Протокол протеомики: бесконтактная ультразвуковая обработка улучшает подготовку пептидных образцов для масс-спектрометрии

Протеомика «снизу вверх» стала краеугольным камнем современных исследований в области обнаружения биомаркеров, структурной биологии и клинической диагностики. Благодаря расщеплению белков на пептиды перед анализом с помощью масс-спектрометрии (МС) исследователи могут добиться более полного охвата последовательностей и более надежного количественного анализа. Однако подготовка биологических образцов высокой сложности к МС по-прежнему остается технически сложной задачей. Недавние методологические достижения демонстрируют, как контролируемая ультразвуковая обработка – в частности, с бесконтактным ультразвуковым аппаратом VialTweeter Multi-Tube и ультразвуковым аппаратом для микропланшетов UIP400MTP – может значительно оптимизировать этот рабочий процесс, повысить воспроизводимость результатов и предотвратить типичные «узкие места» в работе оборудования.
Ознакомьтесь с подробным протоколом подготовки образцов для получения пептидов, подходящих по размеру для анализа методом масс-спектрометрии.

Кому следует использовать бесконтактную ультразвуковую обработку для подготовки пептидных образцов?

• Протеомика «снизу вверх» & Discovery Labs: Исследователи, готовящие образцы высокой сложности для работ с использованием методов ЖХ-МС или MALDI, которым требуется стабильное извлечение пептидов с высоким выходом из различных биологических матриц.
• S-Trap™ & Блокировка пользователей: Команды, использующие очистку с помощью микроколонок, которым требуется контролируемое расщепление ДНК для предотвращения забивания колонок и обеспечения бесперебойной загрузки образцов и их переваривания.
• клинический & Группы трансляционных исследований: Лаборатории, занимающиеся обработкой тканей, клеток, плазмы, сыворотки или спинномозговой жидкости, где решающее значение имеют воспроизводимость результатов от партии к партии и сохранность образцов.
• Количественный & Целевые группы в MS Teams: Лаборатории, проводящие тщательные сравнительные исследования, в которых использование ультразвуковых аппаратов с многоразовыми зондами создает риск перекрестного загрязнения, что может повлиять на точность количественного определения пептидов с низкой концентрацией.
• Основные лабораторные комплексы & Операции с высокой пропускной способностью: Группы, одновременно обрабатывающие несколько биологических повторов, для которых удобно использовать многопробирковую ультразвуковую обработку в закрытых пробирках с помощью устройства VialTweeter, что позволяет избежать очистки зонда, сократить время ручной работы и обеспечить соблюдение асептических условий.
• Родительское собрание & Исследователи структурных белков: Исследователи, которым требуется щадящая обработка с контролем температуры для сохранения лабильных модификаций и обеспечения максимального охвата последовательности во время лизиса и гомогенизации клеток.

Обзор протокола: от тканей и клеток до пептидов, готовых к МС-анализу

Широко применяемый «нисходящий» протокол протеомики, описанный Войткевичем и др., представляет собой надежный и масштабируемый метод подготовки пептидных образцов из различных биологических матриц. Начиная с 50–100 мг быстрозамороженной ткани или 1–20 миллионов клеток, данный протокол использует технологию улавливания суспензии (S-Trap™) для эффективного удаления детергентов, солей и примесей перед ферментативным расщеплением.
После лизиса, количественного определения белков, восстановления и алкилирования образец подкисляют и загружают в центрифужную колонку S-Trap™, где происходит расщепление трипсином и лизоцимом. Полученные пептиды элюируются, высушиваются и подвергаются анализу методом ЖХ-МС. При применении к 50 мг ткани сердца человека данный рабочий процесс стабильно дает количество пептидов, достаточное для 30–40 инъекций, позволяя идентифицировать более 4 000 уникальных белков за один прогон. Хотя химические этапы и очистка с использованием колонок четко определены, успех всего рабочего процесса в значительной степени зависит от этапов первоначального физического разрушения ткани и работы с ДНК.
В протоколе рекомендуется использовать многопробирковый ультразвуковой лизатор VialTweeter для лизиса клеток и фрагментации ДНК с помощью ультразвука – Оба этапа имеют решающее значение для анализа пептидов.

Ультразвуковой лизис клеток и тканей для экстракции белков

В рабочем процессе «низ-вверх» протеомики ультразвуковая обработка является ключевым этапом лизиса клеточных образцов для извлечения белков с целью последующего масс-спектрометрического анализа. После добавления буфера для лизиса клеток с SDS к клеточному осадку образцы подвергаются ультразвуковой обработке с использованием многопробирного ультразвукового аппарата VialTweeter. В протоколе используются пробирки для микроцентрифуги объемом 1,5 мл; предусмотрено проведение обработки ультразвуком при мощности 30 % в режиме «10 секунд включения — 10 секунд выключения», который повторяется 3 раза. После выдержки в течение 1 минуты цикл повторяется еще два раза. Образцы постоянно охлаждаются льдом.
Этот процесс не только способствует разрушению клеток, но и необходим, в частности, для измельчения геномной ДНК, высвобождающейся в ходе лизиса. Эффективное измельчение ДНК имеет решающее значение для снижения вязкости образца и предотвращения забивания колонок S-Trap™, что обеспечивает оптимальный выход белка и надежное последующее расщепление пептидов.

Решающая роль ультразвукового измельчения ДНК

Одной из наиболее частых неисправностей в рабочих процессах, основанных на использовании S-Trap™, является забивание колонки, которое почти исключительно вызвано высокомолекулярной геномной ДНК, высвобождающейся в процессе гомогенизации клеток или тканей. Неразрушенная ДНК резко повышает вязкость образца, удерживает пептиды и блокирует микропористый сорбционный слой S-Trap™.
Ультразвуковая обработка решает эту проблему путем механического дробления ДНК на мелкие растворимые фрагменты. Благодаря применению контролируемой акустической энергии устройство VialTweeter эффективно расщепляет нуклеиновые кислоты, не вызывая чрезмерного нагрева и не вводя посторонних примесей. Такое снижение вязкости обеспечивает плавную загрузку образца, стабильную скорость прохождения и непрерывную кинетику расщепления.

Оптимизированные параметры ультразвуковой обработки VialTweeter

В протоколе описан режим ультразвуковой обработки, обеспечивающий высокую воспроизводимость результатов и оптимизированный для сохранения целостности биологических образцов и совместимости с последующим масс-спектрометрическим анализом. Для образцов в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл при использовании бесконтактного блочного ультразвукового аппарата Hielscher VialTweeter следующие параметры обеспечивают лизис и оптимальное расщепление ДНК при сохранении структуры белков:

• Амплитуда: 30 % мощности
• Режим работы: 10 секунд «ВКЛ» / 10 секунд «ВЫКЛ»
• Продолжительность: 3 цикла (10 секунд «ВКЛ.» / 10 секунд «ВЫКЛ.») → 1 минута отдыха на льду → повторить ещё 2 раза
• Контроль температуры: во время обработки образцы помещаются на лед для предотвращения термической денатурации и преждевременной активации ферментов

Данный метод импульсной ультразвуковой обработки предотвращает локальное перегревание, сводит к минимуму окисление пептидов и обеспечивает равномерное акустическое воздействие на все пробирки. Конструкция с закрытыми трубками также исключает необходимость очистки зонда между образцами, что значительно сокращает время ручной работы и снижает влияние фактора оператора.

Основные преимущества для современных рабочих процессов в области протеомики

Внедрение VialTweeter в ваш рабочий процесс «снизу вверх» в протеомике дает ряд эксплуатационных и научных преимуществ:

1. Постоянная фрагментация ДНК: Равномерное распределение акустической энергии по всем флаконам обеспечивает воспроизводимое снижение вязкости и предотвращает колебания в загрузке S-Trap™ от партии к партии.
2. Сохранение лабильных модификаций: Обработка при низкой температуре в ледяной бане позволяет сохранить посттрансляционные модификации (ПТМ) и предотвратить термоиндуцированную агрегацию белков во время лизиса клеток.
3. Оптимизация последующей обработки: Лизаты, обработанные с помощью VialTweeter, можно непосредственно осветлить центрифугированием и провести количественный анализ без дополнительных этапов очистки, что ускоряет процесс перехода к расщеплению с помощью S-Trap™.
4. Масштабируемость & Гибкость: Одни и те же настройки ультразвуковой обработки применимы как к тканевым образцам высокой сложности, так и к клеточным суспензиям, что обеспечивает поддержку рабочих процессов в области исследовательской протеомики, целевого количественного анализа и гликопротеомики. Ультразвуковые аппараты Hielscher для микропланшетов позволяют легко масштабировать процесс для обработки большого количества образцов в многолуночных планшетах.

Литература / Литература