Лизис дрожжевых клеток в микропланшетах с помощью высокоинтенсивной ультразвуковой обработки

Микробиологи и исследователи в области биологических наук, занимающиеся Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris / Komagataella phaffii, и исследователи, работающие с другими дрожжевыми системами, знакомы с этой проблемой: дрожжевые клетки отличаются высокой устойчивостью, их воспроизводимый лизис может представлять сложность, а ручное разрушение образцов быстро становится «узким местом», когда требуется провести скрининг большого количества штаммов, клонов, условий культивирования или экспрессионных конструкций.

Высокопроизводительный лизис дрожжей для микробиологии, молекулярной биологии и анализа белков

Ультразвуковые аппараты Hielscher для микропланшетов, такие как UIP400MTP (400 Вт) и UIP550MTP (550 Вт), представляют собой высокопроизводительное решение для механического лизиса дрожжевых клеток непосредственно в микропланшетах. Вместо обработки образцов по одному с помощью зонда можно подвергать ультразвуковой обработке целые микропланшеты в однородных условиях. Это делает ультразвуковой лизис дрожжевых клеток более быстрым, воспроизводимым и простым для интеграции в современные рабочие процессы в области микробиологии, экспрессии белков, скрининга ферментов и омических исследований.
Независимо от того, нужно ли вам выделить рекомбинантные белки из P. pastoris, подготовить дрожжевые лизаты для ферментативных анализов, разрушить клетки S. cerevisiae для анализа белков или провести параллельный скрининг десятков дрожжевых клонов, ультразвуковые устройства Hielscher для микропланшетов обеспечивают мощное разрушение клеток на основе кавитации с точным контролем процесса.

Почему дрожжевым клеткам необходим эффективный механический лизис

Клетки дрожжей лизировать сложнее, чем многие бактериальные или клетки млекопитающих, поскольку они защищены жесткой клеточной стенкой, состоящей в основном из полисахаридов, глюканов, маннопротеинов и хитина. Эта клеточная стенка обеспечивает механическую стабильность, но в то же время ограничивает высвобождение внутриклеточных белков, нуклеиновых кислот, метаболитов и ферментов.
К традиционным методам лизиса дрожжей относятся измельчение с использованием бисеров, ферментативное расщепление, циклы замораживания-размораживания, химический лизис и ультразвуковая обработка с использованием зонда. Эти методы могут быть эффективными, но у них также есть свои ограничения. Измельчение с помощью бисера может приводить к появлению осадка и нагреванию, ферментативное расщепление — к увеличению затрат и нестабильности результатов, а ультразвуковая обработка с использованием зонда для отдельных образцов отнимает много времени при необходимости обработки большого количества образцов.
Высокоинтенсивная фокусированная ультразвуковая кавитация позволяет преодолеть эти ограничения за счет воздействия на суспензию дрожжей интенсивных механических сдвиговых сил, колебаний давления и микропотоков. Результатом является быстрое разрушение клеточных стенок и мембран, улучшение внутриклеточного высвобождения и высокая воспроизводимость подготовки образцов в формате чашек.

Ультразвуковая обработка микропланшетов для параллельной подготовки образцов дрожжей

Установки Hielscher UIP400MTP и UIP550MTP предназначены для равномерной ультразвуковой обработки микропланшетов, многолуночных планшетов, ПЦР-планшетов и соответствующих стоек для образцов. В отличие от ультразвуковой обработки с использованием зонда, образцы не требуют индивидуальной обработки. Вся плашка подвергается воздействию контролируемой ультразвуковой энергии, что делает данный рабочий процесс идеально подходящим для параллельной обработки образцов.

Это особенно полезно для:

• экранирование Пекарские дрожжи мутанты или штаммы с измененной экспрессией
• Лизис Отец, пастырь / K. phaffii клоны после экспрессии рекомбинантного белка
• Получение дрожжевых лизатов для ферментативных анализов
• Извлечение белка для SDS-PAGE, вестерн-блоттинга, ELISA, LC-MS/MS или определения активности
• Выделение внутриклеточных метаболитов для метаболомики
• Подготовка образцов ДНК и РНК после соответствующей последующей очистки
• Высокопроизводительная оптимизация буферов для лизиса, добавок и условий экстракции

Как ультразвуковая кавитация разрушает дрожжевые клетки

В процессе ультразвуковой обработки сфокусированный ультразвук высокой мощности вызывает в жидкой пробе чередующиеся циклы сжатия и разрежения. При достаточной интенсивности эти колебания давления приводят к возникновению акустической кавитации. Кавитационные пузырьки образуются, колеблются и разрушаются, создавая локализованные сдвиговые силы, микроструи, турбулентность и сильные градиенты давления.
В суспензиях дрожжей эти механические воздействия ослабляют и разрушают клеточную стенку и клеточную мембрану. Внутриклеточные белки, ферменты, нуклеиновые кислоты и метаболиты высвобождаются в лизирующий буфер. Поскольку этот процесс носит механический характер, его можно применять с множеством различных буферных систем и сочетать с ингибиторами протеаз, восстановителями, детергентами, солями или мягкой ферментативной предварительной обработкой.

Общий протокол: лизис дрожжевых клеток в микропланшетах

Приведенный ниже протокол представляет собой практическую отправную точку для лизиса дрожжей с использованием ультразвукового аппарата для микропланшетов Hielscher UIP400MTP или UIP550MTP. Параметры следует оптимизировать с учетом штамма дрожжей, плотности клеток, целевой молекулы, состава буфера, типа планшета и последующего анализа.

1. Сбор и промывка дрожжевых клеток

Вырастите дрожжи рода Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Debaryomyces или другой штамм дрожжей в требуемых условиях культивирования. Сбор клеток осуществляйте методом центрифугирования и удалите культуральную среду. Промойте осадок холодной дистиллированной водой, PBS или выбранным буфером для лизиса, чтобы удалить остаточные компоненты среды, которые могут помешать последующему анализу.
При экстракции белков образцы следует хранить в холоде и работать быстро. Если существует риск воздействия протеаз, предварительно охладите все буферы и расходные материалы.

2. Восстановите суспензию клеточного осадка

Ресуспендируйте осадок дрожжей в подходящем холодном лизирующем буфере. Для эффективного высвобождения белка часто предпочтительна высокая плотность клеток. В качестве исходного материала используйте примерно 10–20 % (мас./об.) влажного осадка клеток или густую суспензию, соответствующую значению ОД₆₀₀ > 10, в зависимости от метода анализа.

Типичный буфер для лизиса дрожжевых белков может содержать:

• буферная система, такая как Tris-HCl, фосфатный буфер или HEPES
• соль, например NaCl или KCl
• Коктейль ингибиторов протеазы
• дополнительный восстановитель, например, ДТТ или β-меркаптоэтанол
• дополнительное моющее средство, такое как Triton X-100, NP-40, SDS или CHAPS, в зависимости от совместимости с последующими этапами
• дополнительные ингибиторы фосфатаз для исследований фосфорилирования

В случае сложных штаммов дрожжей или при необходимости очень бережной экстракции белка перед ультразвуковой обработкой можно провести кратковременную ферментативную предварительную обработку с использованием Zymolyase, Lyticase или другого фермента, расщепляющего клеточную стенку. Такая ферментативная предварительная обработка не является обязательной, но может повысить эффективность лизиса или снизить требуемую интенсивность ультразвука.

3. Перенести образцы в подходящую микропланшет

Перенесите суспензию дрожжей в микропланшет, пригодный для ультразвуковой обработки. Чаще всего предпочитают использовать планшеты с круглым дном, поскольку они облегчают сбор проб и уменьшают количество мертвых зон. Для повышения воспроизводимости результатов следует использовать одинаковые объемы проб во всех лунках.
Закройте чашку подходящей герметизирующей прокладкой или пленкой, чтобы предотвратить испарение, образование аэрозолей и перекрестное загрязнение. Убедитесь, что герметизирующий материал совместим с выбранными температурными режимами и условиями ультразвуковой обработки.
Типичные рабочие объемы зависят от формата планшета и области применения. К распространенным форматам относятся 96-луночные планшеты, планшеты с глубокими лунками, ПЦР-планшеты или подходящие штативы для пробирок.

4. Настройка системы охлаждения

Для лизиса дрожжей требуется высокая интенсивность ультразвукового воздействия, а механическое разрушение клеток сопровождается выделением тепла. Поэтому контроль температуры имеет решающее значение, особенно при анализе белков, ферментов, РНК или фосфорилирования.

Используйте подходящую стратегию охлаждения, например:

• предварительно охлажденный буфер для лизиса
• предварительно охлажденные микропланшеты
• перерывы на охлаждение между интервалами ультразвуковой обработки
• внешнее охлаждение ультразвуковой платформы, если это необходимо

Цель состоит в том, чтобы поддерживать образец в достаточно холодном состоянии, чтобы предотвратить денатурацию белков, инактивацию ферментов, деградацию РНК и термоиндуцированные изменения в составе образца.

5. Обработать суспензию дрожжей ультразвуком

Поместите герметичную планшетную пробирку в ультразвуковой аппарат для микропланшетов Hielscher UIP400MTP или UIP550MTP и выберите программу импульсной обработки ультразвуком. Рекомендуется использовать импульсный режим, поскольку он обеспечивает механическое разрушение в фазах включения и отвод тепла в фазах выключения.
В качестве отправной точки для лизиса дрожжевых клеток:

В случае высокорезистентных дрожжевых суспензий, плотной биомассы P. pastoris или сложной экстракции рекомбинантных белков постепенно увеличивайте совокупное время включения. Для термочувствительных белков или ферментных анализов используйте более короткие импульсы, более длительные паузы охлаждения и более низкую начальную амплитуду.

Высокопроизводительный лизис дрожжей в многолуночных планшетах с использованием UIP400MTP

6. Очистить лизат

После ультразвуковой обработки центрифугируйте микропланшет или перенесите образцы в пробирки для центрифугирования. Удалите клеточные остатки путем центрифугирования при подходящей скорости и температуре. Соберите супернатант для последующего анализа.

В зависимости от области применения лизат можно использовать для:

• Количественное определение белка
• определение ферментативной активности
• SDS-PAGE и вестерн-блоттинг
• ИФА и иммуноанализы
• Протеомика с использованием LC-MS/MS
• анализ метаболитов
• Очистка ДНК или РНК

7. Оптимизировать и задокументировать метод

Для обеспечения воспроизводимости лизиса дрожжей необходимо зафиксировать все значимые параметры, включая штамм, условия культивирования и оптическую плотность (OD)₆₀₀, масса мокрой клетки, состав буфера, тип пластины, объем образца, амплитуда, цикл импульса, суммарное время включения, метод охлаждения и конечная температура образца.
Если ультразвуковой аппарат Hielscher оснащен функцией автоматической регистрации данных, данные о технологическом процессе можно использовать для ведения документации, разработки методов, масштабирования и контроля качества.

Советы по оптимизации лизиса дрожжей

Для максимального выделения белка используйте густые дрожжевые суспензии, высокую интенсивность ультразвука и достаточное совокупное время включения. При работе с чувствительными белками уменьшите амплитуду, увеличьте продолжительность пауз для охлаждения и поддерживайте пластину в охлаждённом состоянии на протяжении всего цикла.
Если лизис неполный, постепенно увеличивайте время ультразвуковой обработки, попробуйте провести ферментативную предварительную обработку, снизьте вязкость образца или оптимизируйте буфер. Если белки разлагаются или теряют активность, улучшите охлаждение, сократите интервалы включения (ON), добавьте ингибиторы и убедитесь, что система детергентов совместима с целевым белком.
Поскольку штаммы дрожжей существенно различаются по структуре клеточной стенки, фазе роста, системе экспрессии и плотности биомассы, рекомендуется использовать краткую матрицу оптимизации. Например, протестируйте три амплитуды, два цикла импульсов и два значения общего времени включения, а затем оцените эффективность лизиса и сохранность белка.

Преимущества ультразвуковых аппаратов Hielscher для микропланшетов при лизисе дрожжей

Ультразвуковые аппараты Hielscher для микропланшетов идеально подходят для лабораторий, которым требуется обеспечить воспроизводимый лизис большого количества образцов. Они позволяют избавиться от медленной обработки образцов по одному, характерной для ультразвуковой обработки с использованием зонда, и снижают вариабельность, вызванную ручным позиционированием зонда, глубиной погружения и различиями в обращении с образцами.

Ключевые преимущества включают:

• Высокопроизводительная обработка: Проведите ультразвуковую обработку нескольких образцов дрожжей одновременно в микропланшетах или совместимых штативах для образцов.
• Условия, при которых можно воспроизвести результат: Одинаковые условия ультразвуковой обработки во всех лунках для получения однородных и сопоставимых результатов лизиса.
• Отсутствие перекрестного загрязнения зондами: Во время ультразвуковой обработки пробы остаются герметично закрытыми, что позволяет сократить перенос загрязнений и количество этапов очистки.
• Подходит для устойчивых клеток: Ультразвук высокой интенсивности способствует разрушению клеточных стенок дрожжей.
• Эффективный рабочий процесс: Идеально подходит для скрининга штаммов, клонов, условий экспрессии и буферов для лизиса.
• Эффективный рабочий процесс: Программируемые настройки, автоматическая регистрация данных и возможность использования в системах лабораторной автоматизации.

Применение в дрожжевой биотехнологии и научных исследованиях в области биологических наук

Ультразвуковой лизис дрожжей в микропланшетах способствует реализации множества исследовательских и скрининговых рабочих процессов. При экспрессии рекомбинантных белков клоны P. pastoris и S. cerevisiae можно подвергать лизису параллельно для сравнения уровней экспрессии или ферментативной активности. В системной биологии и омиках стандартизированный лизис повышает сопоставимость результатов при различных условиях. В микробиологии ультразвуковая обработка позволяет быстро получать лизаты из различных штаммов, сред или после воздействия стрессовых факторов.
К типичным областям применения относятся:

• экстракция дрожжевого белка
• скрининг рекомбинантных белков
• скрининг ферментативной активности
• отбор клонов после трансформации
• оптимизация ферментации
• подготовка образцов для протеомики
• подготовка проб для метаболомики
• исследования разрушения клеточной стенки
• микробиологические анализы с высокой пропускной способностью

Надежный лизис дрожжей начинается с контролируемой ультразвуковой обработки

Лизис дрожжей может затрудняться при увеличении количества образцов, однако ультразвуковые устройства для микропланшетов компании Hielscher позволяют сделать этот процесс более быстрым, чистым и воспроизводимым. Модели UIP400MTP и UIP550MTP дают исследователям возможность обрабатывать целые планшеты в заданных ультразвуковых условиях, что повышает пропускную способность и сокращает объем ручной работы.
Для микробиологов, молекулярных биологов, исследователей белков и биотехнологических лабораторий ультразвуковая обработка микропланшетов является эффективным инструментом для выделения внутриклеточных компонентов дрожжей с высокой эффективностью и воспроизводимостью результатов.

Литература / Литература