Лизис дрожжевых клеток в микропланшетах с помощью высокоинтенсивной обработки ультразвуком
Микробиологи и исследователи в области наук о жизни, работающие с Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris / Komagataella phaffii, а также другими дрожжевыми системами, знакомы с этой проблемой: дрожжевые клетки устойчивы к разрушению, добиться воспроизводимого лизиса бывает трудно, а ручное разрушение образцов быстро становится узким местом, когда необходимо проводить скрининг большого числа штаммов, клонов, условий культивирования или экспрессионных конструкций.
Высокопроизводительный лизис дрожжей для микробиологии, молекулярной биологии и анализа белков
Ультразвуковые устройства Hielscher для микропланшетов, такие как UIP400MTP (400 W) и UIP550MTP (550 W), обеспечивают высокопроизводительное механическое разрушение дрожжевых клеток непосредственно в микропланшетах. Вместо поочерёдной обработки образцов зондом можно обрабатывать ультразвуком целые микропланшеты в одинаковых условиях. Это делает ультразвуковой лизис дрожжей более быстрым, более воспроизводимым и упрощает его интеграцию в современные рабочие процессы микробиологии, экспрессии белков, скрининга ферментов и омиксных исследований.
Независимо от того, требуется ли вам высвободить рекомбинантные белки из P. pastoris, подготовить дрожжевые лизаты для ферментных анализов, разрушить S. cerevisiae для анализа белков или параллельно провести скрининг десятков дрожжевых клонов, ультразвуковые устройства Hielscher для микропланшетов обеспечивают мощное разрушение клеток на основе кавитации с точным контролем процесса.
Нужен воспроизводимый лизис S. cerevisiae, P. pastoris, или других штаммов дрожжей в микропланшетах? Сообщите нам формат планшета, объём образца, плотность клеток и целевой аналит. Мы поможем определить подходящие параметры обработки ультразвуком для вашего рабочего процесса с UIP400MTP или UIP550MTP.
Ультразвуковое устройство Hielscher для многолуночных планшетов для лизиса дрожжей – высокопроизводительная пробоподготовка
Почему дрожжевым клеткам необходим эффективный механический лизис
Дрожжевые клетки труднее подвергать лизису, чем многие бактериальные клетки или клетки млекопитающих, поскольку они защищены жёсткой клеточной стенкой, состоящей преимущественно из полисахаридов, глюканов, маннопротеинов и хитина. Эта клеточная стенка обеспечивает механическую стабильность, но также ограничивает высвобождение внутриклеточных белков, нуклеиновых кислот, метаболитов и ферментов.
Традиционные методы лизиса дрожжей включают разрушение с помощью бусин, ферментативное расщепление, циклы замораживания и оттаивания, химический лизис и обработку ультразвуком с помощью зонда. Эти методы могут быть эффективными, однако они также имеют ограничения. Разрушение с помощью бусин может приводить к появлению посторонних частиц и нагреву, ферментативное расщепление может увеличивать затраты и вариабельность, а обработка отдельных образцов ультразвуковым зондом требует много времени при большом количестве образцов.
Высокоинтенсивная сфокусированная ультразвуковая кавитация преодолевает эти ограничения, воздействуя на дрожжевую суспензию интенсивными механическими силами сдвига, колебаниями давления и микропотоками. Результат – быстрое разрушение клеточных стенок и мембран, улучшенное высвобождение внутриклеточных компонентов и высоковоспроизводимая пробоподготовка в планшетном формате.
Обработка микропланшетов ультразвуком для параллельной подготовки дрожжевых образцов
Hielscher UIP400MTP и UIP550MTP предназначены для равномерной обработки ультразвуком микропланшетов, многолуночных планшетов, ПЦР-планшетов и подходящих штативов для образцов. В отличие от обработки ультразвуковым зондом, образцы не требуется обрабатывать по отдельности. Весь планшет подвергается контролируемому воздействию ультразвуковой энергии, что делает этот рабочий процесс особенно подходящим для параллельной обработки образцов.
Это особенно полезно для следующих задач:
- Скрининг мутантов или экспрессионных штаммов S. cerevisiae
- Лизис клонов P. pastoris / K. phaffii после экспрессии рекомбинантного белка
- Подготовка дрожжевых лизатов для ферментных анализов
- Экстракция белков для SDS-PAGE, вестерн-блоттинга, ELISA, LC-MS/MS или проверки активности
- Высвобождение внутриклеточных метаболитов для метаболомики
- Подготовка образцов ДНК и РНК после подходящей последующей очистки
- Высокопроизводительная оптимизация буферов для лизиса, добавок и условий экстракции
Как ультразвуковая кавитация разрушает дрожжевые клетки
Во время обработки ультразвуком сфокусированный ультразвук высокой мощности создаёт чередующиеся циклы сжатия и разрежения в жидком образце. При достаточной интенсивности эти колебания давления вызывают акустическую кавитацию. Кавитационные пузырьки образуются, колеблются и схлопываются, создавая локальные силы сдвига, микроструи, турбулентность и сильные градиенты давления.
В дрожжевых суспензиях эти механические воздействия ослабляют и разрывают клеточную стенку и клеточную мембрану. Внутриклеточные белки, ферменты, нуклеиновые кислоты и метаболиты высвобождаются в буфер для лизиса. Поскольку процесс является механическим, его можно использовать со многими различными буферными системами и сочетать с ингибиторами протеаз, восстановителями, детергентами, солями или мягкой предварительной ферментативной обработкой.
Общий протокол: лизис дрожжевых клеток в микропланшетах
Следующий протокол представляет собой практическую отправную точку для лизиса дрожжей с использованием ультразвукового устройства Hielscher UIP400MTP или UIP550MTP для микропланшетов. Параметры следует оптимизировать с учётом штамма дрожжей, плотности клеток, целевой молекулы, состава буфера, типа планшета и последующего анализа.
1. Соберите и промойте дрожжевые клетки
Вырастите Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Debaryomyces или другой штамм дрожжей в нужных условиях культивирования. Соберите клетки центрифугированием и удалите питательную среду. Промойте осадок холодной дистиллированной водой, PBS или выбранным буфером для лизиса, чтобы удалить остаточные компоненты среды, которые могут мешать последующему анализу.
Для экстракции белков поддерживайте образцы холодными и работайте быстро. Если есть опасения относительно действия протеаз, предварительно охладите все буферы и расходные материалы.
2. Ресуспендируйте клеточный осадок
Ресуспендируйте дрожжевой осадок в подходящем холодном буфере для лизиса. Для эффективного высвобождения белков высокая плотность клеток часто является преимуществом. В качестве отправной точки используйте приблизительно 10–20% w/v влажного клеточного осадка или плотную суспензию, соответствующую OD600 > 10, в зависимости от анализа.
Типичный буфер для лизиса дрожжей с целью выделения белков может содержать:
- буферную систему, такую как Tris-HCl, фосфатный буфер или HEPES
- соль, такую как NaCl или KCl
- смесь ингибиторов протеаз
- при необходимости восстановитель, такой как DTT или β-меркаптоэтанол
- при необходимости детергент, такой как Triton X-100, NP-40, SDS или CHAPS, в зависимости от совместимости с последующими процедурами
- при необходимости ингибиторы фосфатаз для исследований фосфорилирования
Для трудно поддающихся лизису штаммов дрожжей или очень щадящей экстракции белков перед обработкой ультразвуком можно применять кратковременную предварительную обработку Zymolyase, Lyticase или другим ферментом, расщепляющим клеточную стенку. Эта предварительная ферментативная обработка необязательна, но может повысить эффективность лизиса или снизить необходимую интенсивность ультразвука.
3. Перенесите образцы в подходящий микропланшет
Распределите дрожжевую суспензию по лункам микропланшета, совместимого с обработкой ультразвуком. Часто предпочтительны планшеты с круглым дном, поскольку они улучшают сбор образцов и уменьшают мёртвые зоны. Используйте одинаковые объёмы образцов во всех лунках для повышения воспроизводимости.
Герметично закройте планшет подходящим уплотнительным ковриком или плёнкой, чтобы предотвратить испарение, образование аэрозолей и перекрёстное загрязнение. Убедитесь, что герметизирующий материал совместим с выбранной температурой и условиями обработки ультразвуком.
Типичные рабочие объёмы зависят от формата планшета и области применения. Распространённые форматы включают 96-луночные планшеты, планшеты с глубокими лунками, ПЦР-планшеты или подходящие штативы для пробирок.
4. Организуйте охлаждение
Лизис дрожжей требует высокой интенсивности ультразвука, а механическое разрушение сопровождается выделением тепла. Поэтому контроль температуры критически важен, особенно для анализа белков, ферментов, РНК или фосфорилирования.
Используйте подходящий способ охлаждения, например:
- предварительно охлаждённый буфер для лизиса
- предварительно охлаждённые микропланшеты
- паузы для охлаждения между интервалами обработки ультразвуком
- внешнее охлаждение платформы для обработки ультразвуком, где это применимо
Цель – поддерживать образец достаточно холодным, чтобы предотвратить денатурацию белков, инактивацию ферментов, деградацию РНК и вызванную нагревом вариабельность образцов.
5. Обработайте дрожжевую суспензию ультразвуком
Поместите герметично закрытый планшет в ультразвуковое устройство Hielscher UIP400MTP или UIP550MTP для микропланшетов и выберите программу импульсной обработки ультразвуком. Рекомендуется импульсный режим, поскольку он обеспечивает механическое разрушение в фазах включения (ON) и отвод тепла в фазах выключения (OFF).
В качестве отправной точки для лизиса дрожжевых клеток:
| Параметр | Рекомендуемый начальный диапазон | Назначение |
|---|---|---|
| Амплитуда | 60–100% | Высокая интенсивность кавитации для устойчивых к разрушению дрожжевых клеток |
| Импульсный режим | 10–30 sec включения (ON) / 30–60 sec выключения (OFF) | Эффективный лизис с контролируемым накоплением тепла |
| Суммарное время включения (ON) | 5–15 min | Корректируйте с учётом штамма, плотности и целевой молекулы |
| Температура | Поддерживайте образцы холодными | Защита белков, ферментов, РНК и метаболитов |
| Герметизация планшета | Рекомендуется | Предотвращает испарение, образование аэрозолей и перекрёстное загрязнение |
Для суспензий дрожжей, особенно устойчивых к разрушению, плотной биомассы P. pastoris или сложных задач экстракции рекомбинантных белков постепенно увеличивайте суммарное время включения (ON). Для термочувствительных белков или ферментных анализов используйте более короткие импульсы, более длительные паузы для охлаждения и меньшую начальную амплитуду.
Высокопроизводительный лизис дрожжей в многолуночных планшетах с UIP400MTP
6. Осветлите лизат
После обработки ультразвуком центрифугируйте микропланшет или перенесите образцы в пробирки для центрифугирования. Удалите клеточные остатки центрифугированием при подходящих скорости и температуре. Соберите надосадочную жидкость для последующего анализа.
В зависимости от области применения лизат можно использовать для:
- количественного определения белков
- анализа активности ферментов
- SDS-PAGE и вестерн-блоттинга
- ELISA и иммуноанализов
- протеомики методом LC-MS/MS
- анализа метаболитов
- очистки ДНК или РНК
7. Оптимизируйте и документируйте метод
Для воспроизводимого лизиса дрожжей документируйте все значимые параметры, включая штамм, условия культивирования, OD600, массу влажных клеток, состав буфера, тип планшета, объём образца, амплитуду, импульсный цикл, суммарное время включения (ON), способ охлаждения и конечную температуру образца.
Если ультразвуковое устройство Hielscher оснащено автоматической регистрацией данных, данные процесса можно использовать для документирования, разработки метода, масштабирования и контроля качества.
Рекомендации по оптимизации лизиса дрожжей
Для максимального высвобождения белков используйте плотные дрожжевые суспензии, высокую интенсивность ультразвука и достаточное суммарное время включения (ON). Для чувствительных белков уменьшайте амплитуду, увеличивайте паузы для охлаждения и поддерживайте планшет холодным в течение всей обработки.
Если лизис неполный, постепенно увеличивайте время обработки ультразвуком, испытайте предварительную ферментативную обработку, уменьшите вязкость образца или оптимизируйте буфер. Если белки деградируют или теряют активность, улучшите охлаждение, сократите интервалы включения (ON), добавьте ингибиторы и убедитесь, что система детергентов совместима с целевым белком.
Поскольку штаммы дрожжей существенно различаются по структуре клеточной стенки, фазе роста, системе экспрессии и плотности биомассы, рекомендуется провести небольшой матричный эксперимент для оптимизации. Например, испытайте три значения амплитуды, два импульсных цикла и два значения суммарного времени включения (ON), затем оцените эффективность лизиса и целостность белков.
Независимо от того, обрабатываете ли вы несколько планшетов для анализов или проводите высокопроизводительный скрининг дрожжей, Hielscher поможет подобрать подходящее ультразвуковое устройство для микропланшетов и разработать надёжный протокол лизиса. Свяжитесь с нами и сообщите ваш штамм дрожжей, рабочий процесс и требования к производительности!
Преимущества ультразвуковых устройств Hielscher для лизиса дрожжей в микропланшетах
Ультразвуковые устройства Hielscher для микропланшетов идеально подходят лабораториям, которым требуется воспроизводимый лизис большого числа образцов. Они устраняют медленную поочерёдную обработку отдельных образцов ультразвуковым зондом и уменьшают вариабельность, вызванную ручным позиционированием зонда, глубиной погружения и различиями в манипуляциях с отдельными образцами.
Основные преимущества включают:
- Высокопроизводительная обработка: Параллельно обрабатывайте ультразвуком множество дрожжевых образцов в микропланшетах или совместимых штативах для образцов.
- Воспроизводимые условия: Одинаковые условия обработки ультразвуком во всех лунках для однородных, сопоставимых результатов лизиса.
- Отсутствие перекрёстного загрязнения через зонд: Образцы остаются герметично закрытыми во время обработки ультразвуком, что уменьшает перенос материала между образцами и количество этапов очистки.
- Подходит для устойчивых к разрушению клеток: Высокоинтенсивный ультразвук способствует разрушению клеточных стенок дрожжей.
- Эффективный рабочий процесс: Идеально подходит для скрининга штаммов, клонов, условий экспрессии и буферов для лизиса.
- Эффективный рабочий процесс: Программируемые настройки, автоматическая регистрация данных и пригодность для лабораторной автоматизации.
Применение в биотехнологии дрожжей и исследованиях в области наук о жизни
Ультразвуковой лизис дрожжей в микропланшетах подходит для многих исследовательских и скрининговых рабочих процессов. При экспрессии рекомбинантных белков клоны P. pastoris и S. cerevisiae можно параллельно подвергать лизису для сравнения уровней экспрессии или активности ферментов. В системной биологии и омиксных исследованиях стандартизованный лизис улучшает сопоставимость результатов для разных условий. В микробиологии обработка ультразвуком способствует быстрой подготовке лизатов из множества штаммов, при различных условиях питательной среды или стрессовых воздействиях.
Типичные области применения включают:
- экстракцию белков из дрожжей
- скрининг рекомбинантных белков
- скрининг активности ферментов
- отбор клонов после трансформации
- оптимизацию ферментации
- подготовку образцов для протеомики
- подготовку образцов для метаболомики
- исследования разрушения клеточной стенки
- высокопроизводительные микробиологические анализы
Надёжный лизис дрожжей начинается с контролируемой обработки ультразвуком
Лизис дрожжей может становиться затруднительным при увеличении количества образцов, однако ультразвуковые устройства Hielscher для микропланшетов делают процесс более быстрым, более чистым и более воспроизводимым. UIP400MTP и UIP550MTP позволяют исследователям обрабатывать целые планшеты в заданных ультразвуковых условиях, повышая производительность и одновременно сокращая ручные манипуляции.
Для микробиологов, молекулярных биологов, исследователей белков и биотехнологических лабораторий обработка микропланшетов ультразвуком является мощным инструментом для эффективного и воспроизводимого высвобождения внутриклеточных компонентов дрожжей.
Часто задаваемые вопросы о лизисе дрожжевых клеток с помощью обработки микропланшетов ультразвуком
Можно ли подвергать дрожжевые клетки лизису с помощью обработки ультразвуком?
Да. Дрожжевые клетки, такие как Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris, можно подвергать лизису с помощью высокоинтенсивной обработки ультразвуком. Ультразвуковая кавитация создаёт сильные механические силы сдвига, которые разрушают клеточную стенку и мембрану дрожжей, высвобождая белки, ферменты, нуклеиновые кислоты и метаболиты.
Почему дрожжевые клетки труднее подвергать лизису, чем бактериальные?
Дрожжевые клетки имеют толстую и механически устойчивую клеточную стенку, состоящую преимущественно из глюканов, маннопротеинов и хитина. Эта жёсткая структура делает дрожжи более трудными для разрушения, чем многие бактериальные клетки или клетки млекопитающих. Поэтому лизис дрожжей обычно требует более высокой интенсивности, более длительной обработки или необязательной предварительной ферментативной обработки.
Какие ультразвуковые устройства Hielscher подходят для лизиса дрожжей в микропланшетах?
Hielscher UIP400MTP и UIP550MTP подходят для высокопроизводительного лизиса дрожжей в микропланшетах. UIP400MTP идеально подходит для стандартной параллельной пробоподготовки, тогда как UIP550MTP обеспечивает более высокую ультразвуковую мощность для сложных задач лизиса, плотных суспензий и устойчивых к разрушению штаммов дрожжей.
Можно ли подвергать Pichia pastoris лизису в ультразвуковом устройстве для микропланшетов?
Да. Pichia pastoris, также известные как Komagataella phaffii, можно подвергать лизису с помощью высокоинтенсивной обработки микропланшетов ультразвуком. Поскольку P. pastoris могут образовывать плотную биомассу и имеют устойчивую к разрушению клеточную стенку, рекомендуется оптимизировать амплитуду, импульсный цикл, охлаждение и общее время обработки ультразвуком.
Каковы типичные параметры обработки ультразвуком для лизиса дрожжей?
Полезный начальный диапазон – амплитуда 50–80%, импульсный режим, например 10–30 секунд включения (ON) и 30–60 секунд выключения (OFF), и 5–15 минут суммарного времени включения (ON). Точные параметры зависят от штамма дрожжей, плотности клеток, объёма образца, типа планшета, буфера и целевой молекулы.
Почему лизис дрожжей следует проводить в импульсном режиме?
Импульсный режим уменьшает накопление тепла во время обработки ультразвуком. Во время фазы включения (ON) ультразвуковая кавитация разрушает клетки. Во время фазы выключения (OFF) образец может охлаждаться. Это важно, поскольку избыточное тепло может денатурировать белки, снижать активность ферментов, вызывать деградацию РНК и ухудшать воспроизводимость.
Требуется ли предварительная ферментативная обработка перед обработкой дрожжевых клеток ультразвуком?
Предварительная ферментативная обработка требуется не всегда, но она может повысить эффективность лизиса. Ферменты, такие как Zymolyase или Lyticase, частично расщепляют клеточную стенку дрожжей и могут уменьшить интенсивность ультразвука или время, необходимые для полного лизиса. Это может быть полезно для чувствительных белков или трудно поддающихся лизису штаммов.
Как предотвратить перегрев при обработке дрожжей ультразвуком?
Используйте предварительно охлаждённые буферы, импульсный режим, паузы для охлаждения и охлаждаемую установку для планшета. Держите микропланшет герметично закрытым и по возможности контролируйте температуру. Для чувствительных белков используйте более короткие интервалы включения (ON), более длительные интервалы выключения (OFF) и обрабатывайте образцы в холодных условиях.
Может ли обработка микропланшетов ультразвуком заменить разрушение с помощью бусин при лизисе дрожжей?
Во многих рабочих процессах – да. Обработка микропланшетов ультразвуком может заменить разрушение с помощью бусин, когда требуется чистый, воспроизводимый и параллельный лизис. Она позволяет избежать манипуляций с бусинами, упрощает использование расходных материалов и автоматизацию. Однако каждый вариант применения следует валидировать путём сравнения выхода при лизисе, целостности белков и характеристик анализа.
Подходит ли обработка микропланшетов ультразвуком для экстракции белков из дрожжей?
Да. Обработка микропланшетов ультразвуком хорошо подходит для экстракции белков из дрожжей, особенно когда необходимо сравнить множество клонов или условий культивирования. Ингибиторы протеаз, холодные буферы и контролируемые настройки импульсного режима помогают сохранить качество белков.
Можно ли использовать один и тот же метод для экстракции ДНК, РНК и белков?
Можно использовать один и тот же основной принцип обработки ультразвуком, однако буфер и условия процесса следует адаптировать к целевой молекуле. Рабочие процессы с белками требуют ингибирования протеаз и контроля температуры. Рабочие процессы с РНК требуют проведения манипуляций в условиях отсутствия РНКаз и интенсивного охлаждения. Рабочие процессы с ДНК могут требовать различных условий лизиса и очистки в зависимости от того, нужна ли интактная геномная ДНК или фрагментированная ДНК.
Какой тип планшета следует использовать для лизиса дрожжей?
Используйте совместимый с обработкой ультразвуком микропланшет или планшет с глубокими лунками и подходящей герметизацией. Планшеты с круглым дном часто удобны для работы с суспензиями. Планшет должен выдерживать выбранные условия обработки ультразвуком, температуру образца и этапы центрифугирования.
Как определить, завершён ли лизис дрожжей?
Эффективность лизиса можно проверить с помощью микроскопии, по выходу белков, активности ферментов, снижению вязкости, анализу SDS-PAGE, выходу ДНК/РНК или путём сравнения с известным методом лизиса. При разработке метода оценивайте как выход, так и качество высвобождённой целевой молекулы.
UIP400MTP или UIP550MTP: какое ультразвуковое устройство для микропланшетов выбрать?
UIP400MTP – мощное ультразвуковое устройство для микропланшетов, предназначенное для стандартной высокопроизводительной пробоподготовки, включая лизис дрожжей, экстракцию белков, фрагментацию ДНК за счёт сдвига, отделение биоплёнок и подготовку к анализам. Оно подходит лабораториям, которым требуется воспроизводимая обработка ультразвуком в стандартных форматах планшетов.
UIP550MTP обеспечивает более высокую ультразвуковую мощность и рекомендуется, когда более сложные задачи требуют большей акустической интенсивности, меньшего времени обработки, большего количества материала в образцах или более интенсивных условий разрушения. Для лизиса дрожжей UIP550MTP особенно полезно при работе с плотной биомассой, трудно поддающимися лизису штаммами, большими рабочими объёмами и высокопроизводительным скринингом экспрессии.
Можно ли автоматизировать лизис дрожжей с помощью обработки микропланшетов ультразвуком?
Да. Обработка ультразвуком в микропланшетах хорошо подходит для автоматизированных лабораторных рабочих процессов, поскольку образцы остаются в планшетном формате. Это способствует интеграции с системами пипетирования, манипуляциями с планшетами, центрифугированием, подготовкой к анализам и рабочими процессами высокопроизводительного скрининга.
Литература / Источники
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator — Non-Contact Sonicator — Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator — Non-Contact Sonicator — Hielscher Ultrasonics
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics 2024.
