Cisalhamento ultrassônico de DNA

Durante o cisalhamento de DNA e RNA, moléculas longas de DNA são fragmentadas em pedaços menores, uma etapa crucial na preparação de amostras para a construção de bibliotecas de sequenciamento de próxima geração (NGS). O cisalhamento ultrassônico de DNA emprega forças de cavitação acústica para quebrar DNA ou RNA em fragmentos que variam de 100 bp a 5 kb. Este método permite um controle preciso sobre o tamanho do fragmento, facilitando a personalização para o comprimento de DNA desejado para obter os melhores resultados de sequenciamento.

Cisalhamento de DNA usando ultrassom

A Hielscher Ultrasonics oferece várias soluções baseadas em ultrassom para cisalhamento de DNA, RNA e cromatina. Escolha entre ultrassonicadores do tipo sonda (por exemplo, UP100H) para sonicação direta usando uma microponta ou use o VialTweeeter ou o cuphorn ultrassônico para preparação indireta de DNA de várias amostras simultaneamente. A Hielscher oferece o dispositivo ideal considerando suas necessidades: se você tem 1 ou até 10 amostras, volumes de microlitros a litros – Os sonicadores Hielscher atenderão às suas necessidades para preparar fragmentos de DNA, RNA e cromatina no comprimento certo. Reprodutibilidade, fácil operação e controle preciso permitem uma biblioteca confiável para sequenciamento de última geração.
Em contraste com a fragmentação enzimática do DNA, o cisalhamento ultrassônico aplica forças de cisalhamento mecânicas puras sem adicionar produtos químicos. Pela configuração precisa dos parâmetros do processo, o cisalhamento ultrassônico produz fragmentos de DNA de alto peso molecular (plasmídeo e DNA genômico).
Os ácidos nucléicos purificados podem ser amplificados antes ou depois de uma etapa de fragmentação.
Os parâmetros de sonicação (potência, ciclo de pulso? rajadas, tempo e temperatura) podem ser controlados com segurança por meio de configurações de software.

Protocolos para cisalhamento ultrassônico de DNA

Para ensaio de imunoprecipitação de cromatina

Resumidamente, as células foram plaqueadas em placas de 60 mm de diâmetro (400.000 por placa) e transfectadas com RhoA siRNA (conforme descrito); após 72 h, eles foram incubados com formaldeído (concentração final, 1%) por 10 min a 37°C para reticular proteínas ao DNA. A reação de reticulação foi extinta pela adição de um décimo do volume de 1,25 mol/L de glicina, dando uma concentração final de 125 mmol/L. As células foram lavadas duas vezes com PBS gelado, ressuspensas em tampão de ensaio de radioimunoprecipitação [150 mmol? L NaCl, 1% NP40, 0,5% desoxicolato, 0,1% SDS, 5 mmol? L EDTA, 50 mmol? L Tris-HCl (pH 8,0)] contendo 1 mmol? L de fluoreto de fenilmetilsulfonil, 1 Ag? mL de aprotinina e 1 Ag? mL de pepstatina A, e mantidas em gelo por 30 min. Em seguida, os lisados celulares foram sonicados em gelo com um Hielscher UP200S sonicador ultrassônico (3 x 40 s, amplitude de 40%, ciclo 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) até que as cromatinas reticuladas fossem cortadas para produzir fragmentos de DNA entre 200 e 1.000 pb. Um décimo do lisado total foi usado para quantificar a quantidade de DNA presente em diferentes amostras e considerado como “DNA de entrada total”. Os sobrenadantes foram incubados com pasta de DNA/proteína agarose-50% de esperma de salmão para reduzir o fundo inespecífico. A imunoprecipitação foi então feita durante a noite a 4°C com 5 Ag de anti-NF-nB p65 (Upstate) ou sem anticorpo (controle negativo). Esses sobrenadantes foram suplementados com 5 mol/L de NaCl e aquecidos durante a noite a 65°C para reverter as ligações cruzadas proteína-DNA. Os imunocomplexos foram posteriormente tratados com proteinase K livre de DNase e RNase, e o DNA foi purificado por extração de fenol/clorofórmio e precipitação de etanol. A PCR foi feita com primers específicos correspondentes a uma sequência dentro da região promotora do gene iNOS humano (primer p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; primer p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Estudos de expressão de EGFP

Para estudos de expressão, a cepa recombinante L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Alemanha) com o gene para EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), cromossômica ssu integrada, foi cultivada nos vários meios descritos anteriormente e adicionalmente suplementada com 100 mg l^-1 Nourseotricina (Jena Bioscience, Alemanha). Durante o cultivo, amostras de 1 ml foram coletadas, centrifugadas (2000 × g, 20°C, 10 min) e lavadas com solução de NaCl a 0,9%. O pellet foi ressuspenso em tampão (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) e desintegrado por sonificação com o processador ultrassônico UP400S (aplicação de energia ∼ 400 Ws). Os debris celulares foram removidos por centrifugação (6000 × g, 4°C, 5 min) e analisados por eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio – poliacrilamida (SDS-PAGE) sob condições redutoras de acordo com o método de Laemmli (1970) com géis de poliacralamida a 12,5%. A expressão de EGFP foi examinada em cultura agitada. (Fritsche et al. 2007)

imunoprecipitação da cromatina

O ensaio de imunoprecipitação da cromatina foi realizado usando o ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) according to the manufacturer’s instructions with some modifications. Briefly, differentiated human podocytes were cross-linked with 1% formaldehyde for 10 min at room temperature. Cells were washed with ice-cold PBS and the fixation reaction was stopped by adding 0.125 M glycine for 5 min at room temperature. Cells were washed again with ice-cold PBS and scraped from the dish. Cells were pelleted by centrifugation and resuspended in the lysis buffer. After centrifugation, pelleted nuclei were resuspended in the shearing buffer, incubated on ice for 30 min and the chromatin was sheared by sonication, e.g. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Alemanha) a 25% de potência 5 pulsos de 20 segundos cada no gelo em fragmentos de aproximadamente 200–600 pb. A cromatina cisalhada foi então centrifugada e o sobrenadante foi coletado. Para imunoprecipitações, 60 μl de cromatina foram incubados com 1 μg de anticorpos Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, Reino Unido) ou NF-κB p50 (Abcam) ou com IgG de coelho (Zymed Laboratories), como controle negativo, durante a noite a 4°C com rotação suave. Os imunocomplexos ligados a esferas magnéticas foram coletados usando um suporte magnético, lavados extensivamente, e as ligações cruzadas proteína/DNA foram revertidas e o DNA eluído para análise de PCR em tempo real. (Ristola et al. 2009)

Preparação de DNA EHEC para análise de matriz de chips

Arranjo de lisados celulares e DNAs extraídos
Pellets bacterianos suspensos em PBS até a concentração final desejada foram tratados com disruptor ultrassônico UP100H (Hielscher GmbH, Alemanha) equipado com uma microponta MS1 (1mm de diâmetro). A frequência de operação era de 30 kHz e a potência de saída efetiva era de 100 W. Durante a operação, as amostras foram resfriadas em banho de água gelada, misturadas e centrifugadas. As amostras foram utilizadas para estudos de citometria de fluxo, enquanto para posterior manuseio, as amostras foram submetidas a um tratamento térmico (95°C, 5 min). Os lisados celulares brutos foram processados com uma mistura de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1). Um volume igual dessa mistura foi adicionado à amostra de lisado, a solução foi agitada vigorosamente por 15 s e centrifugada a 15.000 x g por 2 min em temperatura ambiente (RT) em torno de 22 ° C. A fase aquosa superior contendo o DNA genômico foi cuidadosamente separada e coletada em um novo tubo Eppendorf estéril.
Posteriormente, as amostras foram sonicadas para fragmentar o DNA. A etapa de sonicação foi realizada nas mesmas condições descritas acima. Para avaliar os efeitos da fragmentação no DNA genômico, as amostras foram analisadas por meio de eletroforese em gel de agarose.
(…) As amostras sonicadas previamente por 2,5 min foram submetidas a uma etapa de extração após tratamento térmico e centrifugação. O DNA liberado foi extraído duas vezes com uma mistura de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico e, em seguida, submetido a uma segunda sonicação por 0 a 15 min. A eletroforese em gel de agarose foi usada para determinar a distribuição de tamanho do DNA submetido à fragmentação ultrassônica pós-extração (Fig. no lado superior direito). O DNA altamente fragmentado foi evidente a partir da presença de um esfregaço de DNA em vez de bandas de alto peso molecular que foram eliminadas das amostras sonicadas por 2,5 minutos ou mais. A sonicação mais longa reduziu gradualmente os comprimentos dos fragmentos para aproximadamente 150 a 600 pb, e a sonicação por 15 min degradou ainda mais esses fragmentos, como pode ser visto principalmente pela parte superior do esfregaço. Assim, o tamanho médio dos fragmentos de DNA diminuiu gradualmente com o tempo de ultrassom e o tratamento de 5 min permitiu obter os tamanhos dos fragmentos de DNA mais adequados para ensaios de chip array. Por fim, foi estabelecido o procedimento de preparação do analito de DNA, compreendendo os primeiros 2 minutos de tratamento ultrassônico, extração de DNA (2×) e 5 minutos subsequentes de sonicação. (Basselet et al. 2008)

Imunoprecipitação de cromatina (ChIP)

As células HEK293 foram cultivadas conforme descrito acima e fixadas com 2 mM de disuccinimidil-glutarato por 45 min à temperatura ambiente. Posteriormente, as células foram lavadas duas vezes com PBS. A cromatina foi reticulada por 10 min em temperatura ambiente usando formaldeído a 1% (v? v) e lavada duas vezes com PBS gelado. A reação de reticulação foi interrompida por incubação com glicina na concentração final de 0,125 M por 5 min à temperatura ambiente. Após a incubação com tripsina, as células foram raspadas da placa de cultura de células e lavadas duas vezes com PBS. O pellet celular foi ressuspenso em tampão de lise (tubos de 5 mM, pH 8,0, KCl de 85 mM e Nonidet P-40 de 0,5% (v/v), incubado em gelo por 10 min e homogeneizado com homogeneizador Dounce. Posteriormente, os núcleos foram peletizados por centrifugação (3500 x g, 5 min, 4 °C) e ressuspensos em tampão de núcleos (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA e 1% (p/v) SDS). Os núcleos foram interrompidos por sonicação com três pulsos de 20 s em um Sônico UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) em uma configuração de ciclo 0,5 e amplitude de 30%, produzindo fragmentos de DNA genômico com um tamanho de massa de 200 – 1000 bp. Para ChIP, 50g de DNA foram diluídos 4 vezes em tampão de imunoprecipitação (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v? v) Triton X-100 e 0,01% (p? v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Análise de modificação de histonas por imunoprecipitação de cromatina (ChIP)

Resumidamente, 6 x 10⁶ As células foram lavadas duas vezes com PBS e reticuladas na placa de cultura por 15 min em temperatura ambiente na presença de formaldeído a 0,5%. A reação de reticulação foi interrompida pela adição de 0,125 M de glicina. Todas as etapas subsequentes foram realizadas a 48°C. Todos os tampões foram pré-resfriados e continham inibidores de protease (Complete Mini, Roche). As células foram lavadas duas vezes com PBS e depois raspadas. Os pellets coletados foram dissolvidos em tampão de lise de 1 ml (SDS 1%, EDTA 5 mM, Tris pH 8 50 mM) e sonicados em banho de etanol frio por 10 ciclos a 100% de amplitude usando um Sônico UP50H (Hielscher, Teltow, Alemanha). A fragmentação da cromatina foi visualizada em gel de agarose a 1%. Os fragmentos obtidos estavam na faixa de 200 a 500 pb. A cromatina solúvel foi obtida centrifugando as amostras sonicadas a 14.000g por 10 min a 48°C. A fração solúvel foi diluída 1/10 em tampão de diluição (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) e depois aliquotada e armazenada a 80°C até o uso. (Rodriguez et al. 2008)