Обработка ультразвуком в микропланшетах для шотган-протеомики – примечание по применению

Шотган-протеомика зависит от эффективной и воспроизводимой пробоподготовки, позволяющей преобразовать сложный биологический материал в пептиды, готовые к анализу LC-MS/MS. Ультразвуковой аппарат для микропланшетов UIP400MTP поддерживает этот процесс, обеспечивая стандартизированную параллельную обработку ультразвуком образцов малого объёма и помогая лабораториям улучшать разрушение, экстракцию и повторную солюбилизацию в рабочих процессах с использованием микропланшетов. В этом примечании по применению описано, как UIP400MTP можно интегрировать в подготовку образцов для протеомики; в качестве проверенного в лаборатории примера использован опубликованный рабочий процесс обработки внеклеточных везикул из исследований PLA2G12A/Th17.

Обработка ультразвуком в микропланшетах для более воспроизводимой шотган-протеомики

Для исследователей в области протеомики воспроизводимая пробоподготовка имеет решающее значение для получения высококачественных данных LC-MS/MS. Ультразвуковой аппарат для микропланшетов UIP400MTP обеспечивает стандартизированную параллельную обработку ультразвуком в рабочих процессах с использованием планшетов, а также в высокопроизводительных рабочих процессах с образцами малого объёма.

Он особенно полезен для лабораторий, работающих с:

• Большими наборами образцов, требующими одинаковой обработки во множестве лунок
• Материалом в ограниченном исходном количестве, когда необходимо свести к минимуму потери образцов и вариабельность
• Образцами с высоким содержанием липидов, такими как внеклеточные везикулы
• Сложными биологическими препаратами, требующими эффективного разрушения, экстракции или повторной солюбилизации
• Сравнительной шотган-протеомикой, в которой крайне важна воспроизводимость между условиями и повторностями

Включая обработку ультразвуком в микропланшетах перед расщеплением, исследователи могут улучшить подготовленность образцов к:

• Экстракции и повторной солюбилизации белков
• Расщеплению трипсином/Lys-C
• Получению данных методом нано-LC/MS/MS
• Последующему количественному протеомному анализу

Обработка ультразвуком в микропланшетах может быть полезна для:

• Центров коллективного пользования в области протеомики
• Лабораторий исследования внеклеточных везикул
• Лабораторий иммунологии и клеточной биологии
• Групп трансляционных исследований
• Коллективов в области наук о жизни, переходящих от подготовки отдельных образцов к рабочим процессам с более высокой производительностью

Высокопроизводительная пробоподготовка для анализа протеома внеклеточных везикул

Что такое шотган-протеомика?

Шотган-протеомика стала одной из основных аналитических стратегий для характеристики сложных биологических образцов: от лизатов целых клеток и тканевых экстрактов до очищенных органелл, внеклеточных везикул и клинических образцов в малом исходном количестве. Её основное преимущество заключается в сочетании расщепления белков, жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией высокого разрешения и вычислительного определения белков по пептидам. Однако качество итогового набора протеомных данных определяется задолго до того, как образец попадает в масс-спектрометр. Эффективное разрушение образца, солюбилизация белков, удаление мешающих веществ, воспроизводимое ферментативное расщепление и надёжное извлечение пептидов имеют решающее значение для глубины покрытия и надёжности количественных результатов.
Для исследователей в области протеомики и лабораторий наук о жизни, работающих с ограниченным количеством образцов или с ценными образцами, пробоподготовка часто становится узким местом.

Сложности работы с внеклеточными везикулами в протеомике

Например, внеклеточные везикулы (EV) представляют собой особенно сложный класс образцов. Это ограниченные мембраной наноразмерные частицы с высоким содержанием липидов, относительно низким выходом белка и высокой вероятностью переноса липидов, солей, детергентов, сывороточных белков и других компонентов матрицы на последующие этапы. Эти особенности могут отрицательно влиять на эффективность расщепления, характеристики хроматографического разделения, стабильность электрораспыления и идентификацию пептидов. Поэтому рабочий процесс пробоподготовки для протеомики EV должен быть достаточно эффективным для разрушения везикулярных структур и солюбилизации содержащихся в них белков, сохраняя при этом совместимость с последующим ферментативным расщеплением и анализом LC-MS/MS.
В этом контексте обработка ультразвуком, совместимая с микропланшетами, представляет собой практический подход к воспроизводимой параллельной обработке образцов. Модели ультразвуковых аппаратов для микропланшетов Hielscher UIP400MTP (400 W) и UIP550MTP (550 W) предназначены для обработки ультразвуком образцов в многолуночных планшетах и ёмкостях малого объёма, обеспечивая более высокую производительность рабочих процессов по сравнению с обычными однозондовыми ультразвуковыми аппаратами. Для протеомных лабораторий этот формат привлекателен тем, что он может уменьшить вариабельность ручных операций, улучшить параллельную обработку нескольких образцов и более естественно интегрироваться в последовательности пробоподготовки с использованием планшетов.

Пример рабочего процесса

Недавний рабочий процесс протеомики внеклеточных везикул в исследованиях биологии клеток Th17, обусловленной PLA2G12A, представляет собой полезный, проверенный в лаборатории пример того, как ультразвуковой аппарат для микропланшетов UIP400MTP можно включить в подготовку образцов для шотган-протеомики. В этой серии исследований образцы EV подготавливали к анализу протеома с использованием обработки метанолом, обработки ультразвуком с помощью UIP400MTP, центрифугирования, высушивания, расщепления трипсином/Lys-C и жидкостной хроматографии с нанопотоком (LC), сопряжённой с тандемной масс-спектрометрией высокого разрешения (MS). Результаты биологических исследований были опубликованы в 2026 году Mochizuki-Ono и соавторами; протеомный анализ помог охарактеризовать, как PLA2G12A изменяет белковое содержимое EV в контексте патогенных Т-клеточных ответов.

Ультразвуковой аппарат для многолуночных планшетов UIP400MTP

Зачем нужна обработка ультразвуком в микропланшетах?
UIP400MTP обеспечивает стандартизированную параллельную обработку ультразвуком образцов малого объёма. Это полезно, когда важны воспроизводимость, малое исходное количество образца и производительность обработки нескольких образцов.


Контрольный список для контроля качества

• Подтвердите одинаковое исходное количество EV в белковом эквиваленте для всех образцов.
• Используйте рандомизированные или сбалансированные схемы размещения образцов при обработке.
• Поддерживайте одинаковыми объём метанола, время обработки ультразвуком, время высушивания и объём раствора для расщепления.
• Контролируйте выход пептидов и общее количество идентифицированных белков.
• Проверяйте долю пропущенных сайтов расщепления и распределение длин пептидов.
• Проверяйте форму хроматографических пиков и воспроизводимость времени удерживания.
• Включайте холостые пробы для контроля переноса между образцами.
• Используйте объединённые образцы контроля качества для более крупных исследований.
• Оценивайте коэффициент вариации между повторностями.
• Используйте PCA или сходные методы для выявления эффектов партий или образцов-выбросов.

Рекомендации по документированию

При публикации или документировании этого рабочего процесса укажите исходное количество EV, формат планшета, объём метанола, амплитуду и время обработки ультразвуком с помощью UIP400MTP, условия центрифугирования, метод высушивания, буфер для расщепления, концентрацию ферментов, время расщепления, условия подкисления, платформу LC-MS/MS, режим получения данных, версию программного обеспечения, базу данных, пороговое значение FDR, метод нормализации и рабочий процесс статистического анализа.
Все ультразвуковые аппараты для микропланшетов Hielscher автоматически записывают важные параметры процесса, такие как амплитуда, продолжительность обработки ультразвуком и температура, с отметкой даты и времени в виде файла CVS на встроенную SD-карту. Документирование данных для обеспечения воспроизводимости и контроля качества ещё никогда не было таким простым!

Исследование в деталях: шотган-протеомика EV в исследовании PLA2G12A

Исследование PLA2G12A представляет собой конкретный пример использования UIP400MTP в рабочем процессе шотган-протеомики. Биологический вопрос заключался в том, как секретируемая фосфолипаза PLA2G12A модифицирует внеклеточные везикулы, происходящие из клеток Th17, и тем самым влияет на дифференцировку патогенных Т-клеток. Авторы показали, что PLA2G12A воздействует на мембраны EV с образованием лизофосфолипидов, включая 1-oleoyl-lysophosphatidylethanolamine, и что последующая передача сигналов лизофосфатидной кислоты через LPA2 способствует дифференцировке Th17. Помимо липидной сигнализации, в исследованиях также изучали содержимое EV, включая РНК и белки, что сделало шотган-протеомику важным компонентом стратегии характеристики.
В рабочем процессе подготовки EV клетки Th17 культивировали в среде, содержащей эмбриональную бычью сыворотку, обеднённую экзосомами. Надосадочную жидкость культуры сначала центрифугировали для удаления клеток, пропускали через фильтр 0,22 µm, концентрировали с помощью ультрафильтрации/ультрацентрифугирования, промывали, ресуспендировали в PBS и количественно определяли с помощью анализа белка BCA. Эта предварительная подготовка EV обеспечивала возможность внесения определённого количества материала EV в белковом эквиваленте в рабочий процесс протеомики.
Для шотган-протеомного анализа авторы использовали образцы EV, соответствующие 5 µg белкового эквивалента. Эти образцы высушивали в пробирках для ПЦР и добавляли 25 µL метанола. Затем образцы обрабатывали ультразвуком в течение 3 минут с помощью ультразвукового аппарата для микропланшетов UIP400MTP. После обработки ультразвуком образцы центрифугировали при 4°C в течение 20 минут при 19 000 × g. После удаления 20 µL надосадочной жидкости образцы центрифугировали до полного высушивания. Затем белки растворяли путём обработки ультразвуком в 4 µL раствора трипсина/Lys-C с концентрацией 100 ng/µL в 50 mM бикарбонате аммония. Расщепление проводили в течение 2 часов при 37°C с перемешиванием при 300 rpm. Гидролизат подкисляли 1 µL 1,25% трифторуксусной кислоты и подвергали анализу методом жидкостной хроматографии с нанопотоком, сопряжённой с тандемной масс-спектрометрией высокого разрешения.
Этот рабочий процесс иллюстрирует несколько полезных принципов протеомики EV с малым исходным количеством образца. Во-первых, исходное количество нормализовали по белковому эквиваленту, что важно при сравнении EV из разных генотипов или после разных воздействий. Во-вторых, метанол использовали перед обработкой ультразвуком, способствуя разрушению и экстракции и одновременно избегая систем с детергентами, которые могут осложнять LC-MS/MS. В-третьих, этап обработки ультразвуком был коротким и стандартизированным, что совместимо с параллельной обработкой образцов. В-четвёртых, расщепление трипсином/Lys-C проводили в очень малом объёме, уменьшая разбавление и способствуя извлечению пептидов при малом исходном количестве образца. Наконец, непосредственный переход от расщепления к подкислению и LC-MS/MS сводил к минимуму ненужные операции с образцами.
Последующий метод LC-MS/MS использовал обращённо-фазовое разделение с нанопотоком, сопряжённое с масс-спектрометром Q-Exactive HF Orbitrap. Образцы удерживали на предколонке C18, затем разделяли на аналитической колонке с внутренним диаметром 50 µm при 200 nL/min и 40°C. Градиент изменялся от низкого содержания органического растворителя до 35% растворителя B в течение 60 минут, после чего проводили промывку при высоком содержании органического растворителя и повторное уравновешивание. Получение данных MS осуществляли в режиме положительных ионов с использованием получения данных, независимого от данных, и столкновительной диссоциации при повышенной энергии. Исходные файлы DIA анализировали с помощью DIA-NN 1.8 со спектральной библиотекой, предсказанной in silico.