Preparação de plasmídeos por ultrassonicação

A ultrassonicação é uma técnica fiável para fragmentar ADN plasmídico. Uma amplitude controlável com precisão, o modo de pulsação e o controlo da temperatura são as características mais importantes de um sonicador para a fragmentação de plasmídeos sem causar danos. Além disso, a utilização de determinados agentes ajuda a proteger contra a degradação dos plasmídeos. A Hielscher Ultrasonics oferece várias soluções para a fragmentação controlada de plasmídeos em frascos individuais, para a sonicação simultânea de numerosas amostras, bem como de placas multipoços. Saiba mais sobre a fragmentação ultrassónica bem-sucedida de plasmídeos!

Cisalhamento de plasmídeos por ultrassonicação

Quando as amostras de ADN são submetidas a ondas ultrassónicas, as vibrações geradas pelos ultrassons criam cavitação acústica no líquido, que provoca o cisalhamento ou a quebra das moléculas de ADN de elevado peso molecular através de forças mecânicas. A sonicação é o método mais utilizado em experiências de cisalhamento de ADN em massa, incluindo aplicações como a imunoprecipitação da cromatina (ChIP), nas quais fragmentos de pequenas dimensões são absolutamente cruciais para obter uma elevada resolução. (cf. Tseng et al., 2012)
O ADN plasmídico (pDNA) é uma forma específica de ADN, caracterizada pela sua forma anelar, e encontra-se em bactérias e em alguns eucariotas.
O pDNA superenrolado é a forma desejada de ADN plasmídico, uma vez que apresenta os melhores resultados em processos subsequentes, como a sequenciação automatizada e a transfeção. A ultrassonicação é adequada para fragmentar com sucesso o pDNA, incluindo o pDNA superenrolado.
Thompson et al. (2008) demonstraram que a sonicação de plasmídeos, que é conhecida por fragmentar ADN superenrolado, é uma forma eficaz de melhorar os comprimentos de leitura de sequências phred20, ao ponto de estes não serem significativamente diferentes dos obtidos com o molde de controlo da Beckman Coulter ou com plasmídeos linearizados enzimaticamente.

Utilização de vetores plasmídicos

Os plasmídeos são frequentemente utilizados como ferramentas para clonar, transferir e manipular genes. Quando os plasmídeos são utilizados experimentalmente para estes fins, são designados vetores. Podem inserir-se fragmentos de ADN ou genes num vetor plasmídico, criando um chamado plasmídeo recombinante. Os vetores plasmídicos são utilizados como veículos para introduzir ADN recombinante numa célula hospedeira e constituem um componente fundamental da clonagem molecular.
“Os vetores não virais estão a ser amplamente estudados quanto à sua potencial utilização em terapia génica para tratar várias doenças complexas. Os vetores não virais protegem o ADN plasmídico contra a degradação física, química e enzimática e transportam a molécula de ADN até ao local-alvo. Por exemplo, os lipossomas catiónicos, o quitosano e outras nanopartículas com carga positiva formam complexos com o ADN plasmídico através de interações eletrostáticas. No entanto, os complexos de lipossomas catiónicos/ADN plasmídico, que se formam facilmente, são relativamente grandes (isto é, 300–400 nm) e de natureza heterogénea, o que dificulta a sua utilização em aplicações farmacêuticas. Os complexos grandes e heterogéneos de ADN plasmídico/lipossomas, ADN plasmídico/aerossóis e ADN plasmídico/péptidos podem ser reduzidos a partículas mais pequenas e homogéneas através da ultrassonicação.” (Sarker et al., 2019)
Um exemplo de destaque da utilização de vetores plasmídicos é o CRISPR–Cas9. O sistema CRISPR–Cas9 é normalmente introduzido nas células sob a forma de um único plasmídeo grande ou de vários plasmídeos mais pequenos que codificam uma sequência-alvo, um guia CRISPR e Cas9.

Preparação ultrassónica de nanopartículas de PLGA carregadas com ADN por nanoprecipitação

Jo et al. (2020) utilizaram poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) para formar um transportador nanoparticulado destinado à introdução de um plasmídeo modelo CRISPR–Cas9 em macrófagos primários derivados da medula óssea. Para a nanoprecipitação de nanopartículas de PLGA, utilizou-se PLGA com dois grupos terminais diferentes (grupos éster e amina), com o objetivo de que os grupos terminais amina, com carga positiva, aumentassem a eficiência de encapsulação e a carga devido às interações entre a sua carga e a cadeia principal do ADN, com carga negativa. Num tubo cónico de centrifugação de polipropileno de 50 mL, dissolveram-se 100 mg de Pluronic F127 em 20 mL de água desionizada autoclavada por mistura em vórtex, seguida de 30 min de sonicação suave num banho ultrassónico (ver CupHorn). Adicionou-se uma barra de agitação magnética autoclavada e a solução foi agitada a 600 RPM durante 30 min enquanto se preparavam as outras soluções. Utilizou-se material de laboratório de plástico em vez de vidro ao longo de todo o procedimento para minimizar a adsorção inespecífica de ADN. Prepararam-se separadamente soluções de PLGA dissolvido em DMF (44,48 mg/ ml) e de pentaceno TIPS dissolvido em THF (0,667 mg/ml). O PLGA foi deixado em repouso para humedecer em DMF durante 30 min antes de ser sonicado durante 30 min. (para o protocolo completo, ver Jo et al., 2020)

Proteção do ADN plasmídico durante a sonicação

O ADN, incluindo os plasmídeos e os plasmídeos superenrolados, é altamente sensível à degradação. Todos os métodos de fragmentação disponíveis são conhecidos por apresentarem determinadas desvantagens. A fragmentação ultrassónica de ADN é um dos métodos preferidos, uma vez que a sonicação controlada, em combinação com medidas de proteção, permite reduzir os danos nas cadeias de ADN induzidos pelo cisalhamento e pelo calor.
Além das definições de baixa amplitude, do modo de pulsação e do controlo da temperatura durante o cisalhamento ultrassónico de ADN, a utilização de determinados agentes demonstrou um efeito protetor significativo contra a degradação do ADN. Por exemplo, vários polímeros, péptidos e lípidos protegem o ADN plasmídico durante a ultrassonicação.

A estabilidade do ADN plasmídico e dos nanocomplexos de ADN plasmídico/IL face à tensão de cisalhamento ultrassónico foi investigada através de um ensaio de eletroforese em gel de agarose. Tanto o ADN plasmídico como os nanocomplexos de ADN plasmídico/IL foram submetidos a tensão de cisalhamento ultrassónico durante diferentes períodos de tempo. O ADN plasmídico foi exposto a tensão de cisalhamento ultrassónico durante 0, 10, 20, 30 e 40 minutos. No entanto, os nanocomplexos de ADN plasmídico/IL foram expostos a tensão de cisalhamento ultrassónico durante 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 e 120 minutos.
(estudo e imagem: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) demonstraram que, quando as nanoestruturas de ADN plasmídico / líquido iónico (pDNA/IL) foram submetidas a tensão de cisalhamento ultrassónico durante 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 e 120 min e complexadas com o agente catiónico de transferência génica disponível comercialmente lipofectamine, as percentagens de células positivas para fluorescência foram de 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% e 50%, respetivamente (ver gráfico abaixo). A percentagem de células positivas para fluorescência aumentou quando as nanoestruturas foram submetidas a tensão de cisalhamento ultrassónico durante 10 e 20 min, diminuindo lentamente depois disso.

Influência do líquido iónico [Bmim][PF6] na introdução de ADN plasmídico em células COS7. Os nanocomplexos de ADN plasmídico/IL (líquido iónico) foram submetidos a tensão de cisalhamento ultrassónico durante até 120 minutos e complexados com LA antes da introdução nas células COS7. Os dados mostram o número médio (%) de células HeLa positivas para GFP contadas em 10 campos microscópicos diferentes, e a experiência foi realizada várias vezes em três dias diferentes. (Estudo e gráfico: ©Sarker et al., 2019)

Preparação ultrassónica de lisados

Protocolo de lise celular ultrassónica
Comece com uma amostra enriquecida de células preparada através de um método de separação celular (por exemplo, separação celular imunomagnética, separação de células ativada por fluorescência (FACS), centrifugação em gradiente de densidade, isolamento celular por imunodensidade).
As amostras de células devem conter um volume de tampão de lise adequado ao objetivo experimental e ao sonicador de sonda.
Os tampões hipotónicos são preferidos, uma vez que potenciam a lise celular ultrassónica. É importante que os aditivos e a concentração de sal sejam utilizados de forma adequada.
Selecione o seu dispositivo de lise ultrassónica: para a sonicação indireta de frascos, recomendam-se o VialTweeter ou o CupHorn. Para placas multipoços, o UIP400MTP é o sonicador ideal. Para a sonicação clássica com sonda, os mais adequados são homogeneizadores ultrassónicos como o UP100H ou o UP200Ht com uma microponta.
Protocolo de sonicação com sonda: Coloque a sonda do sonicador no volume da amostra num tubo de microcentrifugação e proceda à sonicação durante aproximadamente 10 segundos. Dependendo da amostra de ADN, a sonicação poderá ser repetida mais uma ou duas vezes. O aporte de energia ultrassónica necessário (Ws/mL) depende da viscosidade da amostra e do tipo de ADN. O arrefecimento através de um banho de gelo e o modo de pulsação do sonicador ajudam a evitar a degradação térmica da amostra.
Após a lise ultrassónica, a amostra é centrifugada para separar os detritos no sedimento (que contém células não lisadas, núcleos e organelos não lisados).
Se a amostra não for imediatamente submetida a processamento adicional, pode ser armazenada a uma temperatura adequada para preservar a sua viabilidade.

Sonicadores para fragmentação de ADN

A Hielscher Ultrasonics oferece várias plataformas baseadas em ultrassons para a fragmentação de ADN, ARN e cromatina. Estas diferentes plataformas incluem sondas ultrassónicas (sonotrodos), soluções de sonicação indireta para a preparação simultânea de amostras em vários tubos ou placas multipoços (por exemplo, placas de 96 poços, placas de microtitulação), sonorreatores e cuphorns ultrassónicos. Todas as plataformas para cisalhamento de ADN são acionadas por processadores ultrassónicos de elevado desempenho com frequência ajustada, que são controláveis com precisão e proporcionam resultados reprodutíveis.

Processadores ultrassónicos para qualquer número e dimensão de amostras

Com os sonicadores para múltiplas amostras VialTweeter (para até 10 tubos de ensaio) e UIP400MTP (para microplacas/placas multipoços) da Hielscher, torna-se fácil reduzir o tempo de processamento das amostras graças à ultrassonicação intensa e controlável com precisão, obtendo simultaneamente a distribuição de tamanhos dos fragmentos de ADN e o rendimento desejados. A fragmentação ultrassónica de ADN torna as etapas de preparação de plasmídeos eficientes, fiáveis e escaláveis. Os protocolos podem ser escalados linearmente de uma para numerosas amostras, aplicando parâmetros ultrassónicos constantes.
Os sonicadores de sonda com um a cinco dedos são ideais para a preparação de um menor número de amostras. Os sonicadores de laboratório da Hielscher estão disponíveis com diferentes níveis de potência, para que possa escolher o dispositivo ultrassónico de rutura ideal para a sua aplicação relacionada com ADN.