Сдвиг хроматина с помощью соникации
Расщепление хроматина - важный этап многих процессов эпигенетики и молекулярной биологии, особенно при иммунопреципитации хроматина (ChIP), ChIP-seq и смежных анализах. Цель состоит в том, чтобы фрагментировать хроматин в воспроизводимые ДНК-белковые комплексы, сохраняя при этом целостность эпитопов и минимизируя потери образца. Среди доступных методов широко используется ультразвуковая фрагментация хроматина, поскольку она обеспечивает надежную, безреагентную фрагментацию с отличной воспроизводимостью.
Что следует учитывать при стрижке хроматина?
Эффективная фрагментация хроматина требует тщательного контроля параметров эксперимента. Неправильная фрагментация может поставить под угрозу последующие ChIP-эксперименты, поскольку фрагменты получаются слишком большими, чрезмерно деградированными или несовместимыми между образцами.
Одним из наиболее важных факторов является желаемое распределение фрагментов по размерам. Для большинства приложений ChIP и ChIP-seq оптимальными являются фрагменты хроматина размером от 100 до 600 пар оснований. Этот диапазон размеров позволяет эффективно проводить иммунопреципитацию, обеспечивая при этом достаточное разрешение для геномного картирования.
Другим ключевым фактором является эффективность сшивания до соникации. Большинство рабочих процессов ChIP включает фиксацию формальдегидом для стабилизации взаимодействий белок-ДНК. Однако чрезмерное сшивание может сделать хроматин более устойчивым к фрагментации, что потребует более длительного времени соникации и потенциально увеличит тепловое воздействие.
Контроль температуры также имеет решающее значение. Соникация генерирует локализованную энергию, которая может повысить температуру образца. Повышенная температура может повредить ДНК или денатурировать белки, что повлияет на распознавание антител во время ChIP. Поэтому многие исследователи проводят импульсные циклы соникации в сочетании с интервалами охлаждения для поддержания стабильности образца.
Концентрация и объем образца также влияют на эффективность фрагментации. Высококонцентрированные суспензии хроматина могут потребовать более длительного времени соникации, а малые объемы образцов требуют точной подачи энергии для предотвращения чрезмерной обработки.
Наконец, выбор устройства для соникации сильно влияет на воспроизводимость эксперимента. Устройства, предназначенные для сдвига хроматина, обычно обеспечивают контролируемую ультразвуковую энергию и стандартизированную обработку образцов, что позволяет проводить последовательную фрагментацию множества образцов.
Ультразвуковой сдвиг ДНК во время ЧИП – иммунопреципитация хроматина
Какой соникатор выбрать для сдвига хроматина?
Различные лабораторные рабочие процессы требуют различных конфигураций соникации. Выбор оптимальной системы во многом зависит от пропускной способности, объема и формата эксперимента.
Зондирующий аппарат зондового типа
Ультразвуковой прибор зондового типа подает ультразвуковую энергию непосредственно в образец через титановый зонд. Такая конфигурация обеспечивает очень высокую плотность энергии и поэтому подходит для надежного разрушения хроматина в отдельных образцах.
Зондовые соникаторы особенно полезны для:
- Малое и среднее количество образцов
- Трудно фрагментируемый хроматин
- Гибкие экспериментальные протоколы
Многотрубный звукосниматель - VialTweeter
Для лабораторий, обрабатывающих несколько образцов одновременно, соникер VialTweeter для нескольких пробирок обеспечивает высокую воспроизводимость результатов. Система передает ультразвуковую энергию опосредованно через держатель пробирки, позволяя фрагментировать несколько герметичных пробирок в одинаковых условиях.
Такая конфигурация обладает важными преимуществами:
- Параллельный сдвиг хроматина в нескольких образцах
- Устранение загрязнения зонда
- Высокая воспроизводимость между пробирками
- Упрощенный рабочий процесс подготовки образцов для ChIP
Такие многопробирочные системы хорошо подходят для рутинных ChIP-экспериментов и исследований средней производительности.
Звуковой анализатор микропланшетов - UIP400MTP
Высокопроизводительные эпигенетические исследования все больше зависят от обработки образцов в микропланшетах. Микропланшетный соникатор UIP400MTP предназначен для фрагментации хроматина непосредственно в стандартных микропланшетах без переноса образцов.
Такой подход позволяет:
- Одновременная обработка десятков или сотен образцов
- Удобные для автоматизации рабочие процессы
- Равномерное распределение ультразвуковой энергии по скважинам
- Значительное сокращение количества этапов обработки образцов
Для крупных проектов по скринингу ChIP-seq или высокопроизводительных эпигенетических исследований соникация микропланшетов обеспечивает исключительную масштабируемость и эффективность. Соникатор для многолуночных планшетов UIP400MTP хорошо подходит для интеграция в системы обработки жидкостей и автоматизированные лабораторные процессы.
Почему стоит предпочесть сонирование другим методам разделения хроматина?
По сравнению с ферментативными подходами, соникация для ChIP обеспечивает беспристрастную фрагментацию, поскольку процесс не зависит от активности ферментов, специфичных для конкретной последовательности. Это особенно важно для геномных эпигенетических исследований, где необходимо равномерное покрытие.
Еще одно важное преимущество - масштабируемость. Ультразвуковые системы могут работать с отдельными образцами, несколькими пробирками или целыми микропланшетами, что позволяет лабораториям выбрать наиболее подходящую конфигурацию в соответствии с пропускной способностью эксперимента.
Наконец, соникация обеспечивает превосходный контроль над параметрами фрагментации. Регулируя циклы импульсов, длительность и уровень мощности, исследователи могут надежно добиться желаемого распределения фрагментов по размерам.
Фрагментация хроматина при оптимизированном сонировании образцов ChIP.
(a) без сдвига (длинные фрагменты в геле);
(b) оптимальный профиль фрагментации (обогащение фрагментами размером 200-600 п.н.);
(c) избыточная фрагментация ДНК (избыточное количество фрагментов короче 200 п.н.)
© Jarillo et al., 2018
Сравнение методов сдвига хроматина
| Метод сдвига хроматина | Принцип | Преимущества | Ограничения |
| Ультразвуковая обработка | Высокочастотная акустическая энергия механически фрагментирует хроматин. | Безреагентная фрагментация, высокая воспроизводимость результатов, настраиваемое распределение фрагментов по размерам, совместимость со сшитым хроматином, масштабируемость от отдельных пробирок до форматов с несколькими образцами и микропланшетами. | Требуется оборудование для соникации и оптимизация параметров соникации. |
| Ферментативное пищеварение (MNase) | Микрококковая нуклеаза переваривает ДНК между нуклеосомами. | Мягкая фрагментация, полезная для анализа нативного хроматина. | Предвзятость ферментов, предпочтение последовательностей, трудно контролируемое переваривание, потенциальная вариабельность между экспериментами. |
| Механические ножницы (игла/шприц) | Хроматин нарушается под действием повторяющихся физических усилий. | Простой метод, требующий минимального оборудования. | Плохая воспроизводимость, ограниченный контроль над размером фрагмента, трудоемкость при работе с несколькими образцами. |
| Распыление | Сжатый воздух продавливает ДНК через маленькие отверстия, вызывая ее фрагментацию. | Быстрый процесс фрагментации. | Возможна потеря образцов, ограниченная масштабируемость, требуется специализированное оборудование. |
Как определить и оценить выход хроматина после ультразвуковой фрагментации?
После соникации для ChIP исследователи должны оценить количество и качество фрагментированного хроматина. Этот этап проверки гарантирует, что фрагментация хроматина соответствует требованиям последующих приложений, таких как ChIP-qPCR или ChIP-seq.
Количественное определение обычно начинается с измерения концентрации ДНК. Спектрофотометрические методы, такие как анализ Nanodrop, или флуорометрические анализы, такие как количественное определение ДНК Qubit, позволяют достоверно оценить выход хроматина после декросшивки и очистки.
Однако концентрация ДНК сама по себе не позволяет определить, была ли фрагментация успешной. Поэтому исследователи оценивают распределение фрагментов по размерам с помощью электрофоретических методов. Агарозный гель-электрофорез остается широко используемым методом для визуализации фрагментов ДНК и проверки того, что большинство из них попадает в целевой диапазон размеров.
В более продвинутых лабораториях часто используются системы капиллярного электрофореза, такие как Agilent Bioanalyzer или TapeStation. Эти платформы обеспечивают точные профили распределения по размерам и позволяют исследователям обнаружить чрезмерную фрагментацию или неполный сдвиг.
Оценивая качество хроматина после ультразвуковой фрагментации, исследователи обычно подтверждают это:
- Большинство фрагментов ДНК находятся в диапазоне 100-600 п.н.
- Распределение фрагментов по образцам совпадает
- Разрушение ДНК минимально
- Общий выход хроматина достаточен для запланированного анализа ChIP
Надлежащий контроль качества обеспечивает воспроизводимость и биологическую значимость результатов ультразвукового сдвига хроматина.
Заключение: Ультразвуковой сдвиг хроматина для надежных исследований
Надежное разрушение хроматина является основополагающим фактором для успешного проведения ChIP и эпигенетических исследований. Ультразвуковая фрагментация - это мощное решение, поскольку она позволяет точно, воспроизводимо и без реагентов разрушать хроматин в широком диапазоне экспериментальных форматов.
Тщательно оптимизируя параметры соникации, проверяя распределение фрагментов по размерам и выбирая подходящую систему соникации – будь то зондовый соникер, многопробирочный VialTweeter или высокопроизводительный микропланшетный соникер UIP400MTP – Исследователи могут добиться последовательной фрагментации хроматина, что способствует получению высококачественных результатов ChIP и ChIP-seq.
Поскольку исследования в области эпигенетики продолжают развиваться в направлении повышения производительности и воспроизводимости экспериментов, ультразвуковой сдвиг хроматина остается одним из наиболее универсальных и надежных методов, доступных для современных лабораторий молекулярной биологии.
Проектирование, производство и консалтинг – Качество «Сделано в Германии»
Ультразвуковые аппараты Hielscher хорошо известны своими высочайшими стандартами качества и дизайна. Надежность и простота в эксплуатации позволяют без проблем интегрировать наши ультразвуковые аппараты в промышленные объекты. Ультразвуковые аппараты Hielscher легко справляются с суровыми условиями и требовательными условиями окружающей среды.
Hielscher Ultrasonics является компанией, сертифицированной по стандарту ISO, и уделяет особое внимание высокопроизводительным ультразвуковым аппаратам, отличающимся самыми современными технологиями и удобством в использовании. Конечно, ультразвуковые аппараты Hielscher соответствуют требованиям CE и соответствуют требованиям UL, CSA и RoHs.
Штатив для пробирок сонируется в UIP400MTP для сдвига хроматина
Литература / Литература
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mittal, N., Guimaraes, J.C., Gross, T. et al. (2017): The Gcn4 transcription factor reduces protein synthesis capacity and extends yeast lifespan. Nat Commun 8, 457 (2017).
- Shih H.-T., Chen W.-Y., Liu K.-Y., Shih Z.-S., Chen Y.-J., Hsieh P.-C., et al. (2016): dBRWD3 Regulates Tissue Overgrowth and Ectopic Gene Expression Caused by Polycomb Group Mutations. PLoS Genetics 12(9): e1006262.
- José A. Jarillo, Dorota N. Komar, and Manuel Piñeiro (2018): The Use of the Chromatin Immunoprecipitation Technique for In Vivo Identification of Plant Protein–DNA Interactions. Chapter in book: Luis Oñate-Sánchez (ed.), Two-Hybrid Systems: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1794, 2018.
- Einig, E., Jin, C., Andrioletti, V. et al. (2023): RNAPII-dependent ATM signaling at collisions with replication forks. Nature Communications 14, 5147 (2023)
Часто задаваемые вопросы
Что такое хроматин?
Хроматин - это структурный комплекс ДНК и связанных с ней белков, который организует генетический материал в ядре эукариотических клеток. Основными белками хроматина являются гистоны, вокруг которых ДНК оборачивается, образуя нуклеосомы. Такая организация уплотняет ДНК и одновременно регулирует доступ к генетической информации для таких процессов, как транскрипция, репликация и репарация ДНК.
Каковы типы хроматина?
Хроматин обычно классифицируется на две основные формы: эухроматин и гетерохроматин. Эухроматин упакован неплотно и транскрипционно активен, что позволяет генам быть легко доступными для транскрипционного механизма. Гетерохроматин более плотно упакован и транскрипционно неактивен, обычно содержит повторяющиеся последовательности ДНК или гены, которые находятся в состоянии молчания. Гетерохроматин также можно разделить на конститутивный гетерохроматин, который остается постоянно конденсированным, и факультативный гетерохроматин, который может переключаться между активным и неактивным состоянием в зависимости от клеточных условий.
Что такое кросслинкинг?
Сшивание - это биохимический процесс, используемый для стабилизации взаимодействий между биомолекулами путем образования ковалентных связей между ними. В исследованиях хроматина сшивание обычно используется для сохранения взаимодействий между белками и ДНК в хроматине перед анализом. Химические агенты, такие как формальдегид, обычно используются для создания обратимых ковалентных связей между ДНК и связанными с ней белками, эффективно “замораживание” молекулярных взаимодействий в определенный момент времени. Такая стабилизация позволяет фрагментировать и обрабатывать комплексы хроматина, не теряя при этом нативных связей между ДНК и регуляторными белками, что важно для таких методов, как иммунопреципитация хроматина (ChIP).
Что такое ЧИП?
Иммунопреципитация хроматина (ChIP) - это метод молекулярной биологии, используемый для изучения взаимодействий между белками и ДНК в хроматине. В этом методе ДНК-белковые комплексы сначала стабилизируются, как правило, с помощью сшивки, а затем хроматин фрагментируется. Антитела, специфичные к целевому белку, используются для иммунопреципитации комплексов белок-ДНК, что позволяет выделить и проанализировать связанные с ними последовательности ДНК.
Для чего используется ChIP?
ChIP используется для идентификации геномных областей, связанных с определенными ДНК-ассоциированными белками, такими как транскрипционные факторы, модификации гистонов или хроматин-ассоциированные регуляторные белки. Этот метод широко применяется для изучения регуляции генов, эпигенетических модификаций, сайтов связывания транскрипционных факторов и структуры хроматина. В сочетании с последующими аналитическими методами, такими как количественная ПЦР (ChIP-qPCR) или высокопроизводительное секвенирование (ChIP-seq), она позволяет картировать взаимодействия белков с ДНК в масштабах всего генома.
Какие существуют типы ChIP?
Существует несколько вариантов иммунопреципитации хроматина в зависимости от дизайна эксперимента и последующего анализа. Наиболее распространенные подходы включают ChIP-qPCR, который количественно определяет обогащение определенных геномных регионов; ChIP-seq, который использует секвенирование следующего поколения для картирования взаимодействий белок-ДНК по всему геному; и ChIP-chip, который сочетает ChIP с анализом ДНК-микрочипов. Дополнительные варианты, такие как нативный ChIP (N-ChIP), который анализирует несшитый хроматин, и сшитый ChIP (X-ChIP), который использует химическую сшивку для стабилизации взаимодействий белок-ДНК, также широко используются в зависимости от изучаемого биологического вопроса.
Высокопроизводительный процесс сдвига хроматина с помощью микропланшетного соникатора UIP400MTP
Hielscher Ultrasonics производит высокопроизводительные ультразвуковые гомогенизаторы от лаборатория Кому промышленного размера.