Fragmentação ultra-sónica de ADN para sequenciação de nova geração
A sequenciação de nova geração (NGS) exige o corte e a fragmentação fiáveis do ADN genómico para sequenciar as cadeias de ADN genómico e criar bibliotecas de genomas. A fragmentação controlada do ADN em fragmentos de ADN é uma etapa essencial de preparação da amostra necessária antes de o ADN ser sequenciado. A ultrassonografia é comprovadamente uma técnica eficiente e fiável para a fragmentação do ADN de determinado comprimento. Protocolos de fragmentação de DNA ultra-sônico alcançar resultados de fragmentação reprodutíveis. Hielscher ultrasonicators são capazes de produzir uma ampla gama de distribuições de tamanho de fragmento de DNA genômico, precisamente controlável através dos parâmetros operacionais. Uma vez que os sistemas de cisalhamento de DNA ultra-sônico Hielscher estão disponíveis para frascos simples e múltiplos, bem como para microplacas, a preparação da amostra torna-se altamente eficiente.
O Sonicador de placas UIP400MTP para a preparação de amostras de elevado rendimento sonicam uniformemente as amostras em placas de microtitulação, multipoços e placas de 96 poços
- resultados repetíveis / reproduzíveis
- ajustável com precisão para obter um determinado comprimento de fragmento
- Processamento rápido
- resultados consistentes de fragmentação de ADN
- dispositivos para quaisquer volumes de amostras (por exemplo, frascos múltiplos ou microplacas)
- elevado rendimento
- controlo preciso da temperatura
- funcionamento simples e fácil de utilizar
Sequenciação de nova geração: Fragmentação ultra-sónica do ADN para preparação de bibliotecas
Para efetuar uma sequenciação de nova geração, é necessário realizar as três etapas básicas de (1) preparação da biblioteca, (2) sequenciação e (3) análise de dados. Durante a preparação da biblioteca, o ADN é fragmentado e, em seguida, as extremidades dos fragmentos são reparadas (polidas) através da adição de uma única base de adenina e os fragmentos alvo são convertidos em ADN de cadeia dupla. Finalmente, os chamados adaptadores são ligados por ligação, PCR ou marcação, de modo a que o produto final da biblioteca de ADN possa ser quantificado para sequenciação.
Fragmentação do ADN por Sonicação: Especialmente quando as tecnologias de sequenciamento de leitura curta, como Illumina, que não podem ler fragmentos de DNA mais longos prontamente, os suportes de DNA devem ser fragmentados para um determinado tamanho que pode ser alcançado de forma confiável por ultrassom.
A ultrassonografia pode ser utilizada de forma fiável para a fragmentação do ADN, do ARN e da cromatina.
Sequenciação de nova geração – preparação da biblioteca
A fragmentação ultra-sónica do ADN é normalmente utilizada na preparação de bibliotecas de sequenciação de ADN para plataformas de sequenciação de nova geração (NGS). Esta técnica é utilizada para quebrar moléculas de ADN em fragmentos mais pequenos de um intervalo de tamanho desejado, o que facilita os passos subsequentes na preparação da biblioteca. A fragmentação ultra-sónica do ADN é normalmente necessária durante o passo de preparação da biblioteca dos fluxos de trabalho NGS para fragmentar o ADN genómico em pedaços mais pequenos adequados para o processamento e sequenciação a jusante. Desempenha um papel crucial para garantir o sucesso da experiência de sequenciação, gerando fragmentos de ADN com a gama de tamanhos adequada para a plataforma de sequenciação específica que está a ser utilizada.
Análises electroforéticas do ADN genómico de E. coli EDL933 submetido a ultra-sons de 0 - 15 min. L indica o DNA Ladder. (Basselet et al. 2008)
Sequenciação de nova geração – Etapas do processo:
- Fragmentação ultra-sónica do ADN: Antes da construção da biblioteca, o ADN genómico é fragmentado em pedaços mais pequenos e mais manejáveis. A fragmentação ultra-sónica envolve a utilização de ondas sonoras de alta frequência para cisalhar as moléculas de ADN em fragmentos com o tamanho pretendido. Este passo é crucial porque ajuda a garantir que as leituras de sequenciação geradas posteriormente terão o comprimento adequado para a plataforma de sequenciação utilizada. O intervalo de tamanho dos fragmentos pode ser ajustado com base nos requisitos específicos da experiência de sequenciação.
- Amplificação clonal por PCR: Após a fragmentação por ultra-sons, os fragmentos de ADN são submetidos a reparação de extremidades, ligação de adaptadores e amplificação por PCR para gerar as bibliotecas finais de sequenciação de ADN. Estes passos preparam as moléculas de ADN fragmentado para o processo de sequenciação, adicionando sequências de adaptadores necessárias para a ligação à plataforma de sequenciação e fornecendo locais de priming para a amplificação por PCR.
- Sequenciação de ADN por síntese: Uma vez preparadas as bibliotecas de sequenciação, inicia-se o processo de sequenciação de ADN por síntese (SBS). Durante a SBS, a sequência de ADN é determinada pela adição sequencial de nucleótidos à cadeia complementar. Esta etapa envolve reacções cíclicas de incorporação de nucleótidos, imagiologia e clivagem, permitindo a determinação da sequência de ADN com base nos sinais fluorescentes emitidos pelos nucleótidos incorporados.
- Sequenciação maciçamente paralela: Na etapa final, os modelos de DNA amplificados e segregados espacialmente são sequenciados simultaneamente de forma maciçamente paralela. Esta abordagem de sequenciação de elevado rendimento permite a geração de milhões a milhares de milhões de leituras de sequenciação numa única execução de sequenciação, permitindo a determinação rápida e eficiente de sequências de ADN.
Como funciona a fragmentação ultra-sónica do ADN?
A sonicação, também conhecida como processamento acústico de amostras, é um método amplamente utilizado para fragmentar o ADN. Para a fragmentação ultra-sónica do ADN, as amostras são expostas a ondas ultra-sónicas em condições controladas. O princípio de funcionamento da fragmentação ultra-sónica do ADN baseia-se nas vibrações e na cavitação geradas pelas ondas de ultra-sons. As forças de cisalhamento que resultam da cavitação ultra-sónica (acústica) quebram moléculas de ADN de elevado peso molecular. O ajuste da sonicação, como a intensidade (amplitude, duração), o modo de pulsação e a temperatura, permite uma fragmentação precisa do ADN até um determinado comprimento desejado de fragmentos de ADN. Embora o ADN seja frequentemente reduzido para 100 a 600 pb por ultra-sons, podem ser obtidos fragmentos de ADN mais longos, até 1300 pb, quando são aplicadas condições ultra-sónicas mais suaves.
Corte ultrassónico do ADN durante a PIC – imunoprecipitação da cromatina
Adaptado de Jkwchui sob CC-BY-SA.03
Controlo da temperatura para evitar a degradação do ADN
A forma molecular de cadeia dupla do ADN é altamente sensível a temperaturas elevadas, pelo que o controlo exato da temperatura durante os passos de preparação da amostra é um fator crucial para resultados de análise fiáveis.
Quer esteja a utilizar os ultrassons de sonda da Hielscher, o VialTweeter ou o UIP400MTP – A monitorização e o controlo contínuos da temperatura são assegurados por um sensor de temperatura conectável e pelo software do dispositivo inteligente. Para manter a temperatura dentro de um determinado intervalo, é possível definir um limite de temperatura superior e inferior. Consequentemente, o ultrassonicador fará uma pausa assim que este limite de temperatura for excedido e continuará automaticamente a sonicar quando a temperatura tiver baixado um ∆T definido.
O software sofisticado dos ultrassons Hielscher garante a manutenção fiável das condições ideais de tratamento das amostras.
Fragmentação do ADN de amostras de massa com o ultrassom UIP400MTP Multi-Well Plate
O número de amostras nas ciências da vida aumentou significativamente na última década. Isso significa que um número muito elevado de amostras (por exemplo, 384, 1536 ou 3456 poços por microplaca) deve ser processado durante a preparação e análise de amostras em condições consistentemente iguais, a fim de obter resultados comparáveis e válidos. Com o UIP400MTP, a Hielscher Ultrasonics segue a tendência do processamento de amostras em massa. O UIP400MTP é um ultrasonicator para a preparação de amostras usando microplacas. O UIP400MTP pode processar placas com 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536, ou 3456 poços. Dependendo do tipo de microplaca, cada poço pode conter volumes de amostra entre dezenas de nanolitros e vários mililitros. Amplamente utilizada na investigação em ciências da vida, a UIP400MTP é muito comummente utilizada para a preparação de amostras antes de ensaios como ELISA (ensaio de imunoabsorção enzimática) ou PCR, antes da análise de proteínas, bem como para a preparação de cromatina antes de CHiP e CHiP-seq, identificação de modificações de histonas e outros tratamentos analíticos (por exemplo, eletroforese em gel, espetrometria de massa).
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O VialTweeter para a preparação de amostras de até 10 frascos
O VialTweeter é um ultrassom de laboratório amplamente utilizado VialTweeter que permite a sonicação eficaz e confortável de até 10 frascos simultaneamente. Uma vez que os frascos e os tubos de ensaio (por exemplo, frascos Eppendorf, frascos criogénicos, tubos de centrifugação) são sonicados indiretamente, evita-se qualquer contaminação cruzada. Como a mesma intensidade de ultra-sons é fornecida a cada amostra, todos os resultados da sonicação são homogéneos e reproduzíveis. O VialTweeter oferece todas as funcionalidades inteligentes, tal como os nossos outros dispositivos digitais (por exemplo, menu inteligente, definições programáveis, controlo de temperatura, controlo remoto, etc.), de modo a garantir o máximo conforto para o utilizador.
Sondas Multi-Dedos para Placas de Micropoços
Disponível para os homogeneizadores de sonda ultra-sónica UP200Ht e UP200St, as sondas multi-dedos com 4 ou 8 dedos são uma opção confortável para sonicar várias amostras ao mesmo tempo sob as mesmas condições. Por exemplo, o sonotrodo MTP-24-8-96 é uma sonda de oito dedos, que é ideal para a integração em sistemas automatizados ou para a preparação manual eficiente de amostras dos poços de placas com vários poços. O sonotrodo com vários dedos é ideal para laboratórios automatizados, onde são processados principalmente copos e tubos de ensaio utilizando um sonotrodo ultrassónico padrão. As sondas multi-dedos e padrão podem ser rapidamente trocadas em poucos minutos, transformando o ultrassonicador de sonda única num disruptor ultrassónico de sonda múltipla.
Hielscher Ultrasonicators para fragmentação de DNA
Hielscher Ultrasonics oferece várias plataformas baseadas em ultrassom para DNA, RNA, e fragmentação da cromatina. Estas diferentes plataformas incluem sondas ultra-sónicas (sonotrodos), soluções de sonicação indireta para a preparação simultânea de amostras de vários tubos ou placas de vários poços (por exemplo, placas de 96 poços, placas de microtitulação), sonoreactores e cúpulas ultra-sónicas. Todas as plataformas de cisalhamento de ADN são alimentadas por processadores ultra-sónicos de alto desempenho, sintonizados em frequência, que são controlados com precisão e fornecem resultados reprodutíveis.
Processadores ultra-sónicos para qualquer número e tamanho de amostra
Com os ultrasonicators multi-amostra de Hielscher VialTweeter (para até 10 tubos de ensaio) e UIP400MTP (para microplacas / placas multiwell) torna-se facilmente possível reduzir o tempo de processamento da amostra devido à ultrasonication intensa e precisamente controlável enquanto obtém a distribuição de tamanho de fragmento de DNA desejado e rendimento. A fragmentação ultra-sónica do ADN torna a preparação de amostras eficiente, fiável e escalável. Os protocolos podem ser escalonados linearmente de uma para várias amostras, aplicando ultra-sons constantemente controlados.
Os ultrassons de sonda com um a cinco dedos são ideais para a preparação de amostras mais pequenas. Os ultrassons de laboratório da Hielscher estão disponíveis em vários tamanhos para que possamos recomendar-lhe o dispositivo ideal para a sua aplicação e requisitos.
controlo preciso do processo
Configurações de sonicação precisamente controláveis são cruciais, uma vez que a sonificação exaustiva pode destruir DNA, RNA e cromatina, mas o cisalhamento ultra-sônico inadequado resulta em fragmentos de DNA e cromatina muito longos. Os ultrasonicadores digitais da Hielscher podem ser facilmente ajustados para um parâmetro de sonicação preciso. Configurações específicas de sonicação também podem ser salvas como configuração programada para repetição rápida do mesmo procedimento.
Todas as sonicações são automaticamente protocoladas e armazenadas como ficheiro CSV num cartão SD incorporado. Isto permite uma documentação precisa dos ensaios realizados e torna possível rever facilmente as execuções de sonicação.
Através do controlo remoto via browser, todos os ultrassons digitais podem ser operados e monitorizados através de qualquer browser padrão. Não é necessária a instalação de software adicional, uma vez que uma ligação LAN permite uma configuração plug-n-play muito simples.
A mais elevada facilidade de utilização na preparação de amostras por ultra-sons
Todos os ultrassons Hielscher são concebidos para proporcionar ultra-sons de elevado desempenho, sendo ao mesmo tempo muito fáceis de utilizar e de operar. Todas as definições estão bem estruturadas num menu claro, ao qual se pode aceder facilmente através do ecrã tátil colorido ou do controlo remoto do navegador. O software inteligente com definições programáveis e registo automático de dados garante definições de sonicação ideais para resultados fiáveis e reprodutíveis. A interface de menu limpa e fácil de usar transforma os ultrassons Hielscher em dispositivos fáceis de utilizar e eficientes.
A tabela abaixo dá-lhe uma indicação da capacidade de processamento aproximada dos nossos ultrassons de laboratório, que são ideais para tarefas de preparação de amostras, tais como fragmentação de ADN e ARN, lise celular, bem como extração de proteínas:
| Dispositivo | Potência [W] | Tipo | Volume [mL] |
|---|---|---|---|
| UIP400MTP | 400 | para microplacas | 6 – 3456 poços | VialTweeter | 200 | para até 10 frascos mais possibilidade de fixação | 0.5 – 1.5 |
| UP50H | 50 | Tipo de sonda | 0.01 – 250 |
| UP100H | 100 | Tipo de sonda | 0.01 – 500 |
| UP200Ht | 200 | Tipo de sonda | 0.1 – 1000 |
| UP200St | 200 | Tipo de sonda | 0.1 – 1000 |
| UP400ST | 400 | Tipo de sonda | 5.0 – 2000 |
| CupHorn | 200 | CupHorn, sonoreactor | 10 – 200 |
| GDmini2 | 200 | célula de fluxo livre de contaminação |
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A unidade ultra-sónica de preparação de amostras múltiplas VialTweeter permite a sonicação simultânea de até 10 frascos. Com o dispositivo de fixação VialPress, até 4 tubos adicionais podem ser pressionados para a frente para uma sonicação intensa.
O sonotrodo MTP-24-8-96 tem oito sondas ultra-sónicas para a sonicação dos poços das placas de microtitulação.
Literatura / Referências
- Qiyun Liang, Christoph Ratzke (2025): Lysing diverse bacteria with the Hielscher UIP400MTP for DNA sequencing. Protocol Uni Tübingen 2025.
- Poptsova, M., Il’icheva, I., Nechipurenko, D. et al. (2014): Non-random DNA fragmentation in next-generation sequencing. Scientific Reports 4, 4532; 2014.
- Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Sample processing for DNA chip array-based analysis of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). Microbial Cell Factories 7:29. 2008.
- Wang Y., Joshu C.E., Curtis S.D., Douville C., Burk V.A., Ru M., Popoli M., Ptak J., Dobbyn L., Silliman N., Coresh J., Boerwinkle E., Prizment A., Bettegowda C., Kinzler K.W., Papadopoulos N., Platz E.A., Vogelstein B. (2025): Detection of cancers three years prior to diagnosis using plasma cell-free DNA. Cancer Discovery 2025 May.
- Doublier S., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA Silencing Reverts the Resistance to Doxorubicin in Human Colon Cancer Cells. Molecular Cancer Research 6(10), 2008.
- Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid N.H.H., Simonsson M. (2008): Method evaluation of Fusarium DNA extraction from mycelia and wheat for down-stream real-time PCR quantification and correlation to mycotoxin levels. Journal of Microbiological Methods 2008.
- Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Characterization of the growth behavior of Leishmania tarentolae – a new expression system for recombinant proteins. Journal of Basic Microbiology 47, 2007. 384–393.
- Ristola M., Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Welsh G. I., Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Regulation of Neph3 gene in podocytes – key roles of transcription factors NF-κB and Sp1. BMC Molecular Biology 10:83, 2009.
- Rodriguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado M. A. (2008): Genome-wide tracking of unmethylated DNA Alu repeats in normal and cancer cells. Nucleic Acids Research Vol. 36, No. 3, 2008. 770-784.
- Weiske J. Huber O. (2006): The Histidine Triad Protein Hint1 Triggers Apoptosis Independent of Its Enzymatic Activity. The Journal of Biological chemistry. Vol. 281, No. 37, 2006. 27356–27366.
Fatos, vale a pena conhecer
O que é a Sequenciação de Nova Geração?
A sequenciação de nova geração, também designada por sequenciação de nova geração (NGS), sequenciação de alto rendimento ou sequenciação de segunda geração, refere-se à abordagem de sequenciação paralela maciça, em que quantidades muito grandes (maciças) de ADN de milhões de fragmentos são sequenciadas simultaneamente em paralelo por execução.
Para efetuar uma sequenciação de nova geração, as três etapas básicas de
- preparação da biblioteca,
- sequenciação, e
- Análise de dados
são necessários.
Durante a preparação da biblioteca, as cadeias de ADN devem ser fragmentadas em fragmentos de ADN de um determinado comprimento. A sonicação é uma das técnicas preferidas para fragmentar o ADN.
Durante o processo de sequenciação do ADN, a ordem dos nucleótidos no ADN – conhecida como sequência do ácido nucleico - é determinada. A sequência do ácido nucleico é composta por quatro bases nucleotídicas - adenina, citosina, guanina, timina – que código para informação.
A sequenciação de nova geração está a impulsionar a investigação no domínio das ciências da vida e da medicina personalizada, uma vez que a sequenciação de ADN e ARN é muito utilizada na investigação genómica, na investigação do cancro, na investigação de doenças raras e complexas, na investigação microbiana, na agrigenómica e em muitos outros domínios de investigação.
Sequenciação de nova geração vs Sequenciação de Sanger
Enquanto que com a sequenciação de nova geração (NGS) é possível sequenciar um grande número de amostras genómicas, a sequenciação de Sanger (também conhecida como método de terminação de cadeia ou sequenciação de primeira geração) só tem capacidade para sequenciar pequenos números de amostras. A sequenciação de Sanger apenas sequencia um único fragmento de ADN de cada vez e pode ser realizada num único dia. Devido à sua exatidão, a sequenciação Sanger é também considerada a tecnologia de referência, que é utilizada para verificar os resultados obtidos pela sequenciação de nova geração.
A sequenciação Sanger atinge comprimentos de leitura de aproximadamente 800 pb (normalmente 500-600 pb com ADN não enriquecido). Os comprimentos de leitura mais longos na sequenciação Sanger apresentam vantagens significativas em relação a outros métodos de sequenciação, especialmente em termos de sequenciação de regiões repetitivas do genoma. O desafio dos dados de sequenciação de leituras curtas é particularmente importante na sequenciação de novos genomas (de novo) e na sequenciação de segmentos genómicos altamente rearranjados, tipicamente os observados em genomas de cancro ou em regiões de cromossomas que apresentam variações estruturais. [cp. Morozova e Marra, 2008]
ADN – Ácido desoxirribonucleico – As suas formas e funções
Cada forma de ADN tem caraterísticas e aplicações únicas, contribuindo para um vasto espetro de campos de investigação, incluindo a oncologia, a genética, a ciência forense e a biologia evolutiva. Os sonicadores Hielscher são uma solução altamente eficiente e fiável para isolar e fragmentar o ADN e o ARN para fins de análise. Na lista abaixo, explicamos-lhe as formas específicas de ADN e categorizamo-las com base no seu contexto biológico e funções:
- ADN genómico (gDNA)
ADN genómico (gDNA): O conjunto completo de ADN de um organismo, incluindo as regiões codificantes (genes) e não codificantes. - ADN extracelular
ADN tumoral circulante (ctDNA): Fragmentos de ADN libertados na corrente sanguínea pelas células tumorais.
ADN livre de células (cfDNA): Fragmentos de ADN que circulam livremente na corrente sanguínea, provenientes de vários tecidos. - ADN circular extracromossómico (eccDNA): Moléculas circulares de ADN que se encontram fora dos cromossomas nas células eucarióticas.
ADN viral: ADN proveniente de vírus, integrado no genoma do hospedeiro ou como ADN epissomal. - ADN mitocondrial
ADN mitocondrial (ADNmt): ADN localizado na mitocôndria, herdado por via materna e envolvido na produção de energia. - ADN plasmídico
ADN plasmídico: Pequenas moléculas circulares de ADN que se replicam independentemente do ADN cromossómico, normalmente encontradas em bactérias e utilizadas na engenharia genética. - ADN nuclear
ADN nuclear (nDNA): ADN contido no núcleo das células eucarióticas e que constitui a maior parte do material genético de um organismo. - ADN de célula única
ADN de célula única (scDNA): ADN extraído de uma única célula, utilizado para uma análise genómica detalhada ao nível de cada célula. - ADN recombinante
ADN recombinante (rDNA): Moléculas de ADN formadas por métodos laboratoriais de recombinação genética para reunir material genético de várias fontes. - Formulários especializados
ADN ambiental (eDNA): ADN recolhido de amostras ambientais (solo, água) sem isolar os organismos de origem
ADN antigo (aDNA): ADN extraído de espécimes antigos, fornecendo conhecimentos sobre biologia evolutiva e populações antigas. - ADN cromossómico
ADN cromossómico: ADN que constitui os cromossomas no núcleo da célula, englobando tanto as regiões codificantes como as não codificantes. - Formas virais e sintéticas
ADN viral: ADN derivado de vírus, que pode ser integrado em genomas de hospedeiros ou existir como entidades independentes.
ADN sintético: Sequências de ADN sintetizadas artificialmente e criadas através de processos químicos, frequentemente utilizadas na investigação e na biotecnologia.
A Hielscher Ultrasonics fabrica homogeneizadores ultra-sónicos de alto desempenho a partir de laboratório para dimensão industrial.