Ультразвуковая обработка микропланшетов в методе «шотган»-протеомики – Рекомендации по применению

Протеомика методом «шотган» зависит от эффективной и воспроизводимой подготовки образцов, позволяющей преобразовать сложный биологический материал в пептиды, готовые к анализу методом ЖХ-МС/МС. Ультразвуковой процессор для микропланшетов UIP400MTP поддерживает этот процесс, обеспечивая стандартизированную параллельную обработку ультразвуком образцов малого объема, что помогает лабораториям улучшить качество разрушения, экстракции и повторного растворения в рабочих процессах на основе микропланшетов. В данном приложении описывается, как UIP400MTP можно интегрировать в процесс подготовки проб для протеомики, на примере лабораторно проверенной методики с использованием внеклеточных везикул, опубликованной в исследованиях PLA2G12A/Th17.

Ультразвуковая обработка микропланшетов для повышения воспроизводимости метода «шотган»-протеомики

Для исследователей в области протеомики воспроизводимая подготовка образцов имеет решающее значение для получения высококачественных данных LC-MS/MS. Ультразвуковой процессор для микропланшетов UIP400MTP обеспечивает стандартизированную параллельную обработку ультразвуком в рабочих процессах с использованием микропланшетов, а также в малообъемных и высокопроизводительных рабочих процессах.

Это особенно полезно для лабораторий, занимающихся:

• Крупные наборы образцов, требующие единообразной обработки во многих лунках
• Материал с ограниченным объемом входных данных, при работе с которым необходимо свести к минимуму потери образцов и их изменчивость
• Образцы с высоким содержанием липидов, такие как внеклеточные везикулы
• Сложные биологические препараты, требующие эффективного разрушения, экстракции или повторной солюбилизации
• Сравнительная протеомика методом «шотган», при которой крайне важна воспроизводимость результатов в различных условиях и при повторных измерениях

Благодаря включению ультразвуковой обработки микропланшетов перед гидролизом исследователи могут улучшить подготовку образцов для:

• Экстракция и повторная солюбилизация белка
• Переваривание трипсином/Lys-C
• Сбор данных с помощью нано-ЖХ/МС/МС
• Количественный анализ с помощью методов нижестоящей протеомики

 

Уверенно масштабируйте процесс подготовки образцов для протеомики!
Узнайте, как ультразвуковая обработка микропланшетов помогает снизить вариабельность, связанную с ручным выполнением операций, улучшить измельчение образцов и подготовить сложные биологические образцы для надежного анализа методом ЖХ-МС/МС.

Запрос информации


Адрес электронной почты (обязательно)


Продукт или область интересов



Я согласен с Политикой конфиденциальности









Запросить информацию

Ультразвуковая обработка микропланшетов может быть полезна:

• Базовые лаборатории по протеомике
• Исследовательские лаборатории по электромобилям
• Лаборатории иммунологии и клеточной биологии
• Группы, занимающиеся трансляционными исследованиями
• Команды в области биологических наук, переходящие от подготовки отдельных образцов к рабочим процессам с более высокой пропускной способностью

Высокопроизводительная подготовка образцов для анализа протеома внеклеточных везикул

Что такое «протеомика методом Shotgun»?

Протеомика методом «шотган» стала одной из основных аналитических стратегий для характеристики сложных биологических образцов — от лизатов целых клеток и тканевых экстрактов до очищенных органелл, внеклеточных везикул и клинических образцов с низким содержанием исходного материала. Её основное преимущество заключается в сочетании расщепления белков, жидкостной хроматографии с высоким разрешением в сочетании с тандемной масс-спектрометрией и вычислительного вывода пептидов из белков. Однако качество итогового набора данных протеома определяется задолго до того, как образец попадает в масс-спектрометр. Эффективное разрушение образца, солюбилизация белков, удаление мешающих веществ, воспроизводимое ферментативное расщепление и надежное извлечение пептидов — все это имеет решающее значение для глубины покрытия и надежности количественных результатов.
Для исследователей в области протеомики и лабораторий биологических наук, работающих с ограниченными или ценными образцами, подготовка образцов зачастую становится «узким местом».

Проблемы, связанные с внеклеточными везикулами в протеомике

Например, внеклеточные везикулы (EV) представляют собой особенно сложный класс образцов. Это мембранооболочечные наноразмерные частицы с высоким содержанием липидов, характеризующиеся относительно низким выходом белка и высоким риском переноса липидов, солей, детергентов, сывороточных белков и других компонентов матрицы. Эти особенности могут ухудшать эффективность ферментативного расщепления, хроматографические показатели, стабильность при электрораспылении и идентификацию пептидов. Поэтому рабочий процесс подготовки проб для протеомики EV должен быть достаточно интенсивным, чтобы разрушить структуру везикул и растворить белковый груз, оставаясь при этом совместимым с последующим ферментативным расщеплением и анализом методом LC-MS/MS.
В связи с этим ультразвуковая обработка, совместимая с микропланшетами, представляет собой практичный подход к воспроизводимой и параллельной обработке образцов. Модели ультразвуковых обработчиков для микропланшетов Hielscher UIP400MTP (400 Вт) и UIP550MTP (550 Вт) предназначены для ультразвуковой обработки образцов в многолуночных планшетах и сосудах малого объема, обеспечивая более высокую пропускную способность рабочих процессов по сравнению с традиционными ультразвуковыми обработчиками с одним датчиком. Для протеомических лабораторий этот формат привлекателен тем, что позволяет снизить вариабельность, обусловленную ручным вмешательством, улучшить параллельную обработку нескольких образцов и более органично интегрироваться в конвейеры подготовки образцов на основе микропланшетов.

Пример рабочего процесса

Недавняя разработка протокола протеомического анализа внеклеточных везикул в рамках исследований биологии Th17-клеток, активируемых PLA2G12A, представляет собой полезный, проверенный в лабораторных условиях пример того, как ультразвуковой диффузор для микропланшетов UIP400MTP можно использовать при подготовке образцов для протеомики методом «шотган». В этой серии исследований образцы внеклеточных везикул (EV) обрабатывались для протеомного анализа с использованием обработки метанолом, ультразвуковой обработки на UIP400MTP, центрифугирования, сушки, переваривания трипсином/Lys-C и нанопоточной жидкостной хроматографии (LC) с тандемной масс-спектрометрией высокого разрешения. Эта биологическая работа сначала была представлена в виде препринта на bioRxiv, а затем опубликована в журнале «Cell Reports», где протеомический анализ помог охарактеризовать, как PLA2G12A изменяет белки-груз экзосомы в контексте патогенных Т-клеточных ответов.

Многолуночный планшетный ультразвуковой аппарат UIP400MTP

Почему именно ультразвуковая обработка микропланшетов?
Устройство UIP400MTP позволяет проводить стандартизированную параллельную обработку ультразвуком образцов небольшого объема. Это особенно полезно в тех случаях, когда важны воспроизводимость результатов, небольшой объем вводимого образца и высокая пропускная способность при работе с несколькими образцами.

Контрольный список по контролю качества

• Убедитесь, что во всех образцах введено одинаковое количество белкового эквивалента EV.
• Используйте схемы обработки выборок, основанные на рандомизации или сбалансированности.
• Следует поддерживать постоянными объем метанола, время ультразвуковой обработки, время сушки и объем раствора для разложения.
• Контролируйте выход пептидов и количество идентифицированных белков.
• Проверьте показатель пропущенного расщепления и распределение пептидов по длине.
• Проверить форму хроматографического пика и воспроизводимость времени удержания.
• Включите пустые ячейки для контроля переноса данных.
• В крупных исследованиях следует использовать объединенные пробы для контроля качества.
• Оценить коэффициент вариации повторных измерений.
• Используйте PCA или аналогичные методы для выявления эффектов партии или выбросов.

Рекомендации по ведению протоколов

При публикации или документировании данного рабочего процесса необходимо указывать количество вводимого EV, формат планшета, объем метанола, амплитуду и время ультразвуковой обработки на аппарате UIP400MTP, условия центрифугирования, метод сушки, буфер для переваривания, концентрацию фермента, время переваривания, условия подкисления, платформу LC-MS/MS, режим сбора данных, версию программного обеспечения, базу данных, порог FDR, метод нормализации и статистический рабочий процесс.
Все ультразвуковые устройства для микропланшетов компании Hielscher автоматически записывают важные параметры процесса, такие как амплитуда, продолжительность обработки ультразвуком и температура, с указанием даты и времени в виде файла CSV на встроенную SD-карту. Ведение протоколов данных для обеспечения воспроизводимости и контроля качества ещё никогда не было таким простым!

Подробный анализ исследования: протеомика EV-шотганов в исследовании PLA2G12A

Исследование PLA2G12A представляет собой конкретный пример использования UIP400MTP в рабочем процессе «шотган»-протеомики. Биологическая задача заключалась в том, чтобы выяснить, как секретируемая фосфолипаза PLA2G12A модифицирует внеклеточные везикулы, происходящие из клеток Th17, и тем самым влияет на дифференцировку патогенных Т-клеток. Авторы показали, что PLA2G12A воздействует на мембраны экстрацеллюлярных везикул (EV), приводя к образованию лизофосфолипидов, в том числе 1-олеоил-лизофосфатидилэтаноламина, и что последующая сигнальная передача лизофосфатидной кислоты через LPA2 способствует дифференцировке Th17. Помимо липидной сигнализации в ходе исследований также изучалось содержимое экстрацеллюлярных везикул, включая содержание РНК и белков, благодаря чему протеомика методом «шотган» стала важным компонентом стратегии характеристики.
В рамках рабочего процесса подготовки EV клетки Th17 культивировали в среде, содержащей сыворотку плода крупного рогатого скота, очищенную от экзосом. Супернатанты культивирования сначала центрифугировали для удаления клеток, фильтровали через фильтр 0,22 мкм, концентрировали методом ультрафильтрации/ультрацентрифугирования, промывали, ресуспендировали в PBS и количественно определяли с помощью белкового анализа BCA. Такая предварительная подготовка экзосом (EV) обеспечила возможность переноса в протеомический рабочий процесс определённого количества материала экзосом, эквивалентного определённому количеству белка.
Для протеомного анализа методом «шотган» авторы использовали образцы EV, соответствующие 5 мкг белкового эквивалента. Эти образцы высушили в пробирках для ПЦР, после чего добавили 25 мкл метанола. Затем образцы подвергали ультразвуковой обработке в течение 3 минут с использованием ультразвукового аппарата для микропланшетов UIP400MTP. После ультразвуковой обработки образцы центрифугировали при 4 °C в течение 20 минут при 19 000 × g. После удаления 20 мкл супернатанта образцы центрифугировали до полного высушивания. Затем белки растворяли путем ультразвуковой обработки в 4 мкл раствора трипсина/Lys-C с концентрацией 100 нг/мкл в 50 мМ растворе бикарбоната аммония. Переваривание проводили в течение 2 часов при 37 °C с встряхиванием со скоростью 300 об/мин. Продукт переваривания подкисляли 1 мкл 1,25 %-ной трифторуксусной кислоты и подвергали нанопоточной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией высокого разрешения.
Данный рабочий процесс демонстрирует несколько полезных принципов для протеомики экзосомов с небольшим объемом исходного материала. Во-первых, исходный материал был нормализован по белковому эквиваленту, что важно при сравнении экзосомов от разных генотипов или групп лечения. Во-вторых, перед ультразвуковой обработкой использовался метанол, что способствовало разрушению и экстракции, позволяя при этом избежать применения детергентных систем, которые могут затруднить LC-MS/MS. В-третьих, этап ультразвуковой обработки был кратким и стандартизированным, что позволяет проводить параллельную обработку образцов. В-четвертых, переваривание трипсином/Lys-C осуществлялось в очень небольшом объеме, что снизило степень разбавления и способствовало извлечению пептидов из образцов с низким содержанием. Наконец, прямой переход от этапа переваривания к подкислению и LC-MS/MS позволил свести к минимуму ненужные этапы обработки.
В последующей стадии анализа применялся метод LC-MS/MS, в котором использовалось нанопоточная обратнофазная хроматография в сочетании с масс-спектрометром Q-Exactive HF Orbitrap. Пробы удерживались на предколонке C18, а затем разделялись на аналитической колонке с внутренним диаметром 50 мкм при скорости потока 200 нл/мин и температуре 40 °C. Градиент изменялся от низкого содержания органического растворителя до 35 % растворителя B в течение 60 минут, после чего проводилась промывка растворителем с высоким содержанием органического компонента и повторное уравновешивание. Сбор данных МС осуществлялся в режиме положительных ионов с использованием метода сбора данных, не зависящего от данных (DIA), с коллизионной диссоциацией с более высокой энергией. Исходные файлы DIA анализировали с помощью программы DIA-NN 1.8 с использованием библиотеки спектров, предсказанных in silico.