Фрагментация хроматина с помощью обработки ультразвуком

Фрагментация хроматина – важнейший этап многих рабочих процессов в эпигенетике и молекулярной биологии, особенно иммунопреципитации хроматина (ChIP), ChIP-seq и связанных с ними анализов. Цель состоит в разделении хроматина на воспроизводимые комплексы ДНК и белков с сохранением целостности эпитопов и минимизацией потерь образца. Среди доступных методов ультразвуковая фрагментация хроматина получила широкое распространение, поскольку обеспечивает надежную фрагментацию без реагентов с отличной воспроизводимостью.

Что следует учитывать при фрагментации хроматина?

Эффективная фрагментация хроматина требует тщательного контроля экспериментальных параметров. Неправильная фрагментация может поставить под угрозу последующие эксперименты ChIP, приводя к образованию слишком крупных, чрезмерно деградированных или неоднородных между образцами фрагментов.
Один из наиболее важных факторов – желаемое распределение фрагментов по размерам. Для большинства применений ChIP и ChIP-seq оптимальны фрагменты хроматина размером от 100 до 600 пар оснований. Этот диапазон размеров обеспечивает эффективную иммунопреципитацию и одновременно достаточное разрешение для геномного картирования.

Еще один ключевой фактор – эффективность сшивания перед обработкой ультразвуком. Большинство рабочих процессов ChIP предусматривает фиксацию формальдегидом для стабилизации взаимодействий между белками и ДНК. Однако чрезмерное сшивание может повысить устойчивость хроматина к фрагментации, что требует более длительной обработки ультразвуком и потенциально увеличивает тепловое воздействие.
Контроль температуры также имеет решающее значение. При обработке ультразвуком локально выделяется энергия, которая может повысить температуру образца. Повышенная температура может повредить ДНК или денатурировать белки, влияя на распознавание антителами при ChIP. Поэтому многие исследователи используют циклы импульсной обработки ультразвуком в сочетании с интервалами охлаждения для поддержания стабильности образца.
Концентрация и объем образца также влияют на эффективность фрагментации. Высококонцентрированные суспензии хроматина могут требовать более длительной обработки ультразвуком, а малые объемы образцов требуют точной передачи энергии для предотвращения чрезмерной обработки.
Наконец, выбор устройства для обработки ультразвуком существенно влияет на воспроизводимость экспериментов. Устройства, предназначенные для фрагментации хроматина, обычно обеспечивают контролируемую передачу ультразвуковой энергии и стандартизированное обращение с образцами, позволяя получать однородную фрагментацию в нескольких образцах.

Какой ультразвуковой прибор выбрать для фрагментации хроматина?

Для разных лабораторных рабочих процессов требуются разные конфигурации обработки ультразвуком. Оптимальная система в значительной степени зависит от производительности обработки образцов, их объема и формата эксперимента.

Ультразвуковой прибор зондового типа

Ультразвуковой прибор зондового типа передает ультразвуковую энергию непосредственно в образец через титановый зонд. Эта конфигурация обеспечивает очень высокую плотность энергии и поэтому подходит для интенсивного разрушения хроматина в отдельных образцах.

Ультразвуковые приборы зондового типа особенно полезны для:

• Небольшого или среднего количества образцов
• Хроматина, трудно поддающегося фрагментации
• Гибких экспериментальных протоколов

Ультразвуковой прибор для нескольких пробирок – VialTweeter

Для лабораторий, обрабатывающих несколько образцов одновременно, ультразвуковой прибор VialTweeter для нескольких пробирок обеспечивает решение с высокой воспроизводимостью. Система передает ультразвуковую энергию косвенно, через держатель флаконов, позволяя фрагментировать содержимое нескольких герметично закрытых пробирок в одинаковых условиях.

Эта конфигурация дает важные преимущества:

• Параллельная фрагментация хроматина в нескольких образцах
• Исключение загрязнения от зонда
• Высокая воспроизводимость между пробирками
• Упрощенный рабочий процесс подготовки образцов для ChIP

Такие системы для нескольких пробирок хорошо подходят для рутинных экспериментов ChIP и исследований со средней производительностью обработки образцов.
 

Ультразвуковой прибор для микропланшетов – UIP400MTP

В высокопроизводительных эпигенетических исследованиях все чаще используют обработку образцов в микропланшетах. Ультразвуковой прибор для микропланшетов UIP400MTP предназначен для фрагментации хроматина непосредственно в стандартных микропланшетах без переноса образцов.

Этот подход обеспечивает:

• Одновременную обработку десятков или сотен образцов
• Рабочие процессы, удобные для автоматизации
• Равномерное распределение ультразвуковой энергии по лункам
• Значительное сокращение числа операций с образцами

Для крупных проектов скрининга с помощью ChIP-seq или высокопроизводительных эпигенетических исследований обработка ультразвуком в микропланшетах обеспечивает исключительную масштабируемость и эффективность. Ультразвуковой прибор для многолуночных планшетов UIP400MTP хорошо подходит для интеграции в системы дозирования жидкостей и автоматизированные лабораторные рабочие процессы.
 

Почему стоит выбрать обработку ультразвуком вместо других методов фрагментации хроматина?

По сравнению с ферментативными подходами обработка ультразвуком для ChIP обеспечивает фрагментацию без смещения, поскольку процесс не зависит от специфичной к последовательности активности ферментов. Это особенно важно для полногеномных эпигенетических исследований, где необходимо равномерное покрытие.
Еще одно важное преимущество – масштабируемость. Ультразвуковые системы позволяют обрабатывать отдельные образцы, несколько пробирок или целые микропланшеты, давая лабораториям возможность выбрать наиболее подходящую конфигурацию с учетом производительности их экспериментов.
Наконец, обработка ультразвуком обеспечивает отличный контроль параметров фрагментации. Регулируя циклы импульсов, длительность и уровни мощности, исследователи могут надежно получать желаемое распределение фрагментов по размерам.

Как количественно и качественно оценить выход хроматина после ультразвуковой фрагментации?

После обработки ультразвуком для ChIP исследователи должны оценить как количество, так и качество фрагментированного хроматина. Этот этап проверки обеспечивает соответствие фрагментации хроматина требованиям последующих применений, таких как ChIP-qPCR или ChIP-seq.
Количественная оценка обычно начинается с измерения концентрации ДНК. Спектрофотометрические методы, такие как анализ на Nanodrop, или флуориметрические анализы, например количественное определение ДНК с помощью Qubit, позволяют надежно оценить выход хроматина после удаления сшивок и очистки.
Однако сама по себе концентрация ДНК не показывает, была ли фрагментация успешной. Поэтому исследователи оценивают распределение фрагментов по размерам с помощью электрофоретических методов. Электрофорез в агарозном геле остается широко используемым подходом для визуализации фрагментов ДНК и проверки того, что большинство из них находится в целевом диапазоне размеров.
Более оснащенные лаборатории часто используют системы капиллярного электрофореза, такие как Agilent Bioanalyzer или TapeStation. Эти платформы дают точные профили распределения по размерам и позволяют исследователям выявлять чрезмерную или неполную фрагментацию.

При оценке качества хроматина после ультразвуковой фрагментации исследователи обычно подтверждают следующее:

• Большинство фрагментов ДНК находится в диапазоне 100–600 bp
• Распределение фрагментов одинаково в повторных образцах
• Деградация ДНК минимальна
• Общий выход хроматина достаточен для запланированного анализа ChIP

Надлежащий контроль качества обеспечивает получение воспроизводимых и биологически значимых результатов на этапе ультразвуковой фрагментации хроматина.

Заключение: ультразвуковая фрагментация хроматина для надежных исследований

Надежная фрагментация хроматина имеет основополагающее значение для успешных исследований ChIP и эпигенетики. Ультразвуковая фрагментация представляет собой эффективное решение, поскольку обеспечивает точное, воспроизводимое разрушение хроматина без реагентов в широком спектре экспериментальных форматов.
Тщательно оптимизируя параметры обработки ультразвуком, проверяя распределение фрагментов по размерам и выбирая подходящую систему обработки ультразвуком – будь то ультразвуковой прибор зондового типа, VialTweeter для нескольких пробирок или высокопроизводительный ультразвуковой прибор для микропланшетов UIP400MTP – исследователи могут получать стабильную фрагментацию хроматина, обеспечивающую высокое качество результатов ChIP и ChIP-seq.
По мере того как исследования в области эпигенетики продолжают развиваться в направлении повышения производительности и воспроизводимости экспериментов, ультразвуковая фрагментация хроматина остается одним из наиболее универсальных и надежных методов, доступных современным лабораториям молекулярной биологии.

Разработка, производство и консультирование – качество из Германии

Ультразвуковые приборы Hielscher хорошо известны высочайшими стандартами качества и конструкции. Надежность и простота эксплуатации позволяют без затруднений интегрировать наши ультразвуковые приборы в промышленные установки. Ультразвуковые приборы Hielscher легко справляются с тяжелыми условиями и сложной рабочей средой.

Hielscher Ultrasonics – компания, сертифицированная по ISO, которая уделяет особое внимание высокопроизводительным ультразвуковым приборам, сочетающим самые современные технологии и удобство использования. Разумеется, ультразвуковые приборы Hielscher соответствуют требованиям CE и отвечают требованиям UL, CSA и RoHs.

Литература / ссылки

• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mittal, N., Guimaraes, J.C., Gross, T. et al. (2017): The Gcn4 transcription factor reduces protein synthesis capacity and extends yeast lifespan. Nat Commun 8, 457 (2017).
• Shih H.-T., Chen W.-Y., Liu K.-Y., Shih Z.-S., Chen Y.-J., Hsieh P.-C., et al. (2016): dBRWD3 Regulates Tissue Overgrowth and Ectopic Gene Expression Caused by Polycomb Group Mutations. PLoS Genetics 12(9): e1006262.
• José A. Jarillo, Dorota N. Komar, and Manuel Piñeiro (2018): The Use of the Chromatin Immunoprecipitation Technique for In Vivo Identification of Plant Protein–DNA Interactions. Chapter in book: Luis Oñate-Sánchez (ed.), Two-Hybrid Systems: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1794, 2018.
• Einig, E., Jin, C., Andrioletti, V. et al. (2023): RNAPII-dependent ATM signaling at collisions with replication forks. Nature Communications 14, 5147 (2023)