с сохранением морфологии тканей. В отличие от них, замороженные ткани быстро сохраняют путём замораживания, что лучше сохраняет целостность нуклеиновых кислот и белков, но требует хранения при очень низких температурах.
Какие химические вещества используют для заливки FFPE?
Химические вещества, используемые для заливки FFPE, обычно включают формалин для фиксации и парафин для заливки. При заливке FFPE ткани обычно фиксируют либо 10% (v/v) нейтральным забуференным формалином (FA), либо свежеприготовленным 4% (w/v) раствором формальдегида (PFA), полученным из порошка параформальдегида. Формалин, представляющий собой раствор формальдегида в воде, буферизуют до нейтрального pH для сохранения морфологии тканей и предотвращения чрезмерного образования поперечных сшивок. Раствор на основе параформальдегида также обеспечивает эффективную фиксацию путём образования поперечных сшивок белков, тем самым стабилизируя структуру ткани для последующей заливки в парафин. Эти химические вещества необходимы для сохранения целостности и морфологии тканей в процессе фиксации и заливки.
Как удаляют парафин из образцов FFPE?
Для удаления парафина из образцов FFPE срезы тканей обычно подвергают серии промывок ксилолом с последующей регидратацией через ряд спиртовых растворов ступенчато изменяющейся концентрации и, наконец, воду. Поскольку ксилол высокотоксичен и представляет опасность для здоровья, включая проблемы с дыханием, раздражение кожи и возможные долгосрочные последствия при повторном воздействии, ультразвуковое удаление парафина становится перспективной альтернативой во многих лабораториях. Этот метод использует интенсивные ультразвуковые волны для эффективного и безопасного удаления парафина без необходимости применения токсичных растворителей, таких как ксилол, тем самым снижая риск для лабораторного персонала и создавая более безопасные условия работы.
Как долго следует фиксировать ткани для получения образцов FFPE хорошего качества?
Общие рекомендации по продолжительности фиксации обычно предполагают фиксацию образцов тканей в формалине в течение 24–48 часов. Этого времени, как правило, достаточно для сохранения морфологии тканей и клеточных структур при минимизации чрезмерной фиксации, которая может привести к избыточному образованию поперечных сшивок и деградации нуклеиновых кислот и белков. Однако оптимальное время фиксации может различаться в зависимости от размера и типа ткани; меньшие или более нежные образцы требуют более короткого времени фиксации. Крайне важно обеспечить баланс между достаточной фиксацией для предотвращения аутолиза и деградации ткани и недопущением длительной фиксации, которая может затруднять последующие молекулярные анализы.