Hielscher tecnologia de ultra-som

Ultra-sons ADN Shearing

  • Durante ADN e ARN de cisalhamento, as moléculas de ADN são divididos em pequenos pedaços. ADN / ARN fragmentação é uma das etapas importantes amostra de preparação necessários para criar bibliotecas de sequenciação próxima geração (NGS).
  • ADN corte ultra-som utiliza as forças de cavitação acústico para quebrar o ADN ou ARN em pedaços de 100 – pb 5kb.
  • corte ultra-sónica permite a fragmentação do ADN preciso e adaptação para o comprimento de ADN desejado.

Ultra-sons ADN Shearing

Hielscher Ultrasonics oferece várias soluções à base de ultra-som para ADN, ARN e cisalhamento da cromatina. Escolher entre um tipo de sonda ultrasonicators (por exemplo UP100H) para sonicação directo usando uma micro-pipeta, ou utilizar o VialTweeeter ou o cuphorn de ultra-sons para a preparação de ADN indirecto de vias amostras simultaneamente. Hielscher oferece o dispositivo ideal considerando suas necessidades: o tempo que você tem 1 ou até 10 amostras, volumes de microlitro para volumes litros – processadores ultra-sônicos Hielscher estão disponíveis para atender às suas necessidades para preparar DNA, RNA e fragmentos de cromatina no comprimento certo. Reprodutibilidade, facilidade de operação e controle preciso permitir uma biblioteca confiável para sequenciamento de próxima geração.
Em contraste com a fragmentação de ADN enzimático, corte ultra-sónico aplica forças de cisalhamento mecânicas puros sem a adição de quaisquer produtos químicos. Pelo ajuste preciso dos parâmetros do processo, de corte ultra-sónico produz grandes fragmentos de DNA de peso molecular (de plasmídeo e de ADN genómico).
ácidos nucleicos purificados pode ser amplificado antes ou depois de um passo de fragmentação.
parâmetros de sonicação (potência, ciclo de pulso / rajadas, tempo e temperatura) pode ser controlado de forma segura através de definições do software.

vantagens:

  • controle preciso
  • ciclos de sonicação e tempo precisamente adaptáveis ​​ao tamanho do DNA desejado
  • Os fragmentos de ADN de peso molecular elevado
  • controle de temperatura
  • Rápido
  • resultados reprodutíveis
  • autoclavável
  • várias soluções: Sonda de tipo, VialTweeter e Cuphorn

Protocolos para Ultrasonic DNA Shearing

Para imunoprecipitação da cromatina Assay

Resumidamente, as células foram plaqueadas em pratos de 60 mm de diâmetro (400 000 por prato) e transfectadas com ARNi RhoA (conforme descrito); Após 72 h, foram incubadas com formaldeído (concentração final, 1%) durante 10 min a 37 ° C para reticular as proteínas ao DNA. A reacção de reticulação foi extinta pela adição de um décimo volume de 1,25 mol / L de glicina, dando 125 mmol / L de concentração final. As células foram lavadas duas vezes com PBS gelado, ressuspensas em tampão de ensaio de radioimunoprecipitação [150 mmol / L de NaCl, 1% de NP40, 0,5% de desoxicolato, 0,1% de SDS, 5 mmol / L de EDTA, 50 mmol / L de Tris-HCl (pH 8,0 )] contendo 1 mmol / L de fluoreto de fenilmetilsulfonilo, 1 Ag / mL de aprotinina e 1 Ag / mL de pepstatina A, e manteve-se em gelo durante 30 min. Então, os lisados ​​celulares foram sonicados no gelo com um Hielscher UP200S ecografia ultra-sons (3 x 40 s, 40% de amplitude, ciclo 1; Ultrasonics Hielscher GmbH) até cromatinas reticuladas foram cortados para se obter fragmentos de ADN entre 200 e 1000 pb. Um décimo de lisado total foi usado para quantificar a quantidade de ADN presente em amostras diferentes e considerada “DNA total de entrada”. Os sobrenadantes foram incubados com ADN de esperma de salm / protea de agarose-50% de pasta para reduzir o fundo inespecífico. A imunoprecipitação foi, em seguida, feito durante a noite a 4 ° C com 5 Ag de p65 anti-NF-NB (Upstate) ou sem anticorpo (controlo negativo). Estes sobrenadantes foram suplementadas com 5 mol / L de NaCl e aquecida durante a noite a 65 ° C para reverter proteína-ADN ligações cruzadas. Os imunocomplexos foram ainda tratados com DNase e RNase proteinase livre de K, e o ADN foi purificado por extracção com fenol / clorofórmio e precipitação com etanol. O PCR foi realizado com os iniciadores específicos correspondentes a uma sequência dentro da região do promotor do gene de iNOS humana (p1 de iniciador: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; iniciadores P2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

estudos de expressão EGFP-

Para estudos de expressão, o p10 recombinante estirpe L. tarentolae :: F9Begfp1.4dBsat # 12 (Jena Bioscience, Alemanha) com o gene de EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), cromossómico integrado SSU, foi cultivada em vários meios de comunicação, tal como descrito anteriormente e adicionalmente, suplementada com 100 mg de l-1 de Nourseothricin (Jena Bioscience, Alemanha). Durante a cultura, 1 ml foram recolhidas amostras, centrifugadas (2000 x g, 20 ° C, 10 min) e lavadas com solução de NaCl a 0,9%. Sedimento foi ressuspenso em tampão (HEPES 20 mM, EDTA 5 mM, DTT 2 mM) e desintegravam-se por sonificação com o processador ultra-sónico UP400S (Aplicação de energia Ws ~ 400). Os detritos celulares foram removidos por centrifugação (6000 x g, 4 ° C, 5 min) e analisados ​​por sulfato de dodecilo e sódio - electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) sob condições redutoras de acordo com o método de Laemmli (1970) com geles polyacralamide 12,5% . EGFP-expressão foi examinada em cultura agitado. (Fritsche et al., 2007)

Hielscher's UP100H was used to prepare EHEC DNA for chip array analysis

Electroforética análises de ADN genómico de E. coli EDL933 submetido a 0 - 15 minutos de ultra-sons. L indica a escada de ADN. (Basselet et al. 2008)

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imunoprecipitação da cromatina

Ultra-sons UP100H disruptor celular (100W) para a lise, ruptura celular e cisalhamento do ADN.O ensaio de imunoprecipitao da cromatina foi realizada utilizando o chip-ITTm Express (Motif Ativo, Carlsbad, CA, EUA), de acordo com as instruções do fabricante, com algumas modificações. Resumidamente, podócitos humanos diferenciados eram de ligação cruzada com 1% de formaldeído, durante 10 min à temperatura ambiente. As células foram lavadas com PBS gelado e a reacção de fixação foi terminada por adição de 0,125 M de glicina durante 5 min à temperatura ambiente. As células foram novamente lavadas com PBS arrefecido em gelo e raspado a partir do prato. As células foram sedimentadas por centrifugação e ressuspensas no tampão de lise. Após centrifugação, os núcleos sedimentados foram ressuspensos no tampão de cisalhamento, incubadas em gelo durante 30 min e a cromatina foi cisalhado por sonicação, por exemplo UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Alemanha) com 25% de potência 5 pulsos de 20 segundos cada vez em gelo em fragmentos de aproximadamente 200-600 pb. A cromatina cortada foi então centrifugada e o sobrenadante foi recolhido. Para imunoprecipitações, 60 μl de cromatina foram incubados com 1 μg de anticorpos Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), NF-kB p65 (Abcam, Cambridge, Reino Unido) ou NF-κ B p50 (Abcam) ou com coelho IgG (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, EUA), como controle negativo, durante a noite a 4 ° C com rotação suave. Os imunocomplexos ligados a pérolas magnéticas foram coletados usando um suporte magnético, lavados extensivamente, e as reticências de proteína / DNA foram revertidas e o eluído de DNA para análise de PCR em tempo real. (Ristola et al., 2009)

A preparação de ADN para análise de EHEC chip array

Arranjo de lisados ​​celulares e ADNs extraídos
Os sedimentos bacterianos suspensos em PBS para a concentração final desejada foram tratados com ultra-som UP100H disruptor (Hielscher GmbH, Alemanha) equipado com uma micropartícula MS1 (1 mm de diâmetro). A freqüência de operação foi de 30 kHz e a potência de saída efetiva foi de 100 W. Durante a operação, as amostras foram arrefecidas em um banho de gelo-água, misturadas e centrifugadas. As amostras foram utilizadas para estudos de citometria de fluxo, enquanto que para manipulação posterior, as amostras foram submetidas a um tratamento térmico (95 ° C, 5 min). Os lisados ​​de células brutas foram processados ​​com uma mistura de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25: 24: 1). Um volume igual desta mistura foi adicionado à amostra de lisado, a solução foi submetida a vórtice vigorosamente durante 15 s e centrifugada a 15 000 xg durante 2 min à temperatura ambiente (RT) em torno de 22 ° C. A fase aquosa superior contendo o ADN genómico foi cuidadosamente separada e recolhida num novo tubo Eppendorf estéril.
Posteriormente, amostras foram sonicadas para fragmentar o DNA. O passo de sonicação foi realizado nas mesmas condições descritas acima. Para avaliar os efeitos de fragmentação no DNA genômico, as amostras foram analisadas por meio de eletroforese em gel de agarose.
(…) As amostras sonicadas anteriormente durante 2,5 min foram submetidas a um passo de extração após tratamento térmico e centrifugação. O DNA liberado foi extraído duas vezes com uma mistura de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico e depois submetido a segunda sonicação durante 0-15 min. A eletroforese em gel de agarose foi utilizada para determinar a distribuição de tamanho do DNA submetido à fragmentação ultra-sônica pós-extração (Fig. No lado superior direito). O DNA altamente fragmentado foi evidente a partir da presença de um esfregaço de DNA em vez de bandas de alto peso molecular que foram eliminadas de amostras sonicadas durante 2,5 min ou mais. A ultrassonografia mais longa reduziu gradualmente os comprimentos de fragmentos para aproximadamente 150 a 600 pb, e a sonicação durante 15 minutos degradou ainda mais esses fragmentos, como pode ser observado principalmente pela parte superior do esfregaço. Assim, o tamanho médio do fragmento de DNA diminuiu gradualmente com o tempo de ultra-sonografia e o tratamento de 5 min permitiu obter os tamanhos de fragmentos de DNA mais adequados para ensaios de matriz de chips. Por fim, estabeleceu-se o procedimento de preparação do analito de DNA que compreende os primeiros 2 minutos de tratamento ultra-sônico, extração de DNA (2 ×) e subseqüente ultrassom de 5 min. (Basselet et al., 2008)

A imunoprecipitao da cromatina (ChIP)

Processador ultra-sônico UP100H para o ADN, o RNA e o shearing da cromatina. (Clique para ampliar!)As células HEK293 foram cultivadas como descrito acima e fixadas com 2 mM de dissuccinimidil-glutarato durante 45 minutos à temperatura ambiente. Posteriormente, as células foram lavadas duas vezes com PBS. A cromatina foi reticulada durante 10 minutos à temperatura ambiente utilizando formaldeído a 1% (v / v) e lavada duas vezes com PBS gelada. A reacção de reticulação foi interrompida por incubação com glicina numa concentração final de 0,125 M durante 5 min à temperatura ambiente. Após a incubação com tripsina, as células foram raspadas do prato de cultura de células e lavadas duas vezes com PBS. O sedimento celular foi ressuspenso em tampão de lise (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl e 0,5% (v / v) Nonidet P-40), incubadas em gelo durante 10 min e homogeneizadas com um homogeneizador Dounce. Subsequentemente, os núcleos foram sedimentados por centrifugação (3500 xg, 5 min, 4 ° C) e ressuspensos em tampão de núcleos (Tris-HCl 50 mM, pH 8.1, EDTA 10 mM e SDS a 1% (p / v). Os núcleos foram interrompidos por sonicação com três pulsos de 20 segundos em um UP50H sonicador (Hielscher Ultraschall Technologie) com um ajuste de ciclo de 0,5 e uma amplitude de 30%, dando origem a fragmentos de DNA genómico com um tamanho a granel de 200-1000 pb. Para o chip, 50g de DNA foi diluída quatro vezes em tamp de imunoprecipitao (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, NaCl 167 mM, EDTA 1,2 mM, 1,1% (v / v) de Triton X-100, e 0,01% (w / v) de SDS). (Weiske et al., 2006)

análise modificação da histona por imunoprecipitao da cromatina (ChIP)

Resumidamente, 6 x 106 as células foram lavadas duas vezes com PBS e reticuladas na placa de cultura durante 15 minutos à temperatura ambiente na presença de 0,5% de formaldeído. A reacção de reticulação foi interrompida pela adição de glicina a 0,125 M. Todas as etapas subsequentes foram realizadas a 48 ° C. Todos os buffers foram pré-refrigerados e continham inibidores de protease (Complete Mini, Roche). As células foram lavadas duas vezes com PBS e depois raspadas. Os grânulos recolhidos foram dissolvidos em tampão de lise de 1 ml (SDS a 1%, EDTA 5 mM, Tris a 50 mM pH 8) e foram sonicados num banho de etanol frio durante 10 ciclos a 100% de amplitude usando um UP50H sonicador (Hielscher, Teltow, Alemanha). fragmentação da cromatina foi visualizada em gel de agarose a 1%. Os fragmentos obtidos foram na gama 200-500pb. cromatina solúvel foi obtida por centrifugação das amostras sonicadas em 14.000 g durante 10 min a 48 ° C. A fracção solúvel foi diluída 1/10 em tampão de diluição (1% de Triton X-100, EDTA 2 mM, Tris 20 mM pH 8, NaCl 150 mM), em seguida, dividido em alíquotas e armazenado a 80 ° C até à sua utilização. (Rodriguez et al. 2008)

Dispositivo Potência [W] Tipo Volume [ml]
VialTweeter 200 estar sozinho 0.5 1,5
UP50H 50 handheld ou standmounted 00,01 250
UP100H 100 handheld ou standmounted 00,01 500
UP200Ht 200 handheld ou standmounted 0.1 1000
UP200St 200 Handheld 0.1 1000
UP400St 400 Handheld 5 2000
Cuphorn 200 CupHorn, sonoreactor 10 200
GDmini2 200 célula de fluxo livre de contaminação

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Hielscher's VialTweeter is is´deal for the simultaneous preparation of multiple samples

VialTweeter para preparação de amostras de ultra-sons

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Literatura / Referências

  • Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): O processamento da amostra para análise baseada na matriz de chip de ADN de Escherichia coli entero-hemorrágica (EHEC). As fábricas celulares microbianas 7:29. De 2008.
  • . Doublier S., Riganti Ch, Voena C., C. Costamagna, Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D, Bosia A. (008): O silenciamento RhoA reverte a resistência à doxorrubicina em células de cancro do cólon humano. Molecular Cancer Research 6 (10), 2008.
  • Fredlund E., Gidlund A., Olsen, M., T. Börjesson, Spliid NHH, Simonsson M. (2008): avaliação Método de extracção de ADN a partir de micélios de Fusarium e de trigo por baixo-corrente em tempo real quantificação de PCR e correlação de níveis de micotoxinas . Journal of microbiológicos Métodos 2008.
  • Fritsche C., M. de assento, Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): A caracterização do comportamento de crescimento de Leishmania tarentolae - um novo sistema de expressão de proteínas recombinantes. Journal of Básico Microbiologia 47, 2007. 384-393.
  • Ristola M., Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Welsh G. I., Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Regulamento de Neph3 gene em podocytes - papéis fundamentais de fatores de transcrição NF-kB e SP1. BMC Biologia Molecular 10:83 de 2009.
  • Rodriguez J., Vives L., Jorda M., C. Morales, M. Munoz, E. Vendrell, Peinado M. A. (2008):-ampla do genoma de seguimento de ADN não metilado repetições de Alu em células normais e cancerosas. Nucleic Acids Research Vol. 36, No. 3, 2008. 770-784.
  • Weiske J. Huber O. (2006): A histidina Triad Protein Hint1 desencadeia a apoptose independente de sua atividade enzimática. The Journal of Biological Chemistry. Vol. 281, N ° 37, 2006. 27356-27366.


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