Протокол протеомики: бесконтактная обработка ультразвуком улучшает подготовку пептидных образцов для MS
Протеомика «снизу вверх» стала краеугольным камнем современного поиска биомаркеров, структурной биологии и клинической диагностики. Расщепляя белки до пептидов перед масс-спектрометрическим (MS) анализом, исследователи могут добиться более полного покрытия последовательностей и более надёжного количественного определения. Однако подготовка биологических образцов высокой сложности для MS остаётся технически сложной задачей. Последние методические достижения показывают, как контролируемая ультразвуковая обработка – в частности, с помощью бесконтактного ультразвукового устройства VialTweeter для нескольких пробирок и ультразвукового устройства UIP400MTP для микропланшетов – может значительно упростить этот рабочий процесс, повысить воспроизводимость и предотвратить распространённые проблемы, ограничивающие работу оборудования.
Ознакомьтесь с подробным протоколом подготовки образцов для получения пептидов подходящего размера для анализа методом MS.
Кому следует использовать бесконтактную обработку ультразвуком для подготовки пептидных образцов?
- Лаборатории протеомики «снизу вверх» и поисковых исследований: Исследователи, подготавливающие образцы высокой сложности для рабочих процессов LC-MS или MALDI, которым требуется стабильное извлечение пептидов с высоким выходом из различных биологических матриц.
- Пользователи S-Trap™ и технологии улавливания в суспензии: Группы, использующие очистку на микроколонках, которым необходима контролируемая сдвиговая фрагментация ДНК для предотвращения засорения колонок и обеспечения беспрепятственной загрузки и расщепления образцов.
- Группы клинических и трансляционных исследований: Лаборатории, обрабатывающие ткани, клетки, плазму, сыворотку или спинномозговую жидкость, для которых критически важны воспроизводимость между партиями и сохранность образцов.
- Группы количественной и таргетной MS: Лаборатории, проводящие строго контролируемые сравнительные исследования, в которых зондовые ультразвуковые устройства создают риск перекрёстного загрязнения, способного нарушить количественное определение пептидов с низким содержанием.
- Центры коллективного пользования и подразделения высокопроизводительной обработки: Группы, одновременно обрабатывающие несколько биологических повторностей и получающие преимущества от блочной обработки ультразвуком нескольких закрытых пробирок с помощью VialTweeter, которая устраняет необходимость очистки зонда, сокращает время ручной работы и поддерживает асептические условия.
- Исследователи посттрансляционных модификаций и структуры белков: Исследователи, которым необходима щадящая обработка с контролем температуры для сохранения лабильных модификаций и максимального покрытия последовательностей при лизисе клеток и гомогенизации.
Ультразвуковое устройство «VialTweeter» для бесконтактной подготовки нескольких образцов в герметично закрытых флаконах для протеомики
Обзор протокола: от тканей и клеток к пептидам, готовым для MS
Широко применяемый рабочий процесс протеомики «снизу вверх», описанный Wojtkiewicz et al., представляет собой надёжный, масштабируемый метод подготовки пептидных образцов из различных биологических матриц. При исходном количестве 50–100 mg быстрозамороженной ткани или 1–20 миллионов клеток протокол включает технологию улавливания в суспензии (S-Trap™) для эффективного удаления детергентов, солей и загрязняющих веществ перед ферментативным расщеплением.
После лизиса, количественного определения белка, восстановления и алкилирования образец подкисляют и загружают на центрифужную колонку S-Trap™, где происходит расщепление трипсином/lysC. Полученные пептиды элюируют, высушивают и подвергают анализу LC-MS. При использовании 50 mg ткани сердца человека этот рабочий процесс стабильно обеспечивает достаточное количество пептидов для 30–40 инъекций, позволяя идентифицировать более 4 000 уникальных белков за один анализ. Хотя химические этапы и очистка на колонках чётко определены, успех всего процесса в значительной степени зависит от начальных этапов физического разрушения и обработки ДНК.
Протокол рекомендует использовать ультразвуковое устройство VialTweeter для нескольких пробирок для лизиса клеток и сдвиговой фрагментации ДНК при обработке ультразвуком – оба этапа критически важны для анализа пептидов.
VialTweeter обрабатывает ультразвуком герметично закрытые пробирки Eppendorf объёмом 1,0, 1,5 и 2,0mL, а также различные флаконы NUNC
Ультразвуковой лизис клеток и тканей для извлечения белков
В рабочем процессе протеомики «снизу вверх» обработка ультразвуком является ключевым этапом лизиса клеточных образцов для извлечения белков с целью последующего масс-спектрометрического анализа. После добавления буфера для лизиса клеток с SDS к клеточному осадку образцы подвергают ультразвуковой обработке с помощью устройства VialTweeter для нескольких пробирок. В протоколе используются микроцентрифужные пробирки объёмом 1,5 mL и предписывается работа ультразвукового устройства при мощности 30% с включением на 10 секунд и выключением на 10 секунд в течение 3 циклов. После ожидания в течение 1 минуты цикл повторяют ещё два раза. Образцы непрерывно охлаждают льдом.
Этот процесс не только способствует разрушению клеток, но и необходим именно для сдвиговой фрагментации геномной ДНК, высвобождающейся при лизисе. Эффективная сдвиговая фрагментация ДНК крайне важна для снижения вязкости образца и предотвращения засорения колонок S-Trap™, что обеспечивает оптимальное извлечение белков и надёжное последующее расщепление до пептидов.
Критически важная роль ультразвуковой сдвиговой фрагментации ДНК
Одной из наиболее частых проблем в рабочих процессах на основе S-Trap™ является засорение колонок, почти исключительно вызываемое высокомолекулярной геномной ДНК, высвобождающейся при гомогенизации клеток или тканей. Неповреждённая ДНК резко повышает вязкость образца, удерживает пептиды и блокирует микропористый слой сорбента S-Trap™.
Ультразвуковая обработка решает эту проблему, механически фрагментируя ДНК на небольшие растворимые фрагменты. Благодаря контролируемой акустической энергии VialTweeter эффективно осуществляет сдвиговую фрагментацию нуклеиновых кислот без чрезмерного нагрева и внесения посторонних загрязняющих веществ. Такое снижение вязкости обеспечивает беспрепятственную загрузку образцов, стабильный расход через колонку и непрерывную кинетику расщепления.
Оптимизированные параметры обработки ультразвуком с помощью VialTweeter
Протокол предусматривает высоковоспроизводимый режим обработки ультразвуком, оптимизированный для сохранности биологических образцов и совместимости с последующим анализом методом MS. Для образцов в микроцентрифужных пробирках объёмом 1,5mL при использовании бесконтактного блочного ультразвукового устройства Hielscher VialTweeter следующие параметры обеспечивают лизис и оптимальную сдвиговую фрагментацию ДНК с сохранением структуры белков:
- Амплитуда: мощность 30%
- Схема цикла: 10 секунд ВКЛ. / 10 секунд ВЫКЛ.
- Продолжительность: 3 цикла (10 секунд ВКЛ./10 секунд ВЫКЛ.) → 1 минута покоя на льду → повторить ещё 2 раза
- Контроль температуры: во время обработки образцы помещают на лёд для предотвращения термической денатурации и преждевременной ферментативной активности
Такой подход с импульсной обработкой ультразвуком предотвращает локальный перегрев, сводит к минимуму окисление пептидов и обеспечивает равномерное акустическое воздействие на все флаконы. Конфигурация с закрытыми пробирками также устраняет необходимость очистки зонда между образцами, резко сокращая время ручной работы и вариабельность, связанную с оператором.
Ключевые преимущества для современных рабочих процессов протеомики
Включение VialTweeter в ваш рабочий процесс протеомики «снизу вверх» даёт ряд эксплуатационных и научных преимуществ:
- Стабильная фрагментация ДНК: Равномерная передача акустической энергии всем флаконам обеспечивает воспроизводимое снижение вязкости и предотвращает вариабельность загрузки S-Trap™ между партиями.
- Сохранение лабильных модификаций: Низкотемпературная обработка в ледяной бане защищает посттрансляционные модификации (PTM) и предотвращает вызванную нагревом агрегацию белков при лизисе клеток.
- Упрощение последующей обработки: Лизаты, обработанные с помощью VialTweeter, можно непосредственно осветлять центрифугированием и подвергать количественному анализу без дополнительных этапов очистки, ускоряя переход к расщеплению на S-Trap™.
- Масштабируемость и гибкость: Одни и те же настройки обработки ультразвуком применимы как к тканевым образцам высокой сложности, так и к клеточным суспензиям, поддерживая рабочие процессы поисковой протеомики, таргетного количественного определения и гликопротеомики. Ультразвуковые устройства Hielscher для микропланшетов позволяют легко масштабировать обработку до большого количества образцов в многолуночных планшетах.
Бесконтактное ультразвуковое устройство VialTweeter для нескольких пробирок может работать в холодильных шкафах
Ультразвуковые устройства для подготовки образцов для протеомики
Подготовка высококачественных пептидных образцов для масс-спектрометрии требует большего, чем эффективный лизис – необходимы точный контроль сдвиговой фрагментации ДНК и температуры, а также предотвращение загрязнения. Включив Hielscher VialTweeter в свой рабочий процесс протеомики «снизу вверх», вы можете устранить засорение S-Trap™, обеспечить воспроизводимое извлечение белков и поддерживать чистоту, необходимую для чувствительного анализа методом MS. Независимо от того, обрабатываете ли вы ткани человека, культивируемые клетки или сложные лизаты, ультразвуковая обработка в блоке обеспечивает надёжность, масштабируемость и контроль процесса, необходимые современным протеомным лабораториям.
Для увеличения количества обрабатываемых образцов воспользуйтесь сфокусированными бесконтактными ультразвуковыми устройствами Hielscher для микропланшетов моделей UIP400MTP и UIP550MTP! Обрабатывайте любой стандартный многолуночный планшет для высокопроизводительной протеомики!
Обработка в закрытых пробирках в сравнении с традиционными зондовыми ультразвуковыми устройствами
Традиционно исследователи использовали зондовые ультразвуковые устройства с прямым контактом для сдвиговой фрагментации ДНК. Несмотря на эффективность, зондовые системы создают ряд критических ограничений в рабочих процессах протеомики:
- Риск перекрёстного загрязнения: Повторное использование зонда для нескольких образцов приводит к переносу аэрозолей и внесению загрязняющих веществ из других образцов, искажающих результаты количественной MS.
- Потеря образца: Прямое погружение может привести к разбрызгиванию, испарению и прилипанию ценных пептидов к поверхности зонда.
- Очистка: Тщательная деконтаминация зонда между обработками требует много времени и часто бывает неполной, что снижает надёжность исследований белков с низким содержанием.
Блочное ультразвуковое устройство VialTweeter обрабатывает образцы полностью внутри герметично закрытых микроцентрифужных пробирок. Такая конструкция закрытой системы исключает контакт зонда с образцом, предотвращает образование аэрозолей и поддерживает строгие асептические условия на протяжении всей гомогенизации и лизиса. Для лабораторий, обрабатывающих тканевые лизаты высокой сложности или несколько клеточных линий, это означает более чистые данные MS, более высокий выход пептидов и более надёжные биологические повторности.
Масштабирование до высокопроизводительной подготовки образцов в многолуночных планшетах
С помощью ультразвуковых устройств для микропланшетов моделей UIP400MTP и UIP550MTP, обработку в пробирках можно легко масштабировать до высокопроизводительной обработки образцов в любом стандартном многолуночном планшете.
Ультразвуковое устройство UIP400MTP для многолуночных планшетов для высокопроизводительного извлечения белков из образцов
Часто задаваемые вопросы об обработке ультразвуком для подготовки пептидных образцов
Почему перед обработкой пептидных образцов на S-Trap™ необходима обработка ультразвуком?
Обработка ультразвуком необходима для сдвиговой фрагментации высокомолекулярной геномной ДНК, высвобождающейся при лизисе клеток или тканей. Неповреждённая ДНК резко повышает вязкость образца, что может привести к засорению микроколонки S-Trap™ и удержанию пептидов, значительно снижая выход и совместимость с MS.
Как блочное ультразвуковое устройство VialTweeter улучшает подготовку образцов по сравнению с традиционными зондовыми ультразвуковыми устройствами?
В отличие от зондовых ультразвуковых устройств с прямым контактом, которые требуют тщательной очистки между обработками и создают риск переноса аэрозолей, VialTweeter обрабатывает образцы полностью внутри герметично закрытых флаконов и микроцентрифужных пробирок. Такая конструкция с закрытыми пробирками исключает перекрёстное загрязнение, предотвращает потерю образцов и поддерживает строгие асептические условия на протяжении всей гомогенизации и лизиса клеток.
Каковы оптимальные параметры обработки ультразвуком для подготовки образцов для протеомики?
Для биологических образцов, таких как клетки и ткани, рекомендуемый протокол предусматривает использование ультразвукового устройства VialTweeter при мощности 30% с циклом 10 секунд включения / 10 секунд выключения, повторяемым 3 раза. Во время обработки образцы следует держать на льду, а при обработке ≥5 миллионов клеток цикл повторяют ещё дважды. (см. Wojtkiewicz et al., 2021)
Что делать, если моя колонка S-Trap™ засоряется при загрузке образца?
Засорение колонки обычно вызвано высокой вязкостью, обусловленной ДНК, или недостаточным осветлением. Чтобы решить эту проблему, тщательно центрифугируйте лизат перед пипетированием и убедитесь, что ДНК достаточно фрагментирована сдвиговым воздействием при обработке ультразвуком.
Какие преимущества даёт бесконтактная обработка ультразвуком для рабочих процессов количественной протеомики?
В количественных исследованиях даже следовое перекрёстное загрязнение между образцами может исказить измерения пептидов с низким содержанием. Обработка нескольких флаконов в закрытом виде с помощью VialTweeter исключает введение зонда, обеспечивает воспроизводимость между партиями и сохраняет целостность образцов для точного сравнительного анализа.
Какого выхода белка и глубины анализа методом MS можно ожидать от этого протокола?
При исходном количестве 50 mg ткани сердца человека или 5 миллионов клеток рабочий процесс S-Trap™ обычно обеспечивает достаточное количество пептидов для 30–50 инъекций LC-MS, стабильно позволяя идентифицировать более 4 000 уникальных белков за один анализ. (см. Wojtkiewicz et al., 2021)
Литература / Ссылки
- FactSheet VialTweeter — Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation — English version — Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation — English version — Hielscher Ultrasonics
- Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
- Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
- Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.
Hielscher Ultrasonics поставляет мощные бесконтактные ультразвуковые устройства для подготовки образцов и клинического анализа. Ультразвуковое устройство UIP400MTP для многолуночных планшетов, VialTweeter, CupHorn и проточное ультразвуковое устройство GDmini2 обрабатывают образцы без контакта с ними.