Fragmentação ultrassónica de DNA para sequenciação de nova geração

A sequenciação de nova geração (NGS) requer o cisalhamento e a fragmentação fiáveis do DNA genómico para sequenciar as cadeias de DNA genómico e criar bibliotecas genómicas. A fragmentação controlada do DNA em fragmentos de DNA é uma etapa essencial de preparação de amostras, necessária antes da sequenciação do DNA. A ultrassonicação é uma técnica comprovadamente eficiente e fiável para a fragmentação do DNA em fragmentos de determinado comprimento. Os protocolos de fragmentação ultrassónica de DNA permitem obter resultados de fragmentação reprodutíveis. Os sonicadores ultrassónicos Hielscher são capazes de produzir uma vasta gama de distribuições de tamanhos de fragmentos de DNA genómico, controláveis com precisão através dos parâmetros de funcionamento. Como os sistemas Hielscher de cisalhamento ultrassónico de DNA estão disponíveis para frascos individuais e múltiplos, bem como para microplacas, a preparação de amostras torna-se altamente eficiente.

Sequenciação de nova geração: fragmentação ultrassónica de DNA para preparação de bibliotecas

Para realizar uma sequenciação de nova geração, devem ser executadas as três etapas básicas de (1) preparação da biblioteca, (2) sequenciação e (3) análise de dados. Durante a preparação da biblioteca, o DNA é fragmentado e, em seguida, as extremidades dos fragmentos são reparadas (polidas) através da adição de uma única base de adenina e os fragmentos-alvo são convertidos em DNA de cadeia dupla. Por fim, os chamados adaptadores são ligados por ligação, PCR ou tagmentação, para que o produto final de DNA da biblioteca possa ser quantificado para sequenciação.
Fragmentação de DNA por sonicação: Sobretudo quando se utilizam tecnologias de sequenciação de leituras curtas, como a Illumina, que não conseguem ler facilmente fragmentos de DNA mais longos, as cadeias de DNA devem ser fragmentadas até um determinado tamanho, o que pode ser conseguido de forma fiável por ultrassonicação.
A ultrassonicação pode ser utilizada de forma fiável para a fragmentação de DNA, RNA e cromatina.

Sequenciação de nova geração – Preparação de bibliotecas

A fragmentação ultrassónica de DNA é habitualmente utilizada na preparação de bibliotecas de sequenciação de DNA para plataformas de sequenciação de nova geração (NGS). Esta técnica é utilizada para dividir as moléculas de DNA em fragmentos mais pequenos, dentro de um intervalo de tamanhos pretendido, o que facilita as etapas subsequentes da preparação da biblioteca. A fragmentação ultrassónica de DNA é normalmente necessária durante a etapa de preparação da biblioteca dos fluxos de trabalho de NGS, para fragmentar o DNA genómico em segmentos mais pequenos, adequados ao processamento e à sequenciação subsequentes. Desempenha um papel crucial para assegurar o sucesso da experiência de sequenciação, ao gerar fragmentos de DNA dentro do intervalo de tamanhos adequado à plataforma de sequenciação específica utilizada.

Sequenciação de nova geração – Etapas do processo:

• Fragmentação ultrassónica de DNA: Antes da construção da biblioteca, o DNA genómico é fragmentado em segmentos mais pequenos e mais fáceis de manipular. A fragmentação ultrassónica envolve a utilização de ondas sonoras de alta frequência para submeter as moléculas de DNA a cisalhamento, produzindo fragmentos dentro do intervalo de tamanhos pretendido. Esta etapa é crucial porque ajuda a assegurar que as leituras de sequenciação geradas posteriormente terão o comprimento adequado à plataforma de sequenciação utilizada. O intervalo de tamanhos dos fragmentos pode ser ajustado em função dos requisitos específicos da experiência de sequenciação.
• Amplificação clonal por PCR: Após a fragmentação ultrassónica, os fragmentos de DNA são submetidos a reparação das extremidades, ligação de adaptadores e amplificação por PCR, para gerar as bibliotecas finais de sequenciação de DNA. Estas etapas preparam as moléculas de DNA fragmentadas para o processo de sequenciação, através da adição de sequências de adaptadores necessárias para a ligação à plataforma de sequenciação e que fornecem locais de ligação dos iniciadores para a amplificação por PCR.
• Sequenciação de DNA por síntese: Uma vez preparadas as bibliotecas de sequenciação, inicia-se o processo de sequenciação de DNA por síntese (SBS). Durante a SBS, a sequência de DNA é determinada pela adição sequencial de nucleótidos à cadeia complementar. Esta etapa envolve reações cíclicas de incorporação de nucleótidos, aquisição de imagens e clivagem, permitindo determinar a sequência de DNA com base nos sinais fluorescentes emitidos pelos nucleótidos incorporados.
• Sequenciação massivamente paralela: Na etapa final, os moldes de DNA amplificados e espacialmente separados são sequenciados simultaneamente de forma massivamente paralela. Esta abordagem de sequenciação com elevada capacidade de processamento permite gerar milhões a milhares de milhões de leituras de sequenciação numa única execução de sequenciação, permitindo determinar as sequências de DNA de forma eficiente e rápida.

Como funciona a fragmentação ultrassónica de DNA?

A sonicação, também conhecida como processamento acústico de amostras, é um método amplamente utilizado para fragmentar DNA. Para o cisalhamento ultrassónico de DNA, as amostras são expostas a ondas ultrassónicas em condições controladas. O princípio de funcionamento da fragmentação ultrassónica de DNA baseia-se nas vibrações e na cavitação geradas pelas ondas ultrassónicas. As forças de cisalhamento resultantes da cavitação ultrassónica (acústica) rompem as moléculas de DNA de elevado peso molecular. Os parâmetros de sonicação, como a intensidade (amplitude, duração), o modo de pulsação e a temperatura, permitem uma fragmentação precisa do DNA em fragmentos de um determinado comprimento pretendido. Embora o DNA seja frequentemente reduzido a 100 a 600 bp por ultrassonicação, podem obter-se fragmentos de DNA mais longos, até 1300 bp, quando se aplicam condições ultrassónicas mais suaves.

Controlo da temperatura para prevenir a degradação do DNA

A estrutura molecular de cadeia dupla do DNA é altamente sensível a temperaturas elevadas, pelo que o controlo exato da temperatura durante as etapas de preparação de amostras é um fator crucial para obter resultados de análise fiáveis.
Quer utilize os sonicadores ultrassónicos de sonda da Hielscher, o VialTweeter ou o UIP400MTP, a monitorização e o controlo contínuos da temperatura são assegurados por um sensor de temperatura conectável e pelo software inteligente do dispositivo. Para manter a temperatura dentro de um determinado intervalo, pode definir um limite superior e um limite inferior de temperatura. Consequentemente, o sonicador ultrassónico interrompe o funcionamento assim que este limite de temperatura é ultrapassado e retoma automaticamente a sonicação quando a temperatura tiver descido um ∆T definido.
O software sofisticado dos sonicadores ultrassónicos Hielscher assegura a manutenção fiável das condições ideais de tratamento das amostras.

Fragmentação de DNA de grandes quantidades de amostras com o sonicador ultrassónico de placas multipoços UIP400MTP

O número de amostras nas ciências da vida aumentou significativamente na última década. Isto significa que é necessário processar números muito elevados de amostras (por exemplo, 384, 1536 ou 3456 poços por microplaca) durante a preparação e a análise de amostras, em condições consistentemente iguais, para obter resultados comparáveis e válidos. Com o UIP400MTP, a Hielscher Ultrasonics acompanha a tendência de processamento de grandes quantidades de amostras. O UIP400MTP é um sonicador ultrassónico para preparação de amostras em microplacas. O UIP400MTP pode processar placas com 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 ou 3456 poços. Dependendo do tipo de microplaca, cada poço pode normalmente conter volumes de amostra entre dezenas de nanolitros e vários mililitros. Amplamente utilizado na investigação em ciências da vida, o UIP400MTP é muito frequentemente utilizado para preparar amostras antes de ensaios como ELISA (ensaio de imunoabsorção enzimática) ou PCR, antes de análises de proteínas, bem como para preparar cromatina antes de CHiP e CHiP-seq, identificar modificações de histonas e realizar outros tratamentos analíticos (por exemplo, eletroforese em gel, espectrometria de massa).
Saiba mais sobre o processamento de placas de PCR com elevada capacidade de processamento!

O VialTweeter para preparação de amostras em até 10 frascos

O VialTweeter é um sonicador ultrassónico de laboratório VialTweeter amplamente utilizado, que permite a sonicação eficaz e cómoda de até 10 frascos em simultâneo. Como os frascos e os tubos de ensaio (por exemplo, frascos Eppendorf, frascos criogénicos, tubos de centrifugação) são submetidos a sonicação indireta, evita-se qualquer contaminação cruzada. Como cada amostra recebe a mesma intensidade ultrassónica, todos os resultados de sonicação são homogéneos e reprodutíveis. O VialTweeter oferece todas as funcionalidades inteligentes dos nossos outros dispositivos digitais (por exemplo, menu inteligente, definições programáveis, controlo da temperatura, controlo remoto, etc.), assegurando assim o máximo conforto de utilização.

Sondas com múltiplos dedos para placas de micropoços

Disponíveis para os homogeneizadores ultrassónicos de sonda UP200Ht e UP200St, as sondas com 4 ou 8 dedos são uma opção cómoda para submeter várias amostras a sonicação simultaneamente, nas mesmas condições. Por exemplo, o sonotrodo MTP-24-8-96 é uma sonda de oito dedos, ideal para integração em sistemas automatizados ou para a preparação manual eficiente de amostras nos poços de placas multipoços. O sonotrodo com múltiplos dedos é ideal para a automatização em laboratórios onde se processam sobretudo copos de precipitação e tubos de ensaio com um sonotrodo ultrassónico convencional. As sondas com múltiplos dedos e as sondas convencionais podem ser trocadas rapidamente, em poucos minutos, transformando o sonicador ultrassónico de sonda única num dispositivo ultrassónico de rutura com múltiplas sondas.

Sonicadores ultrassónicos Hielscher para fragmentação de DNA

A Hielscher Ultrasonics oferece várias plataformas baseadas em ultrassons para a fragmentação de DNA, RNA e cromatina. Estas diferentes plataformas incluem sondas ultrassónicas (sonotrodos), soluções de sonicação indireta para a preparação simultânea de amostras em múltiplos tubos ou placas multipoços (por exemplo, placas de 96 poços, placas de microtitulação), sonorreatores e sonotrodos ultrassónicos em forma de copo. Todas as plataformas para cisalhamento de DNA são acionadas por processadores ultrassónicos de elevado desempenho, sintonizados em frequência, que podem ser controlados com precisão e proporcionam resultados reprodutíveis.

Processadores ultrassónicos para qualquer número e tamanho de amostras

Com os sonicadores ultrassónicos Hielscher para múltiplas amostras VialTweeter (para até 10 tubos de ensaio) e UIP400MTP (para microplacas/placas multipoços), é possível reduzir o tempo de processamento das amostras graças à ultrassonicação intensa e controlável com precisão, obtendo simultaneamente a distribuição de tamanhos de fragmentos de DNA e o rendimento pretendidos. A fragmentação ultrassónica de DNA torna a preparação de amostras eficiente, fiável e escalável. Os protocolos podem ser escalados linearmente de uma para numerosas amostras através da aplicação de ultrassons constantemente controlados.
Os sonicadores ultrassónicos de sonda com um a cinco dedos são ideais para preparar números mais reduzidos de amostras. Os sonicadores ultrassónicos de laboratório Hielscher estão disponíveis em vários tamanhos, pelo que podemos recomendar-lhe o dispositivo ideal para a sua aplicação e os seus requisitos.

Controlo preciso do processo

As definições de sonicação controláveis com precisão são cruciais, uma vez que a sonicação exaustiva pode destruir o DNA, o RNA e a cromatina, mas um cisalhamento ultrassónico inadequado resulta em fragmentos de DNA e cromatina demasiado longos. Os sonicadores ultrassónicos digitais da Hielscher podem ser facilmente ajustados para parâmetros de sonicação precisos. Também é possível guardar definições específicas de sonicação como definições programadas, para repetir rapidamente o mesmo procedimento.
Todas as sonicações são automaticamente registadas e guardadas como ficheiro CSV num cartão SD integrado. Isto permite documentar com exatidão os ensaios realizados e rever facilmente as execuções de sonicação.
Através do controlo remoto por navegador, todos os sonicadores ultrassónicos digitais podem ser operados e monitorizados através de qualquer navegador comum. Não é necessário instalar software adicional, uma vez que uma ligação LAN permite uma configuração muito simples de ligar e utilizar.


Máxima facilidade de utilização na preparação ultrassónica de amostras

Todos os sonicadores ultrassónicos Hielscher são concebidos para fornecer ultrassons de elevado desempenho, sendo simultaneamente sempre muito fáceis de utilizar e operar. Todas as definições estão bem estruturadas num menu claro, facilmente acessível através de um ecrã tátil a cores ou do controlo remoto por navegador. O software inteligente, com definições programáveis e registo automático de dados, assegura definições de sonicação ótimas para resultados fiáveis e reprodutíveis. A interface de menu clara e fácil de utilizar torna os sonicadores ultrassónicos Hielscher dispositivos eficientes e fáceis de utilizar.
A tabela abaixo dá-lhe uma indicação da capacidade aproximada de processamento dos nossos sonicadores ultrassónicos de laboratório, que são ideais para tarefas de preparação de amostras, como a fragmentação de DNA e RNA, a lise celular e a extração de proteínas: