Extração de proteínas de tecidos tumorais assistida por sonicação – protocolo

Este protocolo descreve um método de extração de proteínas assistido por sonicação para tecido tumoral que avança o fluxo de trabalho padrão de lise de ureia CPTAC, adicionando um passo de sonicação de sonda controlada durante a rutura do tecido. Com base na estratégia estabelecida de preparação do proteoma e do fosfoproteoma CPTAC em grande escala, esta modificação melhora a rutura da estrutura celular e subcelular, reduz a viscosidade da amostra e aumenta a libertação de proteínas que são normalmente mais difíceis de recuperar apenas com a lise da ureia, especialmente as proteínas ligadas à membrana e ao ADN ou associadas ao núcleo. No estudo subjacente, o fluxo de trabalho assistido por sonicação aumentou a deteção de proteínas e fosfopeptídeos, preservando ao mesmo tempo a compatibilidade com a digestão a jusante do tipo CPTAC, a rotulagem TMT, o fracionamento, o enriquecimento de fosfopeptídeos e o pipeline de análise LC-MS/MS.

Extração de proteínas de tecidos tumorais assistida por sonicação para análise proteómica e fosfoproteómica profunda

The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.

Área de aplicação do protocolo

Utilizar este procedimento para:

• tecido tumoral fresco congelado, criopulverizado
• pellets de células ou outras amostras biológicas em que a extração com base na ureia já esteja estabelecida
• fluxos de trabalho proteómicos e fosfoproteómicos globais utilizando digestão tríptica e marcação TMT opcional

O estudo de Li et al. (2025) afirma que o fluxo de trabalho também é aplicável a outros tipos de amostras, tais como linhas celulares, sangue e urina, embora possa ser necessária uma otimização por tipo de amostra.

Fluxo de trabalho de preparação de amostras optimizado com o passo de sonicação implementado. O fluxo de trabalho optimizado e o desenho experimental baseiam-se no protocolo de preparação de amostras CPTAC para análise proteómica e fosfoproteómica global.
Estudo e esquema: ©Li et al., 2025

Princípio de funcionamento

O estudo original adicionou a sonicação ao fluxo de trabalho padrão de lise com ureia do CPTAC e constatou uma melhor deteção de proteínas associadas a membranas e núcleos. Os autores afirmam que os parâmetros de sonicação devem ser ajustados em relação ao tamanho/concentração da amostra – escolhendo o tamanho do sonotrodo, a entrada de energia e o tempo de pulso.

Por exemplo, para o Hielscher UP200Ht e UP200St, isto significa

• utilizar a amplitude e o modo de impulso como principais variáveis de controlo
• manter as amostras frias durante todo o processo (ou seja, em gelo)
• começar com definições conservadoras
• otimizar em função da clareza da amostra, da temperatura, do rendimento proteico e da qualidade dos péptidos a jusante

 
Os modelos de ultra-sons UP200Ht e UP200St da Hielscher, de 200 watts, foram concebidos para volumes de amostra pequenos e médios, com amplitude ajustável e definições de impulsos; ambos os homogeneizadores ultra-sónicos oferecem um controlo digital com ecrã tátil para um ajuste preciso dos parâmetros, registo automático de dados, sensor de temperatura conectável, controlo remoto e iluminação da amostra.
 

Reagentes para extração de proteínas assistida por sonicação

Tampão de lise de ureia

Preparar fresco imediatamente antes da utilização:

• 8 M de ureia
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/mL de aprotinina
• 10 µg/mL de leupeptina
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Cocktail de inibidores da fosfatase 2, 1:100 (v/v)
• Cocktail de inibidores da fosfatase 3, 1:100 (v/v)

A ureia deve ser completamente dissolvida antes da adição de aditivos; os inibidores devem ser adicionados imediatamente antes da utilização; o tampão deve ser mantido em gelo; e recomenda-se a agitação em vez de um vórtice vigoroso após a adição de aditivos.
 

Reagentes adicionais:

• Reagentes para o ensaio de proteínas BCA
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• TDT
• Iodoacetamida
• LysC
• tripsina
• Ácido fórmico
• Reagentes TMT, caso se utilize proteómica quantitativa multiplexada
• Reagentes IMAC, se for efectuado o enriquecimento de fosfopeptídeos

Equipamento para extração de proteínas assistida por sonicação

Necessário

Seleção recomendada da sonda

Para amostras de cerca de 200-1000 µL, utilize um sonotrodo de pequeno diâmetro adequado para o processamento direto de alta intensidade de pequenos volumes. A Hielscher oferece vários diâmetros de sonotrodo, e diâmetros de ponta mais pequenos proporcionam maior intensidade na ponta.

Nota prática: Utilizar a sonda mais pequena que permita uma mistura eficaz sem formação excessiva de espuma ou contacto com a parede do recipiente.

Se trabalhar com várias amostras ao mesmo tempo, pode considerar o VialTweeter do Sonicador Multi-Tubo OU o Microplate Sonicator UIP400MTP!

Instruções passo a passo: Procedimento de extração de proteínas assistida por sonicação

A. Pré-arrefecimento e preparação

1. Refrigerar a centrifugadora a 4°C.
2. Preparar um tampão de lise de ureia fresco e mantê-lo em gelo.
3. Coloque o UP200Ht ou o UP200St num suporte dentro de uma caixa de som.
4. Preparar um banho de gelo suficientemente grande para manter os tubos de amostra na vertical e estáveis.

A preparação de tampões frescos e o manuseamento a frio são fundamentais.

B. Extração inicial de ureia

1. Manter o tecido criopulverizado em gelo.
2. Adicionar 200 µL de tampão de lise de ureia refrigerado por 50 mg de tecido húmido.
3. Vórtice 5-10 s a alta velocidade.
4. Incubar 15 min a 4°C.
5. Repetir o passo de vórtex e incubação mais uma vez.
6. Centrifugar a 20.000g durante 10 min a 4°C.
7. Transferir o lisado/supernatante para um tubo limpo de baixa aglutinação.

C. Sonicação com utilização de UP200Ht ou UP200St

Condições iniciais para a sonicação

• Amplitude: começar a 20-30%
• Duração do impulso: 5 s ON
• Arrefecimento: 2 min. em gelo entre impulsos
• Número de ciclos: 4 ciclos
• Tempo total de sonicação ativa: 20 s
• Tempo total de processamento, incluindo arrefecimento: cerca de 8-10 min

Etapas da sonicação

1. Transferir o lisado para um tubo adequado para a sonicação. Utilize um tubo estreito e de paredes finas que permita uma boa troca de calor e uma imersão segura da sonda.
2. Colocar o tubo num banho de gelo. O documento identifica o arrefecimento durante a sonicação como fundamental para evitar danos causados pelo calor.
3. Imergir a ponta da sonda na amostra. Manter a ponta submersa o suficiente para uma cavitação estável, mas não a deixar tocar na parede ou no fundo do tubo.
4. Executar um impulso de 5 s com a amplitude inicial.
5. Colocar imediatamente a amostra totalmente em gelo durante 2 minutos.
6. Repetir até completar 4 ciclos.
7. Inspecionar o lisado após o ciclo.
8. Continuar apenas se necessário, utilizando um impulso adicional de 5 s de cada vez, sempre seguido de arrefecimento total.
9. Parar quando o lisado se tornar mais uniforme e menos fibroso/viscoso.
   O resultado final é um lisado mais translúcido que forma gotas em vez de um fluxo viscoso contínuo.
10. Centrifugar a cerca de 16.000 g durante 15 minutos a 4°C.
11. Transferir o sobrenadante clarificado para um novo tubo e medir a concentração de proteínas.

Comparação da proteómica global e da fosfoproteómica entre amostras sonicadas e não sonicadas.
a. Número de proteínas identificadas (proteómica global) em todos os tecidos tumorais PDX com ou sem sonicação. b. Número de fosfopeptídeos identificados (enriquecimento IMAC) em todos os tecidos tumorais PDX com ou sem sonicação. Apenas foram contadas as proteínas e os fosfopeptídeos com rácio de abundância superior ou igual ao percentil 25. O rácio de abundância foi calculado entre os mesmos tipos de amostras.
Estudo e gráficos: ©Li et al., 2025

Digestão e análise a jusante

Após a sonicação e clarificação, proceder como descrito no fluxo de trabalho original do tipo CPTAC:

1. Diluir o lisado 1:3 (v/v) com 50 mM Tris-HCl pH 8,0 para reduzir a ureia a <2 M.
2. Adicionar LysC a 1 mAU por 50 µg de proteína e incubar 2 h a 25°C.
3. Adicionar tripsina a 1:49 enzima:substrato (w/w) e digerir durante a noite a 25°C.
4. Temperar com ácido fórmico a 1% final.
5. Continuar a dessalinização, marcação TMT, fracionamento, enriquecimento de fosfopeptídeos e LC-MS/MS, conforme necessário.

Expressão diferencial de fosfopeptídeos de MS marcados com TMT.
a. O subtipo basal, destacando alguns fosfopeptídeos humanos (início e fim da sequência de proteínas) regulados positivamente em amostras sonicadas em comparação com amostras não sonicadas. b. O subtipo luminal, destacando alguns fosfopeptídeos humanos (início e fim da sequência de proteínas) regulados positivamente em amostras sonicadas em comparação com amostras não sonicadas. c. Vias KEGG enriquecidas com base nas proteínas de fosfopeptídeos regulados positivamente no subtipo basal de tumores sonicados. d. Vias KEGG enriquecidas com base nas proteínas de fosfopeptídeos regulados positivamente no subtipo luminal de tumores sonicados.
Estudo e gráficos: ©Li et al., 2025

Conceção, fabrico e consultoria – Qualidade fabricada na Alemanha

Os ultrassons Hielscher são conhecidos pelos seus elevados padrões de qualidade e design. A robustez e a facilidade de operação permitem a integração harmoniosa dos nossos ultrassons nas instalações industriais. As condições difíceis e os ambientes exigentes são facilmente controlados pelos ultrassons Hielscher.

A Hielscher Ultrasonics é uma empresa certificada pela ISO e dá especial ênfase aos ultrassons de alto desempenho com tecnologia de ponta e facilidade de utilização. Naturalmente, os ultrassons da Hielscher estão em conformidade com a CE e cumprem os requisitos da UL, CSA e RoHs.

Literatura / Referências