Fragmentação de DNA ultrassônico para sequenciamento de próxima geração

O Sequenciamento da Próxima Geração (NGS) requer a tesoura e fragmentação confiáveis do DNA genômico, a fim de sequenciar fios de DNA genômicos e criar bibliotecas de genomas. A fragmentação controlada do DNA em fragmentos de DNA é uma etapa essencial de preparação da amostra necessária antes que o DNA seja sequenciado. A ultrassonização é comprovada como uma técnica eficiente e confiável para fragmentação de DNA de determinado comprimento. Protocolos de fragmentação de DNA ultrassônicos alcançam resultados reprodutíveis de fragmentação. Os ultrassonicadores hielscher são capazes de produzir uma ampla gama de distribuições genômicas de tamanho de fragmentos de DNA, precisamente controláveis através dos parâmetros operacionais. Uma vez que os sistemas de cisalhamento de DNA ultrassônico hielscher estão disponíveis para frascos únicos e múltiplos, bem como para microplacas, a preparação da amostra torna-se altamente eficiente.

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Ultrasonic DNA fragmentation is frequently used as sample preparation step in Next Generation Sequencing (NGS)

Electroforética análises de ADN genómico de E. coli EDL933 submetido a 0 - 15 minutos de ultra-sons. L indica a escada de ADN. (Basselet et al. 2008)

Vantagens da Fragmentação do DNA ultrassônico

  • resultados repetitivos/reprodutíveis
  • precisamente ajustável para obter certo comprimento fragmento
  • processamento rápido
  • resultados consistentes de fragmentação de DNA
  • dispositivos para quaisquer volumes de amostra (por exemplo, frascos múltiplos ou microplacões)
  • alta produtividade
  • controle preciso de temperatura
  • operação simples e fácil de usar

Sequenciamento de próxima geração: Fragmentação de DNA ultrassônico para preparação da biblioteca

Para realizar um sequenciamento de próxima geração, devem ser realizadas as três etapas básicas de (1) preparação da biblioteca, (2) sequenciamento e (3) análise de dados. Durante a preparação da biblioteca, o DNA é fragmentado, então as extremidades do fragmento são reparadas (polidas) adicionando uma única base de adenina e os fragmentos alvo são convertidos em DNA de dupla cadeia. Finalmente os chamados adaptadores são anexados por ligadura, PCR ou tagmentação para que o produto final de DNA da biblioteca possa ser quantificado para sequenciamento.
Fragmentação de DNA usando sônicação: Especialmente quando tecnologias de sequenciamento de leitura curta, como a Illumina, que não consegue ler fragmentos de DNA mais longos prontamente, as posições de DNA devem ser fragmentadas a um certo tamanho que pode ser alcançado de forma confiável pela ultrassônica.
A ultrassônica pode ser usada de forma confiável para fragmentação de DNA, RNA e cromatina.

Como funciona a fragmentação do DNA ultrassônico?

A sônicação, também conhecida como processamento de amostras acústicas, é um método amplamente utilizado para fragmentar o DNA. Para a cisalhamento de DNA ultrassônico, as amostras são expostas a ondas ultrassônicas sob condição controlada. O princípio de trabalho da fragmentação do DNA ultrassônico baseia-se nas vibrações e cavitação geradas pelas ondas de ultrassom. As forças de cisalhamento resultantes da cavitação ultrassônica (acústica) quebram moléculas de DNA de alto peso molecular. A configuração da sônicação como intensidade (amplitude, duração), modo de pulsação e temperatura permitem a fragmentação precisa do DNA a um certo comprimento desejado de fragmentos de DNA. Enquanto o DNA muitas vezes é reduzido a 100 a 600 bp usando ultrassônica, fragmentos de DNA mais longos de até 1300 bp podem ser obtidos quando condições ultrassônicas mais brandas são aplicadas.

Ultrasonic homogenizers are reliable for DNA shearing

Cisalhamento de DNA ultrassônico durante chip – imunoprecipitação da cromatina
Adaptado de Jkwchui sob CC-BY-SA.03

Controle de temperatura para prevenir a degradação do DNA

A forma molecular duplamente encalhada do DNA é altamente sensível a temperaturas elevadas, de modo que o controle exato sobre a temperatura durante as etapas de preparação da amostra é um fator crucial para resultados de análise confiáveis.
Se você está usando ultrassonicadores de sonda hielscher, o VialTweeter ou o UIP400MTP – o monitoramento e o controle contínuo de temperatura são assegurados devido a um sensor de temperatura plugável e ao software do dispositivo inteligente. Para manter a temperatura dentro de uma determinada faixa, você pode definir um limite de temperatura superior e mais baixo. Consequentemente, o ultrassônico fará uma pausa assim que este limite de temperatura for excedido e automaticamente continuará a sonicar quando a temperatura tiver baixado por um conjunto ∆T.
O software sofisticado dos ultrassonicadores Hielscher garante a manutenção confiável das condições ideais de tratamento amostral.

Fragmentação de DNA de amostra de massa com o Ultrassonicador de placa multi-bem UIP400MTP

Ultrasonic Multi-Sample Preparation Unit UIP400MTP for multi-well plate sonicationOs números de amostras em ciências da vida aumentaram significativamente na última década. Isso significa que um número muito alto de amostras (por exemplo, 384, 1536 ou 3456 poços por microplacão) deve ser processado durante a preparação e análise da amostra em condições consistentemente iguais, a fim de obter resultados comparáveis e válidos. Com o UIP400MTP, a Hielscher Ultrasonics está seguindo a tendência de processamento de amostras em massa. O UIP400MTP é um ultrassônico para preparação de amostras usando microplacas. O UIP400MTP pode processar placas com 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 ou 3456 poços. Dependendo do tipo de microplacão, cada poço pode normalmente conter volumes amostrais entre dezenas de nanolitres a vários mililitros. Amplamente utilizado em pesquisas de ciências da vida, o UIP400MTP é muito comumente usado para preparação de amostras antes de ensaios como ELISA (ensaio imunosorbent ligado à enzima) ou PCR, antes da análise de proteínas, bem como para preparação de cromatina antes de CHiP e CHiP-seq, identificação de modificação de histona e outros tratamentos analíticos (por exemplo, eletrofose gel, espectrometria de massa).

O VialTweeter para aparação de amostras de até 10 frascos

configuração VialTweeter completa: sonotrode VialTweeter pelo processador ultra-UP200StO VialTweeter é um ultrassonador de laboratório amplamente utilizado VialTweeter que permite a sonicação eficaz e confortável de até 10 frascos simultaneamente. Uma vez que os frascos e tubos de ensaio (por exemplo, frascos de Eppendorf, frascos de criogênicos, tubos de centrífuga) são sonicados indiretamente, qualquer contaminação cruzada é evitada. Como a mesma intensidade de ultrassom é entregue a cada amostra, todos os resultados da sônica são homogêneos e reprodutíveis. O VialTweeter oferece todos os recursos inteligentes, como nossos outros dispositivos digitais (por exemplo, menu inteligente, configurações programáveis, controle de temperatura, controle remoto etc.) para que o maior conforto do usuário seja garantido.

Sondas de vários dedos para placas de microwell

4 probe heads or 4 sonotrodes for simultaneous sonication of 4 samples at the same intensity with the Hielscher 200 watts ultrasonicator models UP200ST and UP200HTDisponível para os homogeneizadores de sonda ultrassônicas UP200Ht e UP200St, sondas de vários dedos com 4 ou 8 dedos são uma opção confortável para sonicar várias amostras ao mesmo tempo em mesmas condições. Por exemplo, o sonotrode MTP-24-8-96 é uma sonda de oito dedos, ideal para a integração em sistemas automatizados ou a eficiente preparação manual de amostras dos poços de placas multi-poços. O sonotrode multi-dedo é ideal para automatizado para laboratórios, onde a maioria dos béquers e tubos de ensaio usando um sonotrode ultrassônico padrão são processados. As sondas multidireitas e padrão podem ser rapidamente inter-alteradas em poucos minutos transformando o ultrassônico de uma única sonda em um disruptor ultrassônico de várias sondas.

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Hielscher Ultrasonicators para Fragmentação de DNA

Hielscher Ultrasonics oferece várias plataformas baseadas em ultrassom para fragmentação de DNA, RNA e cromatina. Essas diferentes plataformas incluem sondas ultrassônicas (sonotrodes), soluções de sônica indireta para a preparação simultânea de amostras de múltiplos tubos ou placas multi-poços (por exemplo, placas de 96 poços, placas de microtítmetro), sonoretores e cuphorns ultrassônicos. Todas as plataformas para cisalhamento de DNA são alimentadas por processadores ultrassônicos de alto desempenho, com frequência, que são precisamente controláveis e entregam resultados reprodutíveis.

Processadores ultrassônicos para qualquer número de amostra e tamanho

Com os ultrassonicadores multi-amostras de Hielscher VialTweeter (para até 10 tubos de ensaio) e UIP400MTP (para microplacas/ placas multiwell) torna-se facilmente possível reduzir o tempo de processamento da amostra devido à ultrassonização intensa e precisamente controlável, ao mesmo tempo em que se obtém a distribuição e rendimento do tamanho e rendimento do fragmento de DNA desejado. A fragmentação do DNA ultrassônico torna a preparação da amostra eficiente, confiável e escalável. Os protocolos podem ser dimensionados linearmente de uma para numerosas amostras aplicando ultrassom constantemente controlado.
Ultrassonicadores de sonda com um a cinco dedos são ideais para a preparação de números amostrais menores. Os ultrassonicadores de laboratório da Hielscher estão disponíveis em vários tamanhos para que possamos recomendá-lo o dispositivo ideal para sua aplicação e requisitos.

controle de processo preciso

Hielscher ultrasonicators can be remotely controlled via browser control. Sonication parameters can be monitored and adjusted precisely to the process requirements.As configurações de sônica controláveis são cruciais, uma vez que a sonificação exaustiva pode destruir DNA, RNA e cromatina, mas a cisalhamento ultrassônico inadequado resulta em fragmentos de DNA e cromatina muito longos. Os ultrassonicadores digitais de Hielscher podem ser facilmente definidos como parâmetros de sônica precisa. Configurações específicas de sônica também podem ser salvas como configuração programada para repetição rápida do mesmo procedimento.
Toda a sônicação é automaticamente protocolada e armazenada como arquivo CSV em um cartão SD embutido. Isso permite uma documentação precisa dos ensaios realizados e torna possível revisar as corridas de sônica facilmente.
Através do controle remoto do navegador, todos os ultrasonicadores digitais podem ser operados e monitorados através de qualquer navegador padrão. A instalação de software adicional não é necessária, uma vez que uma conexão LAN permite uma configuração muito simples de plug-n-play.

Maior simpatia do usuário na preparação de amostras ultrassônicas

Todos os ultrassonicadores hielscher são projetados para fornecer ultrassom de alto desempenho, ao mesmo tempo sempre sendo muito fáceis de usar e fáceis de operar. Todas as configurações são bem estruturadas em um menu claro, que pode ser facilmente acessado através de touch-display colorido ou controle remoto do navegador. O software inteligente com configurações programáveis e gravação automática de dados garante ótimas configurações de sônica para resultados confiáveis e reprodutíveis. A interface de menu limpa e fácil de usar transforma os ultrassonicadores hielscher em dispositivos fáceis de usar e eficientes.
A tabela abaixo dá-lhe uma indicação da capacidade aproximada de processamento de nossos ultrassonicadores de laboratório, que são ideais para tarefas de preparação de amostras, como fragmentação de DNA e RNA, lise celular, bem como extração de proteínas:

Dispositivo Potência [W] Tipo Volume [ml]
UIP400MTP 400 para microplacões 6 – 3456 poços
VialTweeter 200 para até 10 frascos mais possibilidade de fixação 0.5 – 1,5
UP50H 50 Sonda de tipo 00,01 – 250
UP100H 100 Sonda de tipo 00,01 – 500
UP200Ht 200 Sonda de tipo 0.1 – 1000
UP200St 200 Sonda de tipo 0.1 – 1000
UP400St 400 Sonda de tipo 5 – 2000
Cuphorn 200 CupHorn, sonoreactor 10 – 200
GDmini2 200 célula de fluxo livre de contaminação

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The VialTweeter is a MultiSample Ultraonicator that allows for reliable sample preparation under precisely controlled temperature conditions.

A unidade de preparação ultrassônica de várias amostras VialTweeter permite a sônica simultânea de até 10 frascos. Com o dispositivo de fixação VialPress, até 4 tubos adicionais podem ser pressionados à frente para sônicação intensa.


O sonotrode MTP-24-8-96 tem oito sondas ultrassônicas para a sônica dos poços de placas de microtiter.

O sonotrode MTP-24-8-96 tem oito sondas ultrassônicas para a sônica dos poços de placas de microtiter.



Literatura / Referências

Fatos, vale a pena conhecer

O que é sequenciamento da próxima geração?

Sequenciamento de próxima geração, também Next Gen Sequencing (NGS), sequenciamento de alta produtividade ou sequenciamento de segunda geração, refere-se à abordagem de sequenciamento paralelo maciço, onde grandes (massivas) quantidades de DNA de milhões de fragmentos são sequenciadas simultaneamente em paralelo por execução.
Para realizar um sequenciamento de próxima geração, devem ser realizadas as três etapas básicas de (1) preparação da biblioteca, (2) sequenciamento e (3) análise de dados. Durante a preparação da biblioteca, os fios de DNA devem ser fragmentados em fragmentos de DNA de certo comprimento. A sônica é uma das técnicas preferidas para fragmentar o DNA.
Durante o processo de sequenciamento de DNA, a ordem dos nucleotídeos no DNA – conhecida como sequência nucleica de ácido – é determinada. A sequência nucleico de ácido é composta de quatro bases de nucleotídeos – adenina, citosina, guanina, timina – qual código para informações.
O sequenciamento de próxima geração está impulsionando pesquisas em ciências da vida e medicina personalizada, uma vez que o sequenciamento de DNA e RNA são fortemente usados em pesquisas genômicas, pesquisas sobre câncer, pesquisa de doenças raras e complexas, pesquisa microbiana, agrogenomia e muitos outros campos de pesquisa.

Sequenciamento da próxima geração vs Sanger Sequenciamento

Enquanto com o Sequenciamento de Próxima Geração (NGS) é possível sequenciar um número maciço de amostras genômicas, o Sequenciamento de Sanger (também conhecido como método de terminação em cadeia ou Sequenciamento de Primeira Geração) tem apenas a capacidade de sequenciar pequenos números amostrais. Sanger sequenciamento apenas sequencia um único fragmento de DNA de cada vez e pode ser realizado em um único dia. Devido à sua acccuracy, o sequenciamento Sanger também é considerado a tecnologia padrão-ouro, que é usada para verificar resultados obtidos pelo sequenciamento de próxima geração.
O sequenciamento de sanger atinge comprimentos de leitura de aproximadamente 800bp (tipicamente 500-600bp com DNA não enriquecido). Os comprimentos de leitura mais longos no sequenciamento de Sanger apresentam vantagens significativas em relação a outros métodos de sequenciamento, especialmente em termos de sequenciar regiões repetitivas do genoma. Um desafio de dados de sequência de leitura curta é particularmente um problema no sequenciamento de novos genomas (de novo) e no sequenciamento de segmentos de genomas altamente reorganizados, tipicamente aqueles vistos de genomas cancerígenos ou em regiões de cromossomos que apresentam variação estrutural. [cp. Morozova e Marra, 2008]


High performance ultrasonics! Hielscher's product range covers the full spectrum from the compact lab ultrasonicator over bench-top units to full-industrial ultrasonic systems.

Hielscher Ultrasonics fabrica homogeneizadores ultrassônicos de alto desempenho de Laboratório para tamanho industrial.