Cisalhamento ultrassónico do ADN

Durante o corte de ADN e ARN, as moléculas longas de ADN são fragmentadas em pedaços mais pequenos, um passo crucial na preparação de amostras para a construção de bibliotecas de sequenciação de nova geração (NGS). O corte ultrassónico do ADN emprega forças de cavitação acústica para quebrar o ADN ou o ARN em fragmentos que variam entre 100 pb e 5 kb. Este método permite um controlo preciso do tamanho do fragmento, facilitando a personalização do comprimento de ADN desejado para obter resultados de sequenciação óptimos.

Corte de ADN por ultra-sons

Hielscher Ultrasonics oferece várias soluções baseadas em ultrassom para DNA, RNA e cromatina de cisalhamento. Escolha entre um tipo de sonda ultrasonicators (por exemplo, UP100H) para sonicação direta usando uma microponta, ou usar o VialTweeeter ou o cuphorn ultra-sônico para a preparação indireta de DNA de várias amostras simultaneamente. Hielscher oferece o dispositivo ideal considerando suas necessidades: se você tem 1 ou até 10 amostras, volumes de microlitro para volumes de litro – Os sonicadores Hielscher satisfazem os seus requisitos para preparar fragmentos de ADN, ARN e cromatina com o comprimento certo. A reprodutibilidade, a facilidade de utilização e o controlo preciso permitem obter uma biblioteca fiável para a sequenciação de nova geração.
Em contraste com a fragmentação enzimática do ADN, o cisalhamento ultrassónico aplica forças de cisalhamento mecânicas puras sem adição de quaisquer produtos químicos. Através do ajuste preciso dos parâmetros do processo, o cisalhamento ultrassónico produz fragmentos de ADN de elevado peso molecular (ADN plasmídico e genómico).
Os ácidos nucleicos purificados podem ser amplificados antes ou depois de um passo de fragmentação.
Os parâmetros de sonicação (potência, ciclo de impulsos / rajadas, tempo e temperatura) podem ser controlados com segurança através de definições de software.

Protocolos para o corte ultrassónico do ADN

Para Ensaio de Imunoprecipitação da Cromatina

Resumidamente, as células foram colocadas em placas de 60 mm de diâmetro (400.000 por placa) e transfectadas com siRNA RhoA (como descrito); após 72 h, foram incubadas com formaldeído (concentração final, 1%) durante 10 min a 37°C para reticular as proteínas ao ADN. A reação de ligação cruzada foi extinta pela adição de um décimo de volume de 1,25 mol/L de glicina, obtendo-se uma concentração final de 125 mmol/L. As células foram lavadas duas vezes com PBS gelado, ressuspendidas em tampão de ensaio de radioimunoprecipitação [150 mmol/l NaCl, 1% NP40, 0,5% desoxicolato, 0,1% SDS, 5 mmol/l EDTA, 50 mmol/l Tris-HCl (pH 8,0)] contendo 1 mmol/l fluoreto de fenilmetilsulfonilo, 1 Ag/mL aprotinina e 1 Ag/mL pepstatina A, e mantidas em gelo durante 30 minutos. Em seguida, os lisados celulares foram submetidos a ultra-sons no gelo com um Hielscher UP200S ultra-sons (3 x 40 s, amplitude 40%, ciclo 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) até que as cromatinas reticuladas fossem cortadas para produzir fragmentos de ADN entre 200 e 1 000 pb. Utilizou-se um décimo do lisado completo para quantificar a quantidade de ADN presente nas diferentes amostras e considerou-se como “ADN total de entrada”. Os sobrenadantes foram incubados com uma pasta de agarose-50% de ADN/proteína de esperma de salmão para reduzir o fundo inespecífico. A imunoprecipitação foi então efectuada durante a noite a 4°C com 5 Ag de anti-NF-nB p65 (Upstate) ou sem anticorpo (controlo negativo). Estes sobrenadantes foram suplementados com NaCl 5 mol/L e aquecidos durante a noite a 65°C para reverter as ligações cruzadas proteína-DNA. Os imunocomplexos foram posteriormente tratados com proteinase K isenta de DNase e RNase, e o ADN foi purificado por extração com fenol/clorofórmio e precipitação com etanol. A PCR foi efectuada com iniciadores específicos correspondentes a uma sequência na região promotora do gene iNOS humano (iniciador p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; iniciador p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Estudos de expressão de EGFP

Para os estudos de expressão, a estirpe recombinante de L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Alemanha) com o gene para EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), ssu cromossómico integrado, foi cultivada nos vários meios como descrito anteriormente e suplementada adicionalmente com 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Alemanha). Durante o cultivo, foram colhidas amostras de 1 ml, centrifugadas (2000 × g, 20°C, 10 min) e lavadas com solução de NaCl a 0,9%. O pellet foi ressuspenso em tampão (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) e desintegrado por sonificação com o processador ultrassónico UP400S (aplicação de energia ∼ 400 Ws). Os detritos celulares foram removidos por centrifugação (6000 × g, 4 ° C, 5 min) e analisados por eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio - poliacrilamida (SDS-PAGE) sob condições redutoras de acordo com o método de Laemmli (1970) com géis de poliacrilamida a 12,5%. A expressão de EGFP foi examinada em cultura agitada. (Fritsche et al. 2007)

imunoprecipitação da cromatina

O ensaio de imunoprecipitação da cromatina foi efectuado utilizando o ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante, com algumas modificações. Resumidamente, os podócitos humanos diferenciados foram reticulados com formaldeído a 1% durante 10 minutos à temperatura ambiente. As células foram lavadas com PBS gelado e a reação de fixação foi interrompida pela adição de 0,125 M de glicina durante 5 minutos à temperatura ambiente. As células foram lavadas novamente com PBS gelado e raspadas da placa. As células foram peladas por centrifugação e ressuspendidas no tampão de lise. Após a centrifugação, os núcleos pelletizados foram ressuspendidos no tampão de cisalhamento, incubados em gelo durante 30 minutos e a cromatina foi cisalhada por sonicação, por exemplo UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Alemanha) a 25% de potência, 5 impulsos de 20 segundos cada, em gelo, em fragmentos de aproximadamente 200-600 pb. A cromatina cortada foi então centrifugada e o sobrenadante foi recolhido. Para as imunoprecipitações, 60 μl de cromatina foram incubados com 1 μg de anticorpos Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, Reino Unido) ou NF-κB p50 (Abcam) ou com IgG de coelho (Zymed Laboratories), como controlo negativo, durante a noite a 4°C com rotação suave. Os imunocomplexos ligados às esferas magnéticas foram recolhidos utilizando um suporte magnético, lavados extensivamente e as ligações cruzadas proteína/ADN foram invertidas e o ADN eluído para análise de PCR em tempo real. (Ristola et al. 2009)

Preparação do ADN de EHEC para análise por matriz de chips

Disposição dos lisados celulares e dos ADNs extraídos
Os pellets bacterianos suspensos em PBS até à concentração final desejada foram tratados com desregulador por ultra-sons UP100H (Hielscher GmbH, Alemanha) equipado com uma microponta MS1 (1 mm de diâmetro). A frequência de funcionamento foi de 30 kHz e a potência de saída efectiva foi de 100 W. Durante o funcionamento, as amostras foram arrefecidas num banho de água gelada, misturadas e centrifugadas. As amostras foram utilizadas para estudos de citometria de fluxo, enquanto que, para o manuseamento posterior, as amostras foram submetidas a um tratamento térmico (95°C, 5 min). Os lisados celulares brutos foram processados com uma mistura de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1). Foi adicionado um volume igual desta mistura à amostra de lisado, a solução foi agitada vigorosamente durante 15 s e centrifugada a 15.000 x g durante 2 min à temperatura ambiente (RT) por volta dos 22°C. A fase aquosa superior que contém o ADN genómico foi cuidadosamente separada e recolhida num novo tubo Eppendorf estéril.
Subsequentemente, as amostras foram submetidas a ultra-sons para fragmentar o ADN. O passo de sonicação foi realizado nas mesmas condições que as descritas acima. Para avaliar os efeitos da fragmentação no ADN genómico, as amostras foram analisadas por eletroforese em gel de agarose.
(…) As amostras sonicadas previamente durante 2,5 min foram submetidas a uma fase de extração após tratamento térmico e centrifugação. O ADN libertado foi extraído duas vezes com uma mistura de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico, sendo depois sujeito a uma segunda sonicação durante 0 - 15 min. A eletroforese em gel de agarose foi utilizada para determinar a distribuição do tamanho do ADN sujeito a fragmentação ultra-sónica pós-extração (Fig. no canto superior direito). O ADN altamente fragmentado era evidente pela presença de um esfregaço de ADN em vez de bandas de elevado peso molecular que eram eliminadas de amostras sonicadas durante 2,5 minutos ou mais. Uma sonicação mais longa reduziu gradualmente os comprimentos dos fragmentos para aproximadamente 150 - 600 pb, e a sonicação durante 15 minutos degradou ainda mais estes fragmentos, como pode ser visto principalmente na parte superior do esfregaço. Assim, o tamanho médio dos fragmentos de ADN diminuiu gradualmente com o tempo de ultra-sons e o tratamento de 5 minutos permitiu obter os tamanhos dos fragmentos de ADN mais adequados para os ensaios de matriz de chips. Por fim, foi estabelecido o procedimento de preparação do analito de ADN que compreende os primeiros 2 minutos de tratamento ultrassónico, extração de ADN (2×) e subsequente sonicação de 5 minutos. (Basselet et al. 2008)

Imunoprecipitação da cromatina (ChIP)

As células HEK293 foram cultivadas como descrito acima e fixadas com 2 mM de disuccinimidil-glutarato durante 45 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com PBS. A cromatina foi reticulada durante 10 minutos à temperatura ambiente com formaldeído a 1% (v/v) e lavada duas vezes com PBS gelado. A reação de ligação cruzada foi interrompida por incubação com glicina a uma concentração final de 0,125 M durante 5 minutos à temperatura ambiente. Após incubação com tripsina, as células foram raspadas da placa de cultura de células e lavadas duas vezes com PBS. O pellet de células foi ressuspenso em tampão de lise (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl e 0,5% (v/v) Nonidet P-40), incubado em gelo durante 10 min e homogeneizado com um homogeneizador Dounce. Subsequentemente, os núcleos foram pelletizados por centrifugação (3500 x g, 5 min, 4 °C) e ressuspensos em tampão de núcleos (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA e 1% (p/v) SDS). Os núcleos foram rompidos por sonicação com três impulsos de 20 s num Sonicador UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) com um ciclo de 0,5 e uma amplitude de 30%, obtendo-se fragmentos de ADN genómico com um tamanho total de 200 - 1000 pb. Para ChIP, 50 g de ADN foram diluídos 4 vezes em tampão de imunoprecipitação (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 e 0,01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Análise das modificações das histonas por imunoprecipitação da cromatina (ChIP)

Resumidamente, 6 x 10⁶ as células foram lavadas duas vezes com PBS e reticuladas na placa de cultura durante 15 minutos à temperatura ambiente na presença de formaldeído a 0,5%. A reação de reticulação foi interrompida pela adição de 0,125 M de glicina. Todas as etapas subsequentes foram efectuadas a 48°C. Todos os tampões foram previamente arrefecidos e continham inibidores de proteases (Complete Mini, Roche). As células foram lavadas duas vezes com PBS e depois raspadas. Os pellets recolhidos foram dissolvidos em 1 ml de tampão de lise (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) e foram submetidos a ultra-sons num banho de etanol frio durante 10 ciclos a 100% de amplitude, utilizando um Sonicador UP50H (Hielscher, Teltow, Alemanha). A fragmentação da cromatina foi visualizada num gel de agarose a 1%. Os fragmentos obtidos situavam-se na gama de 200-500pb. A cromatina solúvel foi obtida por centrifugação das amostras sonicadas a 14 000 g durante 10 minutos a 48 °C. A fração solúvel foi diluída 1/10 em tampão de diluição (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), depois aliquotada e armazenada a 80°C até à sua utilização. (Rodriguez et al. 2008)