Ultrassônica é uma técnica confiável para fragmentar DNA plasmídeo. Amplitude controlável precisa, modo de pulsação e controle de temperatura são características mais importantes de um ultrassonônico para fragmentação plasmida não prejudicial. Além disso, o uso de certos agentes ajuda a proteger contra a degradação plasmida. Hielscher Ultrasonics oferece várias soluções para fragmentação plasmida controlada a partir de frascos únicos, simultaneamente sônica de numerosas amostras, bem como placas multi-poços. Saiba mais sobre fragmentação de plasmídeos ultrassônicos bem sucedidos!

Tesoura plasmid usando ultrassônica

Quando as amostras de DNA são submetidas a ondas ultrassônicas, as vibrações ultrasonicamente geradas criam cavitação acústica no líquido que tesoura ou quebra moléculas de DNA de alto peso molecular através de forças mecânicas. A sônicação é o método mais utilizado para experimentos de cisalhamento de DNA em massa, incluindo aplicações, como a Imunoprecipitação de Chromatina (ChIP), para a qual tamanhos de pequenos fragmentos são absolutamente cruciais para obter alta resolução. (cf. Tseng et al., 2012)
Dna plasmídeo (pDNA) é uma forma específica de DNA, caracterizada por sua forma de anel e é encontrada em bactérias e alguns eucariotes.
PDNA supercoiled é a forma desejada de DNA plasmídeo, pois mostra melhores resultados em processos de down-stream, como sequenciamento automatizado e transfecção. A ultrassônica é adequada para fragmentar pDNA, incluindo pDNA supercoiled, com sucesso.
Thompson et al. (2008) demonstraram que a sônica plasmida, que é conhecida por fragmentar DNA supercoilado, é uma maneira eficaz de melhorar os comprimentos de leitura de sequência phred20 a ponto de não serem significativamente diferentes do modelo de controle de Beckman Coulter ou plasmídeos enzimaticamente linearizados.

Uso de Vetores Plasmid

Plasmídeos são frequentemente usados como ferramentas para clonar, transferir e manipular genes. Quando plasmídeos são usados experimentalmente para esses fins, eles são chamados vetores. Fragmentos de DNA ou genes podem ser inseridos em um vetor plasmídeo, criando um chamado plasmídeo recombinante. Vetores plasmídeos são usados como veículos para conduzir DNA recombinante em uma célula hospedeira e são um componente-chave da clonagem molecular.
“Vetores não virais estão sendo extensivamente estudados para seu potencial uso na terapia genética para tratar várias doenças complicadas. Vetores não virais protegem o DNA plasmídeo contra degradação física, química e enzimática e entregam a molécula de DNA ao local alvo. Por exemplo, lipossomos cônicos, quitosanos e outras nanopartículas positivamente carregadas formam complexos com DNA plasmídeo através de interações eletrostáticas. No entanto, os complexos de DNA cático/plasmídeos facilmente formados são relativamente grandes (ou seja, 300-400 nm) e heterogêneos na natureza, tornando-os difíceis de usar em aplicações farmacêuticas. Os grandes e heterogêneos DNA plasmídeos/lipossomos, DNA plasmido/aerossóis e complexos plasmídeos de DNA/peptídeos podem ser reduzidos a partículas menores e homogêneas usando ultrassônicas.” (Sarker et al., 2019)
Um exemplo proeminente para o uso de vetores plasmídeos é o CRISPR-Cas9. O sistema CRISPR-Cas9 é normalmente entregue às células como um único plasmídeo grande ou vários plasmídeos menores que codificam uma sequência de destino, um guia CRISPR e Cas9.

Preparação ultrassônica de nanopartículas PLGA carregadas de DNA por Nanoprecipitação

Jo et al. (2020) utilizaram o poli (ácido láctico-coglicólico) (PLGA) para formar um portador de nanopartículas para a entrega de um modelo CRISPR-Cas9 plasmid em macrófagos derivados da medula óssea primária. Para a nanoprecipitação das nanopartículas PLGA, plga com dois grupos finais diferentes (grupos éster e amina) foram utilizados com o objetivo de que as tampas finais de amina carregadas positivamente aumentem a eficiência de encapsulamento e o carregamento devido às interações de carga entre ela e a espinha dorsal negativamente carregada do DNA. Em um tubo de centrífuga conífvia de polipropileno de 50 mL, 100 mg plurônico F127 foi dissolvido em 20 mL autoclaved DI água por mistura de vórtice seguido por 30 min de sônica suave usando um banho ultrassônico (ver CupHorn). Uma barra de agitação magnética autoclaved foi adicionada e a solução foi misturada a 600 RPM por 30 min, enquanto as outras soluções foram feitas. O labware plástico foi usado em vez de vidros para minimizar a adsorção inespecífica do DNA. As soluções de PLGA dissolvidas em DMF (44,48 mg/ml) e tips pentacene dissolvida em THF (0,667 mg/ml) foram feitas separadamente. O PLGA foi deixado quiescentamente para molhar em DMF por 30 minutos antes de ser sonicado por 30 min. (para protocolo completo ver Jo et al., 2020)

Proteção de DNA plasmid durante a Sonicação

DNA incluindo plasmídeos e plasmídeos supercoilados são degradação altamente sensível. Todos os métodos de fragmentação disponíveis são conhecidos por certas desvantagens. A fragmentação do DNA ultrassônico é um dos métodos preferidos, uma vez que a sônica controlada em combinação com medidas de proteção permite reduzir o dano induzido por cisalhamento e calor dos fios de DNA.
Além de configurações de baixa amplitude, modo de pulsação e controle de temperatura durante a cisalhamento do DNA ultrassônico, o uso de certos agentes mostrou efeito protetor significativo contra a degradação do DNA. Por exemplo, vários polímeros, peptídeos e lipídios protegem o DNA plasmóide durante a ultrassônica.

A estabilidade do DNA plasmídeo, e nanocomplexos plasmídeos de DNA/IL contra o estresse da cisalhamento ultrassônico foi investigada usando o ensaio de eletroforese de gel agarose. Tanto o DNA plasmídeo quanto os nanocomplexos de DNA plasmídeo/IL foram submetidos a estresse de cisalhamento ultrassônico por diferentes pontos de tempo. O DNA plasmídeo foi exposto ao estresse ultrassônico da tesoura por 0, 10, 20, 30 e 40 minutos. No entanto, os nanocomplexos de DNA plasmídeo/IL foram expostos ao estresse ultrassônico da tesoura por 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 e 120 minutos.
(estudo e imagem: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) demonstraram que quando as nanoestruturas de DNA plasmídeo / líquido iônico (pDNA/IL) foram submetidas a estresse de cisalhamento ultrassônico por 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 e 120 min e complexo com o agente de entrega de genes caônicos comercialmente disponível lipofectamina, o percentual de células fluorescentes positivas foram 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65%, e 50%, respectivamente (veja gráfico abaixo). A porcentagem de células fluorescentes positivas aumentou quando as nanoestruturas foram submetidas ao estresse ultrassônico da cisalhamento por 10, e 20 minutos, e depois diminuiu lentamente.

Influência do líquido iônico [Imim][PF6] na entrega de DNA plasmídeo para células COS7. Os nanocomplexos plasmídeos de DNA/IL (líquido iônico) foram submetidos a estresse de cisalhamento ultrassônico por até 120 minutos e complexos com LA antes de serem entregues em células COS7. Os dados mostram que o número médio (%) das células HeLa positivas do GFP contabilizou em 10 diferentes campos microscópicos e o experimento foi realizado várias vezes em três dias diferentes. (Estudo e gráfico: ©Sarker et al., 2019)

Preparação de Lysate Ultrassônico

Protocolo de Lise Celular Ultrassônica
Comece com uma amostra enriquecida de células que foi preparada através de um método de separação celular (por exemplo, separação de células imunomagnéticas, classificação celular ativada por fluorescência (FACS), centrifugação gradiente de densidade, isolamento celular imunodensidade).
As amostras de células devem mostrar um volume de um tampão de lise apropriado para o objetivo experimental e ultrassonicador do tipo sonda.
Tampões hipotônicos são preferidos, pois melhoram a lise celular ultrassônica. É importante que os aditivos e a concentração de sal sejam usados de forma adequada.
Selecione seu dispositivo de lise ultrassônica: Para sônicação indireta de frascos, recomenda-se o Frasco ou CupHorn. Para placas multiwell, o UIP400MTP é o ultrassônico ideal. E a sônica clássica do tipo sonda, um homogeneizador ultrassônico como o UP100H ou UP200Ht com uma micro-ponta são mais adequados.
Protocolo para sônica do tipo sonda: Coloque a sonda ultrassônica no volume da amostra em um tubo de microcentrifusagem e sonicar por aproximadamente 10 segundos. Dependendo da amostra de DNA, a sônica pode ser repetida mais uma ou duas vezes. A entrada de energia ultrassônica necessária (Ws/mL) depende da viscosidade da amostra e do tipo de DNA. O resfriamento via banho de gelo e modo de pulsação do ultrassonicador ajuda a evitar que a amostra seja termicamente degradada.
Após a lise ultrassônica, a amostra é centrifugada para detritos separados de pelotas (contendo células não tosificadas, núcleos e organelas não tortos)
Se a amostra não for processada imediatamente, pode ser armazenada a uma temperatura apropriada para preservar sua viabilidade.

Ultrassonicadores para Fragmentação de DNA

Hielscher Ultrasonics oferece várias plataformas baseadas em ultrassom para fragmentação de DNA, RNA e cromatina. Essas diferentes plataformas incluem sondas ultrassônicas (sonotrodes), soluções de sônica indireta para a preparação simultânea de amostras de múltiplos tubos ou placas multi-poços (por exemplo, placas de 96 poços, placas de microtítmetro), sonoretores e cuphorns ultrassônicos. Todas as plataformas para cisalhamento de DNA são alimentadas por processadores ultrassônicos de alto desempenho, com frequência, que são precisamente controláveis e entregam resultados reprodutíveis.

Processadores ultrassônicos para qualquer número de amostra e tamanho

Com os ultrassonicadores multi-amostras de Hielscher VialTweeter (para até 10 tubos de ensaio) e UIP400MTP (para microplacas/ placas multiwell) torna-se facilmente possível reduzir o tempo de processamento da amostra devido à ultrassonização intensa e precisamente controlável, ao mesmo tempo em que se obtém a distribuição e rendimento do tamanho e rendimento do fragmento de DNA desejado. A fragmentação do DNA ultrassônico torna as etapas de preparação plasmid eficientes, confiáveis e escaláveis. Os protocolos podem ser dimensionados linearmente de uma para numerosas amostras aplicando parâmetros constantes de ultrassom.
Ultrassonicadores de sonda com um a cinco dedos são ideais para a preparação de números amostrais menores. Os ultrassonicadores de laboratório da Hielscher estão disponíveis com diferentes níveis de potência para que você possa escolher o disruptor ultrassônico ideal para sua aplicação relacionada ao DNA.