Extração de proteínas de tecido tumoral assistida por sonicação – Protocolo

Este protocolo descreve um método de extração de proteínas de tecido tumoral assistida por sonicação que aperfeiçoa o procedimento padrão de lise com ureia do CPTAC ao acrescentar uma etapa controlada de sonicação com sonda durante a rutura do tecido. Com base na estratégia estabelecida de preparação do proteoma e do fosfoproteoma do CPTAC para análise em profundidade, esta modificação melhora a rutura celular e das estruturas subcelulares, reduz a viscosidade da amostra e favorece a libertação de proteínas que são normalmente mais difíceis de recuperar apenas com lise com ureia, sobretudo proteínas ligadas à membrana e proteínas que se ligam ao ADN ou estão associadas ao núcleo. No estudo em que se baseia, o procedimento assistido por sonicação aumentou a deteção tanto de proteínas como de fosfopéptidos, mantendo a compatibilidade com as etapas subsequentes de digestão segundo o modelo CPTAC, marcação com TMT, fracionamento, enriquecimento de fosfopéptidos e análise por LC-MS/MS.

Extração de proteínas de tecido tumoral assistida por sonicação para análise proteómica e fosfoproteómica em profundidade

O protocolo seguinte está otimizado para a extração de proteínas de tecido tumoral criopulverizado em tampão de lise com ureia 8 M: a adição de uma etapa de sonicação com sonda melhora a recuperação de classes de proteínas difíceis de extrair, sobretudo proteínas associadas à membrana e ao ADN/núcleo, antes da digestão e da análise subsequente por LC-MS/MS. No estudo de Li et al. (2025) em que se baseia, a adição de sonicação aumentou a deteção de proteínas associadas à membrana e ao núcleo e permitiu uma cobertura em profundidade de >12 000 proteínas e >25 000 fosfopéptidos com o procedimento utilizado pelos autores.

Área de aplicação do protocolo

Utilize este procedimento para:

• tecido tumoral fresco congelado e criopulverizado
• sedimentos celulares ou outras amostras biológicas para as quais a extração à base de ureia já esteja estabelecida
• procedimentos de proteómica e fosfoproteómica globais que utilizem digestão com tripsina e marcação opcional com TMT

O estudo de Li et al. (2025) afirma que o procedimento também é aplicável a outros tipos de amostras, como linhas celulares, sangue e urina; no entanto, poderá ser necessária uma otimização em função do tipo de amostra.

Procedimento otimizado de preparação de amostras com uma etapa de sonicação incorporada. O procedimento otimizado e o desenho experimental baseiam-se no protocolo de preparação de amostras do CPTAC para análise proteómica e fosfoproteómica globais.
Estudo e esquema: ©Li et al., 2025

Princípio de funcionamento

O estudo original acrescentou sonicação ao procedimento padrão de lise com ureia do CPTAC e constatou uma melhoria na deteção de proteínas associadas às membranas e aos núcleos. Os autores afirmam que os parâmetros de sonicação devem ser ajustados com precisão em função da dimensão/concentração da amostra – através da escolha da dimensão do sonotrodo, da energia aplicada e da temporização dos impulsos.

Por exemplo, para os Hielscher UP200Ht e UP200St, isto significa:

• utilizar a amplitude e o modo de impulsos como principais variáveis de controlo
• manter as amostras frias durante todo o procedimento (ou seja, em gelo)
• começar com definições conservadoras
• otimizar tendo em conta a limpidez da amostra, a temperatura, o rendimento em proteínas e a qualidade dos péptidos nas etapas subsequentes

 
Ambos os modelos de sonicadores Hielscher de 200 watts, UP200Ht e UP200St, foram concebidos para volumes de amostra pequenos e médios, com definições ajustáveis de amplitude e impulsos; ambos os homogeneizadores ultrassónicos disponibilizam controlo digital por ecrã tátil para ajuste preciso dos parâmetros, registo automático de dados, sensor de temperatura conectável, controlo remoto e iluminação da amostra.
 

Reagentes para extração de proteínas assistida por sonicação

Tampão de lise com ureia

Prepare de fresco imediatamente antes da utilização:

• Ureia 8 M
• NaCl 75 mM
• Tris 50 mM, pH 8,0
• EDTA 1 mM
• Aprotinina 2 µg/mL
• Leupeptina 10 µg/mL
• PMSF 1 mM
• NaF 10 mM
• PUGNAc 20 µM
• Cocktail de inibidores de fosfatases 2, 1:100 (v/v)
• Cocktail de inibidores de fosfatases 3, 1:100 (v/v)

A ureia deve estar completamente dissolvida antes da adição dos aditivos; os inibidores devem ser adicionados imediatamente antes da utilização; o tampão deve ser mantido em gelo; e, após a adição dos aditivos, recomenda-se agitação por movimentos circulares em vez de agitação vigorosa em vórtex.
 

Reagentes adicionais:

• Reagentes para o ensaio de quantificação de proteínas por BCA
• Tris-HCl 50 mM, pH 8,0
• DTT
• Iodoacetamida
• LysC
• Tripsina
• Ácido fórmico
• Reagentes TMT, se utilizar proteómica quantitativa multiplexada
• Reagentes IMAC, se realizar enriquecimento de fosfopéptidos

Equipamento para extração de proteínas assistida por sonicação

Necessário

Seleção recomendada da sonda

Para amostras de cerca de 200–1000 µL, utilize um sonotrodo de pequeno diâmetro adequado ao processamento direto de pequenos volumes a alta intensidade. A Hielscher disponibiliza sonotrodos de vários diâmetros, e diâmetros de ponta menores proporcionam maior intensidade na ponta.

Nota prática: utilize a sonda mais pequena que proporcione uma mistura eficiente sem formação excessiva de espuma nem contacto com a parede do recipiente.

Se trabalhar com várias amostras ao mesmo tempo, poderá considerar o sonicador para múltiplos tubos VialTweeter ou o sonicador para microplacas UIP400MTP!

Instruções passo a passo: procedimento de extração de proteínas assistida por sonicação

A. Pré-arrefecimento e preparação

1. Arrefeça a centrífuga até 4°C.
2. Prepare de fresco o tampão de lise com ureia e mantenha-o em gelo.
3. Monte o UP200Ht ou UP200St num suporte dentro de uma caixa de isolamento acústico.
4. Prepare um banho de gelo suficientemente grande para manter os tubos de amostra na vertical e estáveis.

A preparação de tampão fresco e o manuseamento a frio são fundamentais.

B. Extração inicial com ureia

1. Mantenha o tecido criopulverizado em gelo.
2. Adicione 200 µL de tampão de lise com ureia arrefecido por cada 50 mg de tecido húmido.
3. Agite em vórtex durante 5–10 s a alta velocidade.
4. Incube durante 15 min a 4°C.
5. Repita mais uma vez a etapa de agitação em vórtex seguida de incubação.
6. Centrifugue a 20 000g durante 10 min a 4°C.
7. Transfira o lisado/sobrenadante para um tubo limpo de baixa ligação.

C. Sonicação com UP200Ht ou UP200St

Condições iniciais para a sonicação

• Amplitude: comece a 20–30%
• Duração do impulso: 5 s ligado
• Arrefecimento: 2 min em gelo entre impulsos
• Número de ciclos: 4 ciclos
• Tempo total de sonicação ativa: 20 s
• Tempo total do processo, incluindo arrefecimento: cerca de 8–10 min

Etapas de sonicação

1. Transfira o lisado para um tubo adequado à sonicação. Utilize um tubo estreito, de paredes finas, que permita uma boa troca de calor e a imersão segura da sonda.
2. Coloque o tubo num banho de gelo. O artigo identifica o arrefecimento durante a sonicação como fundamental para evitar danos causados pelo calor.
3. Mergulhe a ponta da sonda na amostra. Mantenha a ponta suficientemente submersa para uma cavitação estável, mas não permita que toque na parede ou no fundo do tubo.
4. Aplique um impulso de 5 s à amplitude inicial.
5. Volte imediatamente a colocar a amostra inteiramente em gelo durante 2 min.
6. Repita até completar 4 ciclos.
7. Inspecione o lisado após o ciclo.
8. Continue apenas se necessário, aplicando um impulso adicional de 5 s de cada vez, sempre seguido de arrefecimento completo.
9. Pare assim que o lisado se tornar mais uniforme e menos filamentoso/viscoso.
   O ponto final é um lisado mais translúcido que forma gotas em vez de um fluxo viscoso contínuo.
10. Centrifugue a cerca de 16 000g durante 15 min a 4°C.
11. Transfira o sobrenadante clarificado para um tubo novo e meça a concentração de proteínas.

Comparação da proteómica e fosfoproteómica globais entre amostras sonicadas e não sonicadas.
a. Número de proteínas identificadas (proteómica global) em todos os tecidos tumorais PDX com ou sem sonicação. b. Número de fosfopéptidos identificados (enriquecimento por IMAC) em todos os tecidos tumorais PDX com ou sem sonicação. Foram contabilizados apenas as proteínas e os fosfopéptidos com uma razão de abundância superior ou igual ao percentil 25. A razão de abundância foi calculada entre amostras dos mesmos tipos.
Estudo e gráficos: ©Li et al., 2025

Digestão e análise subsequentes

Após a sonicação e a clarificação, prossiga conforme descrito no procedimento original segundo o modelo CPTAC:

1. Dilua o lisado a 1:3 (v/v) com Tris-HCl 50 mM pH 8,0 para reduzir a concentração de ureia para <2 M.
2. Adicione LysC a 1 mAU por cada 50 µg de proteína e incube durante 2 h a 25°C.
3. Adicione tripsina numa proporção de 1:49 enzima:substrato (w/w) e efetue a digestão durante a noite a 25°C.
4. Interrompa a reação com ácido fórmico até uma concentração final de 1%.
5. Prossiga para a dessalinização, marcação com TMT, fracionamento, enriquecimento de fosfopéptidos e LC-MS/MS, conforme necessário.

Expressão diferencial de fosfopéptidos obtida por MS com marcação TMT.
a. O subtipo basal, destacando alguns fosfopéptidos humanos (início e fim da sequência proteica) com expressão aumentada nas amostras sonicadas em comparação com as amostras não sonicadas. b. O subtipo luminal, destacando alguns fosfopéptidos humanos (início e fim da sequência proteica) com expressão aumentada nas amostras sonicadas em comparação com as amostras não sonicadas. c. Vias KEGG enriquecidas com base nas proteínas dos fosfopéptidos com expressão aumentada em tumores sonicados do subtipo basal. d. Vias KEGG enriquecidas com base nas proteínas dos fosfopéptidos com expressão aumentada em tumores sonicados do subtipo luminal.
Estudo e gráficos: ©Li et al., 2025

Conceção, fabrico e consultoria – Qualidade fabricada na Alemanha

Os sonicadores Hielscher são bem conhecidos pelos seus mais elevados padrões de qualidade e conceção. A robustez e a facilidade de operação permitem a integração sem dificuldades dos nossos sonicadores em instalações industriais. Os sonicadores Hielscher lidam facilmente com condições adversas e ambientes exigentes.

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Bibliografia / Referências

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.