Preparação de plasmídeos por ultra-sons

A ultra-sons é uma técnica fiável para fragmentar o ADN de plasmídeos. A amplitude precisamente controlável, o modo de pulsação e o controlo da temperatura são as caraterísticas mais importantes de um ultrasonicador para a fragmentação não prejudicial do plasmídeo. Além disso, o uso de certos agentes ajuda a proteger contra a degradação do plasmídeo. Hielscher Ultrasonics oferece várias soluções para a fragmentação controlada de plasmídeo de frascos individuais, simultaneamente sonicação de numerosas amostras, bem como placas multi-bem. Saiba mais sobre a fragmentação ultra-sônica bem sucedida do plasmídeo!

Cisalhamento de plasmídeos por ultra-sons

Quando as amostras de ADN são submetidas a ondas ultra-sónicas, as vibrações geradas por ultra-sons criam cavitação acústica no líquido que cisalha ou quebra moléculas de ADN de elevado peso molecular através de forças mecânicas. A sonicação é o método mais amplamente utilizado para experiências de cisalhamento de DNA em massa, incluindo aplicações, como a Imunoprecipitação de Cromatina (ChIP), para as quais pequenos tamanhos de fragmentos são absolutamente cruciais para obter alta resolução. (cf. Tseng et al., 2012)
O ADN plasmídico (ADNp) é uma forma específica de ADN, caracterizada pela sua forma anelar e que se encontra nas bactérias e em alguns eucariotas.
O ADNp superenrolado é a forma desejada de ADN plasmídico, uma vez que apresenta melhores resultados em processos a jusante, como a sequenciação automática e a transfecção. A ultrassonografia é adequada para fragmentar o pDNA, incluindo o pDNA superenrolado, com sucesso.
Thompson et al. (2008) demonstraram que a sonicação do plasmídeo, que é conhecida por fragmentar o ADN superenrolado, é uma forma eficaz de melhorar os comprimentos de leitura da sequência phred20 ao ponto de não serem significativamente diferentes do modelo de controlo da Beckman Coulter ou dos plasmídeos linearizados enzimaticamente.

Utilização de vectores de plasmídeos

Os plasmídeos são frequentemente utilizados como ferramentas para clonar, transferir e manipular genes. Quando os plasmídeos são utilizados experimentalmente para estes fins, são designados por vectores. Podem ser inseridos fragmentos de ADN ou genes num vetor plasmídico, criando o chamado plasmídeo recombinante. Os vectores de plasmídeos são utilizados como veículos para introduzir ADN recombinante numa célula hospedeira e são um componente essencial da clonagem molecular.
“Os vectores não virais estão a ser amplamente estudados pela sua potencial utilização na terapia genética para tratar várias doenças complicadas. Os vectores não virais protegem o ADN do plasmídeo contra a degradação física, química e enzimática e transportam a molécula de ADN para o local alvo. Por exemplo, os lipossomas catiónicos, o quitosano e outras nanopartículas com carga positiva formam complexos com o ADN plasmídico através de interações electrostáticas. No entanto, os complexos lipossomas catiónicos/ADN plasmídico facilmente formados são relativamente grandes (ou seja, 300-400 nm) e heterogéneos por natureza, o que dificulta a sua utilização em aplicações farmacêuticas. Os complexos grandes e heterogéneos de ADN plasmídico/lipossomas, ADN plasmídico/aerossóis e ADN plasmídico/peptídeos podem ser reduzidos a partículas mais pequenas e homogéneas utilizando ultra-sons.” (Sarker et al., 2019)
Um exemplo proeminente da utilização de vectores plasmídicos é o CRISPR-Cas9. O sistema CRISPR-Cas9 é normalmente fornecido às células sob a forma de um único plasmídeo grande ou de vários plasmídeos mais pequenos que codificam uma sequência alvo, um guia CRISPR e Cas9.

Preparação ultra-sónica de nanopartículas de PLGA carregadas com ADN por nanoprecipitação

Jo et al. (2020) utilizaram ácido poli(lático-co-glicólico) (PLGA) para formar um transportador de nanopartículas para a entrega de um modelo de plasmídeo CRISPR-Cas9 em macrófagos primários derivados da medula óssea. Para a nanoprecipitação de nanopartículas de PLGA, foram utilizados PLGA com dois grupos terminais diferentes (grupos éster e amina), com o objetivo de aumentar a eficiência de encapsulamento e a carga devido às interações de carga entre estes e a espinha dorsal do ADN com carga negativa. Num tubo de centrifugação cónico de polipropileno de 50 ml, 100 mg de Pluronic F127 foram dissolvidos em 20 ml de água desionizada autoclavada por mistura em vórtice, seguida de 30 minutos de sonicação suave utilizando um banho de ultra-sons (ver CupHorn). Foi adicionada uma barra de agitação magnética autoclavada e a solução foi misturada a 600 RPM durante 30 minutos enquanto se preparavam as outras soluções. Utilizou-se material de laboratório de plástico em vez de vidro para minimizar a adsorção inespecífica de ADN. As soluções de PLGA dissolvido em DMF (44,48 mg/ml) e de pentaceno TIPS dissolvido em THF (0,667 mg/ml) foram preparadas separadamente. O PLGA foi deixado em repouso para molhar em DMF durante 30 min antes de ser sonicado durante 30 min. (para o protocolo completo ver Jo et al., 2020)

Proteção do ADN do plasmídeo durante a sonicação

O ADN, incluindo os plasmídeos e os plasmídeos superenrolados, é altamente sensível à degradação. Todos os métodos de fragmentação disponíveis são conhecidos por certas desvantagens. A fragmentação ultra-sónica do ADN é um dos métodos preferidos, uma vez que a sonicação controlada, em combinação com medidas de proteção, permite reduzir os danos induzidos pelo cisalhamento e pelo calor nas cadeias de ADN.
Além de configurações de baixa amplitude, modo de pulsação e controle de temperatura durante o cisalhamento de DNA ultra-sônico, o uso de certos agentes mostrou efeito protetor significativo contra a degradação do DNA. Por exemplo, vários polímeros, péptidos e lípidos protegem o ADN do plasmídeo durante a ultra-sons.

A estabilidade do ADN plasmídico e dos nanocomplexos de ADN plasmídico/IL contra a tensão de cisalhamento ultra-sónica foi investigada utilizando o ensaio de eletroforese em gel de agarose. Tanto o ADN plasmídico como os nanocomplexos de ADN plasmídico/IL foram submetidos a tensão de cisalhamento ultra-sónica durante diferentes períodos de tempo. O ADN plasmídico foi exposto a tensão de cisalhamento ultra-sónica durante 0, 10, 20, 30 e 40 minutos. No entanto, os nanocomplexos de ADN plasmídico/IL foram expostos a tensão de cisalhamento ultra-sónica durante 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 e 120 minutos.
(estudo e imagem: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) demonstraram que quando as nanoestruturas de DNA plasmídico / líquido iônico (pDNA / IL) foram submetidas a estresse de cisalhamento ultrassônico por 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 e 120 min e complexadas com o agente de entrega de genes catiônicos disponível comercialmente lipofectamina, a porcentagem de células positivas fluorescentes foi de 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% e 50%, respetivamente (veja o gráfico abaixo). A percentagem de células fluorescentes positivas aumentou quando as nanoestruturas foram sujeitas a tensão de cisalhamento ultra-sónica durante 10 e 20 minutos, tendo depois diminuído lentamente.

Influência do líquido iónico [Bmim][PF6] na entrega de ADN plasmídico às células COS7. Os nanocomplexos de ADN plasmídico/IL (líquido iónico) foram submetidos a uma tensão de cisalhamento ultra-sónica durante 120 minutos e complexados com LA antes de serem entregues às células COS7. Os dados mostram o número médio (%) de células HeLa positivas para GFP contadas em 10 campos microscópicos diferentes e a experiência foi efectuada várias vezes em três dias diferentes. (Estudo e gráfico: ©Sarker et al., 2019)

Preparação do lisado por ultra-sons

Protocolo de lise celular por ultra-sons
Comece com uma amostra enriquecida de células que foi preparada através de um método de separação de células (por exemplo, separação de células imunomagnéticas, triagem de células activadas por fluorescência (FACS), centrifugação em gradiente de densidade, isolamento de células por imunodensidade).
As amostras de células devem apresentar um volume de tampão de lise adequado ao objetivo experimental e ao aparelho de ultra-sons do tipo sonda.
Os tampões hipotónicos são preferidos, uma vez que aumentam a lise ultra-sónica das células. É importante que os aditivos e a concentração de sais sejam utilizados de forma adequada.
Selecione o seu dispositivo de lise ultra-sónica: Para a sonicação indireta de frascos, o VialTweeter ou CupHorn são recomendados. Para placas de poços múltiplos, o UIP400MTP é o ultrasonicator ideal. E sonicação tipo sonda clássica, um homogeneizador de ultra-sons como o UP100H ou UP200Ht com uma micro-ponta são mais adequados.
Protocolo para a sonicação do tipo sonda: Colocar a sonda de ultra-sons no volume da amostra num tubo de microcentrifugação e proceder à sonicação durante cerca de 10 segundos. Dependendo da amostra de ADN, a sonicação pode ser repetida uma ou duas vezes mais. A entrada de energia ultra-sónica necessária (Ws/mL) depende da viscosidade da amostra e do tipo de ADN. O arrefecimento através de um banho de gelo e do modo de pulsação do ultrassom ajuda a evitar que a amostra seja degradada termicamente.
Após a lise ultra-sónica, a amostra é centrifugada para separar os resíduos do pellet (que contêm células não lisadas, núcleos e organelos não lisados)
Se a amostra não for imediatamente processada, pode ser armazenada a uma temperatura adequada para preservar a sua viabilidade.

Ultrassons para fragmentação de ADN

Hielscher Ultrasonics oferece várias plataformas baseadas em ultrassom para DNA, RNA, e fragmentação da cromatina. Estas diferentes plataformas incluem sondas ultra-sónicas (sonotrodos), soluções de sonicação indireta para a preparação simultânea de amostras de vários tubos ou placas de vários poços (por exemplo, placas de 96 poços, placas de microtitulação), sonoreactores e cúpulas ultra-sónicas. Todas as plataformas de cisalhamento de ADN são alimentadas por processadores ultra-sónicos de alto desempenho, sintonizados em frequência, que são controlados com precisão e fornecem resultados reprodutíveis.

Processadores ultra-sónicos para qualquer número e tamanho de amostra

Com os ultrasonicators multi-amostra de Hielscher VialTweeter (para até 10 tubos de ensaio) e UIP400MTP (para microplacas / placas multiwell) torna-se facilmente possível reduzir o tempo de processamento da amostra devido à ultrasonication intensa e precisamente controlável enquanto obtém a distribuição de tamanho de fragmento de DNA desejado e rendimento. A fragmentação ultra-sónica do ADN torna as etapas de preparação de plasmídeos eficientes, fiáveis e escaláveis. Os protocolos podem ser escalonados linearmente de uma para várias amostras aplicando parâmetros de ultrassom constantes.
Os ultrassons de sonda com um a cinco dedos são ideais para a preparação de amostras mais pequenas. Os ultrasonicadores de laboratório da Hielscher estão disponíveis com diferentes níveis de potência para que possa escolher o disruptor ultrassónico ideal para a sua aplicação relacionada com o ADN.