Cisalhamento ultrassónico do ADN

Durante o cisalhamento do ADN e do ARN, as moléculas longas de ADN são fragmentadas em pedaços mais pequenos, uma etapa crucial na preparação de amostras para a construção de bibliotecas para sequenciação de nova geração (NGS). O cisalhamento ultrassónico do ADN utiliza forças de cavitação acústica para fragmentar o ADN ou o ARN em fragmentos que variam de 100 bp a 5 kb. Este método permite um controlo preciso do tamanho dos fragmentos, facilitando o ajuste ao comprimento de ADN desejado para obter resultados de sequenciação ótimos.

Cisalhamento do ADN por ultrassonicação

A Hielscher Ultrasonics oferece várias soluções baseadas em ultrassons para o cisalhamento do ADN, do ARN e da cromatina. Escolha um sonicador do tipo sonda (por exemplo, UP100H) para sonicação direta com uma microponta, ou utilize o VialTweeeter ou o cuphorn ultrassónico para a preparação indireta de ADN de várias amostras em simultâneo. A Hielscher oferece o dispositivo ideal tendo em conta as suas necessidades: quer tenha 1 ou até 10 amostras, com volumes desde microlitros até litros – os sonicadores Hielscher satisfazem os seus requisitos para preparar fragmentos de ADN, ARN e cromatina com o comprimento adequado. A reprodutibilidade, a facilidade de utilização e o controlo preciso permitem obter uma biblioteca fiável para sequenciação de nova geração.
Ao contrário da fragmentação enzimática do ADN, o cisalhamento ultrassónico aplica forças de cisalhamento puramente mecânicas, sem adicionar quaisquer produtos químicos. Mediante o ajuste preciso dos parâmetros do processo, o cisalhamento ultrassónico produz fragmentos de ADN de elevado peso molecular (ADN plasmídico e genómico).
Os ácidos nucleicos purificados podem ser amplificados antes ou depois de uma etapa de fragmentação.
Os parâmetros de sonicação (potência, ciclo de impulsos / rajadas, tempo e temperatura) podem ser controlados de forma segura através das definições do software.

Protocolos para o cisalhamento ultrassónico do ADN

Para o ensaio de imunoprecipitação da cromatina

Resumidamente, as células foram semeadas em placas com 60mm de diâmetro (400 000 por placa) e transfetadas com siRNA de RhoA (conforme descrito); após 72 h, foram incubadas com formaldeído (concentração final, 1%) durante 10 min a 37°C para estabelecer ligações cruzadas entre as proteínas e o ADN. A reação de formação de ligações cruzadas foi interrompida pela adição de um décimo do volume de glicina a 1,25 mol/L, obtendo-se uma concentração final de 125 mmol/L. As células foram lavadas duas vezes com PBS arrefecido em gelo, ressuspensas em tampão de ensaio de radioimunoprecipitação [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% desoxicolato, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)] contendo 1 mmol/L de fluoreto de fenilmetilsulfonilo, 1 Ag/mL de aprotinina e 1 Ag/mL de pepstatina A, e mantidas em gelo durante 30 min. Em seguida, os lisados celulares foram sonicados em gelo com um Hielscher UP200S , um sonicador de ultrassons (3 x 40 s, amplitude de 40%, ciclo 1; Hielscher Ultrasonics GmbH), até que as cromatinas com ligações cruzadas fossem cisalhadas para produzir fragmentos de ADN entre 200 e 1 000 bp. Um décimo do lisado total foi utilizado para quantificar a quantidade de ADN presente nas diferentes amostras e considerado como “ADN total de entrada”. Os sobrenadantes foram incubados com uma suspensão a 50% de ADN de esperma de salmão/proteína-agarose para reduzir o sinal de fundo inespecífico. A imunoprecipitação foi então realizada durante a noite a 4°C com 5 Ag de anti-NF-nB p65 (Upstate) ou sem anticorpo (controlo negativo). Estes sobrenadantes foram suplementados com NaCl a 5 mol/L e aquecidos durante a noite a 65°C para reverter as ligações cruzadas entre as proteínas e o ADN. Os imunocomplexos foram ainda tratados com proteinase K isenta de DNase e RNase, e o ADN foi purificado por extração com fenol/clorofórmio e precipitação com etanol. A PCR foi realizada com primers específicos correspondentes a uma sequência na região promotora do gene humano iNOS (primer p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; primer p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Estudos de expressão de EGFP

Para os estudos de expressão, a estirpe recombinante L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Alemanha), com o gene de EGFP (proteína fluorescente verde melhorada) integrado no ssu cromossómico, foi cultivada nos vários meios conforme descrito anteriormente, sendo estes adicionalmente suplementados com 100 mg l^-1 de nourseotricina (Jena Bioscience, Alemanha). Durante o cultivo, foram recolhidas amostras de 1 ml, centrifugadas (2000 × g, 20°C, 10 min) e lavadas com solução de NaCl a 0,9%. O sedimento foi ressuspenso em tampão (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) e desintegrado por sonicação com o processador ultrassónico UP400S (aplicação de energia ∼ 400 Ws). Os detritos celulares foram removidos por centrifugação (6000 × g, 4°C, 5 min) e analisados por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE), em condições redutoras, de acordo com o método de Laemmli (1970), com géis de poliacrilamida a 12,5%. A expressão de EGFP foi examinada em cultura sob agitação. (Fritsche et al. 2007)

Imunoprecipitação da cromatina

O ensaio de imunoprecipitação da cromatina foi realizado utilizando o ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, EUA), de acordo com as instruções do fabricante, com algumas modificações. Resumidamente, foram estabelecidas ligações cruzadas em podócitos humanos diferenciados com formaldeído a 1% durante 10 min à temperatura ambiente. As células foram lavadas com PBS arrefecido em gelo e a reação de fixação foi interrompida pela adição de glicina a 0,125 M durante 5 min à temperatura ambiente. As células foram novamente lavadas com PBS arrefecido em gelo e removidas da placa por raspagem. As células foram sedimentadas por centrifugação e ressuspensas no tampão de lise. Após centrifugação, os núcleos sedimentados foram ressuspensos no tampão de cisalhamento, incubados em gelo durante 30 min, e a cromatina foi cisalhada por sonicação, por exemplo, com o UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Alemanha), a 25% de potência, com 5 impulsos de 20 sec cada em gelo, em fragmentos de aproximadamente 200–600 bp. A cromatina cisalhada foi então centrifugada e o sobrenadante foi recolhido. Para as imunoprecipitações, 60 μl de cromatina foram incubados com 1 μg de anticorpos contra Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, Reino Unido) ou NF-κB p50 (Abcam), ou com IgG de coelho (Zymed Laboratories), como controlo negativo, durante a noite a 4°C, com rotação suave. Os imunocomplexos ligados a esferas magnéticas foram recolhidos utilizando um suporte magnético, lavados exaustivamente, e as ligações cruzadas proteína/ADN foram revertidas, sendo o ADN eluído para análise por PCR em tempo real. (Ristola et al. 2009)

Preparação de ADN de EHEC para análise por microarranjos em chip

Preparação de lisados celulares e de ADN extraído
Os sedimentos bacterianos suspensos em PBS à concentração final desejada foram tratados com o dispositivo de rutura por ultrassons UP100H (Hielscher GmbH, Alemanha), equipado com uma microponta MS1 (1mm de diâmetro). A frequência de funcionamento era de 30 kHz e a potência de saída efetiva era de 100 W. Durante o funcionamento, as amostras foram arrefecidas num banho de água com gelo, misturadas e centrifugadas. As amostras foram utilizadas para estudos de citometria de fluxo, enquanto, para manipulação posterior, foram submetidas a um tratamento térmico (95°C, 5 min). Os lisados celulares brutos foram processados com uma mistura de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1). Foi adicionado um volume igual desta mistura à amostra de lisado, a solução foi agitada vigorosamente em vórtex durante 15 s e centrifugada a 15 000 x g durante 2 min à temperatura ambiente (RT), cerca de 22°C. A fase aquosa superior contendo o ADN genómico foi cuidadosamente separada e recolhida num novo tubo Eppendorf estéril.
Posteriormente, as amostras foram sonicadas para fragmentar o ADN. A etapa de sonicação foi realizada nas mesmas condições descritas acima. Para avaliar os efeitos da fragmentação no ADN genómico, as amostras foram analisadas por eletroforese em gel de agarose.
(…) As amostras previamente sonicadas durante 2,5 min foram submetidas a uma etapa de extração após tratamento térmico e centrifugação. O ADN libertado foi extraído duas vezes com uma mistura de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico e, posteriormente, submetido a uma segunda sonicação durante 0 – 15 min. Foi utilizada eletroforese em gel de agarose para determinar a distribuição de tamanhos do ADN submetido a fragmentação ultrassónica após a extração (Fig. no canto superior direito). O ADN altamente fragmentado era evidente pela presença de um arrastamento de ADN, em vez de bandas de elevado peso molecular, que foram eliminadas das amostras sonicadas durante 2,5 min ou mais. Uma sonicação mais prolongada reduziu gradualmente o comprimento dos fragmentos para aproximadamente 150 – 600 bp, e a sonicação durante 15 min degradou ainda mais estes fragmentos, como se pode observar sobretudo na parte superior do arrastamento. Assim, o tamanho médio dos fragmentos de ADN diminuiu gradualmente com o tempo de ultrassonicação, e o tratamento de 5 min permitiu obter os tamanhos de fragmentos de ADN mais adequados para ensaios de microarranjos em chip. Por fim, foi estabelecido o procedimento de preparação do analito de ADN, compreendendo inicialmente 2 min de tratamento ultrassónico, extração de ADN (2×) e sonicação subsequente durante 5 min. (Basselet et al. 2008)

Imunoprecipitação da cromatina (ChIP)

As células HEK293 foram cultivadas conforme descrito acima e fixadas com glutarato de dissuccinimidilo a 2 mM durante 45 min à temperatura ambiente. Posteriormente, as células foram lavadas duas vezes com PBS. Foram estabelecidas ligações cruzadas na cromatina durante 10 min à temperatura ambiente utilizando formaldeído a 1% (v/v), seguindo-se duas lavagens com PBS arrefecido em gelo. A reação de formação de ligações cruzadas foi interrompida por incubação com glicina a uma concentração final de 0,125 M durante 5 min à temperatura ambiente. Após incubação com tripsina, as células foram removidas da placa de cultura celular por raspagem e lavadas duas vezes com PBS. O sedimento celular foi ressuspenso em tampão de lise (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl e 0,5% (v/v) Nonidet P-40), incubado em gelo durante 10 min e homogeneizado com um homogeneizador Dounce. Posteriormente, os núcleos foram sedimentados por centrifugação (3500 x g, 5 min, 4 °C) e ressuspensos em tampão para núcleos (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA e 1% (w/v) SDS). Os núcleos foram rompidos por sonicação com três impulsos de 20 s num sonicador UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie), com uma definição de ciclo de 0,5 e amplitude de 30%, produzindo fragmentos de ADN genómico com um tamanho predominante de 200 – 1000 bp. Para ChIP, 50g de ADN foram diluídos 4 vezes em tampão de imunoprecipitação (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 e 0,01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Análise de modificações de histonas por imunoprecipitação da cromatina (ChIP)

Resumidamente, 6 x 10⁶ células foram lavadas duas vezes com PBS e submetidas à formação de ligações cruzadas na placa de cultura durante 15 min à temperatura ambiente, na presença de formaldeído a 0,5%. A reação de formação de ligações cruzadas foi interrompida pela adição de glicina a 0,125 M. Todas as etapas subsequentes foram realizadas a 48°C. Todos os tampões foram previamente arrefecidos e continham inibidores de proteases (Complete Mini, Roche). As células foram lavadas duas vezes com PBS e depois removidas por raspagem. Os sedimentos recolhidos foram dissolvidos em 1 ml de tampão de lise (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) e sonicados num banho de etanol frio durante 10 ciclos a 100% de amplitude, utilizando um sonicador UP50H (Hielscher, Teltow, Alemanha). A fragmentação da cromatina foi visualizada em gel de agarose a 1%. Os fragmentos obtidos situavam-se no intervalo de 200–500pb. A cromatina solúvel foi obtida por centrifugação das amostras sonicadas a 14 000g durante 10 min a 48°C. A fração solúvel foi diluída a 1/10 em tampão de diluição (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), depois dividida em alíquotas e armazenada a 80°C até à utilização. (Rodriguez et al. 2008)