Preparação de amostras por ultra-sons para ensaios ELISA
Ensaios como o ELISA são amplamente utilizados para diagnósticos in vitro, deteção de proteínas relacionadas com doenças e controlo de qualidade (por exemplo, monitorização de alergénios alimentares). A preparação de amostras por ultra-sons é uma técnica rápida, fiável e reprodutível para lisar células e isolar proteínas intracelulares, ADN, ARN e organelos. Hielscher Ultrasonics oferece várias soluções de ultrassom para a preparação conveniente de amostras individuais, vários frascos, bem como para placas de microtitulação e placas de 96 poços.
ELISA – Ensaio de imunoabsorção enzimática
ELISA significa Enzyme-linked immunosorbent assay (ensaio de imunoabsorção enzimática) e é uma técnica de análise bioquímica amplamente utilizada da categoria de ensaios de ligação de ligandos. No ELISA, uma amostra líquida é adicionada a uma fase sólida estacionária com propriedades de ligação especiais. Normalmente, a fase sólida estacionária é aplicada como revestimento numa placa de poços ou numa placa ELISA. Em seguida, são adicionados sequencialmente vários reagentes líquidos, incubados e lavados, de modo a que finalmente ocorra uma alteração ótica (por exemplo, desenvolvimento de cor pelo produto de uma reação enzimática) no líquido final do poço. A alteração ótica permite medir a quantidade da substância a analisar através do chamado método quantitativo “leitura". Para a leitura quantitativa, é utilizado um espetrofotómetro, fluorómetro ou luminómetro para detetar e medir a intensidade da luz transmitida. A sensibilidade da deteção é influenciada pela amplificação do sinal durante as reacções analíticas. Uma vez que as reacções enzimáticas são processos de amplificação bem investigados e fiáveis, são utilizadas enzimas para criar o sinal. As enzimas são ligadas aos reagentes de deteção em proporções fixas para permitir uma quantificação exacta, o que explica também o nome "ensaio imunoenzimático".
Uma vez que os ensaios ELISA são realizados em placas de microtítulo / placas de 96 poços, são conhecidos como técnica de ensaio em placas e são utilizados, por exemplo, no diagnóstico clínico in vitro, na investigação, no desenvolvimento de medicamentos, etc., para detetar e quantificar anticorpos, péptidos, proteínas e hormonas.
A técnica ELISA é frequentemente utilizada como ferramenta de diagnóstico em medicina, biotecnologia, fitopatologia e é também uma importante medida de controlo de qualidade em várias indústrias.
A unidade de preparação de amostras por ultra-sons VialTweeter é utilizado para lise celular e extração de proteínas antes de ensaios ELISA
Preparação de amostras por ultra-sons antes do ELISA
Antes de se poder realizar o ensaio ELISA, as amostras requerem etapas de preparação, como a lise celular e a extração de proteínas intracelulares, ADN, ARN, etc. A vantagem da lise celular ultrassónica e do isolamento de proteínas é a sua elevada eficiência, fiabilidade e reprodutibilidade. Todos estes factores são importantes para a obtenção de diagnósticos e resultados de investigação de elevada qualidade
- Tratamento homogéneo das amostras
- Lise completa
- Extração completa de proteínas (por exemplo, anticorpos, ADN)
- Adaptação óptima ao tipo de célula
- Para qualquer tamanho de amostra
- reproduzível
- com controlo de temperatura
- Protocolo automático de dados no cartão SD
Protocolo para a lise ultra-sónica de células pré-ELISA
- Para culturas de células: Antes da lise ultrassónica das células, centrifugar as células durante 5 minutos a 270 x g numa microcentrifugadora. Remover o sobrenadante por aspiração e ressuspender as células em 30 - 100 μL de tampão RIPA. Em seguida, incubar o pellet de células em gelo durante 30 min.
- Agora, a amostra de células está pronta para a lise ultra-sónica:
Utilizar um aparelho de ultra-sons do tipo sonda (por exemplo UP200Ht com a sonda S26d2) ou um dispositivo ultrassónico multiamostras (por exemplo, o VialTweeter para a sonicação simultânea de até 10 frascos ou o UIP400MPT para placas de microtitulação / placas de 96 poços), dependendo da quantidade de amostras que precisa de preparar.
Para a sonicação do tipo sonda de uma única amostra, colocar as células em tubos de microcentrifugação de 1,5 mL. - Pré-defina a duração dos ultra-sons, a entrada total de energia, o modo de ciclo e/ou os limites de temperatura no menu digital do ultrassom. Isto assegura uma sonicação e repetibilidade altamente fiáveis.
- Inserir o sonotrodo e ligar o dispositivo de ultra-sons. Mover suavemente a microponta da sonda de ultra-sons através da amostra para sonicar a amostra uniformemente.
Para a maioria das células, a lise ultra-sónica estará concluída após 2 a 4 ciclos de sonicação de 10 segundos. - Após a sonicação, retirar o sonotrodo da amostra. As amostras devem ser incubadas em gelo durante 5 minutos. Em seguida, centrifugar a 10.000 x g durante 20 min para sedimentar os detritos. Transferir os sobrenadantes para um novo tubo de microcentrifugação. Rotular os analitos e armazenar a -20°C.
- O sonotrodo ultrassónico pode ser limpo limpando-o adequadamente com álcool ou sonicando-o num copo cheio de álcool, por exemplo, etanol a 70%. Todas as sondas ultra-sónicas feitas de titânio são autoclaváveis.
Extração de proteínas de células E.coli com o sonda ultra-sónica UP200St
- Lavar o tecido com PBS gelado (0,01M, pH=7,4) para remover completamente o excesso de sangue de hemólise.
- Pesar o tecido (rim, coração, pulmão, baço, etc.) e macerá-lo em pequenos pedaços, que são homogeneizados em PBS. O volume de PBS necessário está relacionado com o peso do tecido. Regra geral, 1g de tecido requer aproximadamente 9mL de PBS. Recomenda-se a adição de um inibidor de proteases ao PBS. (Em alternativa, pode ser utilizado o RIPA ou o tampão de lise hipotónico contendo um cocktail de inibidores da protease e da fosfatase).
- Dependendo do tamanho do tecido, um tratamento de vórtice curto (aprox. 1-2 min. em impulsos de 15 seg.) pode ser útil para pré-tratar o tecido.
- Montar uma microponta, por exemplo, S26d2, no ultrassom. Colocar o tubo de amostra com o tecido num banho de gelo.
- Sonicar a amostra com o seu aparelho de ultra-sons, por exemplo, UP200St (80% de amplitude) durante 1 min. em modo pulsado (15 seg. ligado, 15 seg. pausa). Manter a amostra no banho de gelo.
- Os homogenatos são depois centrifugados para obter pools específicos (citosólico, nuclear, mitocondrial ou lisossómico), a fim de enriquecer as proteínas para análise. Centrifugando a amostra durante 5 minutos a 5000×g, o sobrenadante é recuperado.
O sonotrodo MTP-24-8-96 tem oito sondas ultra-sónicas para a sonicação dos poços das placas de microtitulação.
Controlo fiável da temperatura durante a sonicação
A temperatura é um fator crucial que influencia o processo e que é especialmente importante para o tratamento de amostras biológicas, por exemplo, para evitar a degradação térmica das proteínas. Como todas as técnicas mecânicas de preparação de amostras, a sonicação gera calor. No entanto, a temperatura das amostras pode ser bem controlada quando se utilizam os dispositivos Hielscher Ultrasonics. Apresentamos-lhe várias opções para monitorizar e controlar a temperatura das suas amostras enquanto as prepara com um ultrasonicador do tipo sonda ou com o VialTweeter pré-analiticamente.
- Monitorização da temperatura da amostra: Todos os processadores ultra-sónicos digitais Hielscher estão equipados com um software inteligente e um sensor de temperatura conectável. Ligue o sensor de temperatura ao dispositivo de ultra-sons (por exemplo, UP200Ht, UP200St, VialTweeter, Sonicador de placas com vários poços UIP400MTP) e insira a ponta do sensor de temperatura num dos tubos de amostra. Através do ecrã tátil digital colorido, pode definir no menu do processador de ultra-sons um intervalo de temperatura específico para a sonicação da sua amostra. O ultrassom pára automaticamente quando a temperatura máxima é atingida e faz uma pausa até que a temperatura da amostra desça para o valor mais baixo da temperatura definida ∆. Em seguida, a sonicação recomeça automaticamente. Esta funcionalidade inteligente evita a degradação induzida pelo calor.
- Relativamente à unidade ultra-sónica de amostras múltiplas VialTweeter, o bloco de titânio, que contém os tubos de amostra, pode ser pré-arrefecido. Colocar o bloco VialTweeter (apenas o sonotrodo sem transdutor!) no frigorífico ou no congelador para pré-arrefecer o bloco de titânio ajuda a adiar o aumento da temperatura na amostra. Se possível, a própria amostra também pode ser pré-arrefecida.
- Utilizar um banho de gelo ou gelo seco para arrefecer durante a sonicação. Coloque o(s) tubo(s) de amostra durante a sonicação num banho de gelo. Para o VialTweeter, utilize um tabuleiro pouco profundo cheio de gelo seco e coloque o VialTweeter sobre o gelo seco para que o calor se possa dissipar rapidamente.
Clientes em todo o mundo usam os ultrasonicators tipo sonda Hielscher, bem como as unidades de sonicação multi-amostra VialTweeter e UIP400MTP para o seu trabalho diário de preparação de amostras em laboratórios biológicos, bioquímicos, médicos e clínicos. Com o software inteligente e o controlo de temperatura dos processadores Hielscher, a temperatura é controlada de forma fiável e a degradação da amostra induzida pelo calor é evitada. A preparação de amostras por ultra-sons com soluções de ultra-sons Hielscher proporciona resultados altamente fiáveis e reprodutíveis!
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A Hielscher Ultrasonics fabrica homogeneizadores ultra-sónicos de alto desempenho para aplicações de mistura, dispersão, emulsificação e extração à escala laboratorial, piloto e industrial.
Literatura / Referências
- Brandy Verhalen , Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed. Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
Fatos, vale a pena conhecer
Que tipos de ELISA existem?
Existem vários tipos de ELISA, que se distinguem pelo seu princípio de funcionamento. São conhecidos como ELISA direto, ELISA indireto, ELISA em sanduíche, ELISA competitivo e ELISA inverso. De seguida, apresentamos uma visão geral sobre os vários tipos de ELISA e as suas principais caraterísticas e diferenças.
O teste ELISA pode ser efectuado num formato qualitativo ou quantitativo. Os resultados qualitativos fornecem um simples resultado positivo ou negativo, enquanto que no ELISA quantitativo a densidade ótica (DO) da amostra é comparada com uma curva padrão, que é normalmente uma diluição em série de uma solução de concentração conhecida da molécula alvo.
ELISA direto
O ELISA direto é a forma de ensaio mais simples do Elisa, em que apenas é utilizado um anticorpo primário marcado com enzima e não são necessários anticorpos secundários. O anticorpo primário marcado com enzima liga-se diretamente ao alvo, ou seja, ao antigénio. A solução tamponada de antigénio é adicionada a cada poço de uma placa de microtitulação (geralmente placas de 96 poços, placas ELISA), onde adere à superfície de plástico através de interações de carga. Quando a enzima ligada ao anticorpo primário reage com o seu substrato, produz um sinal visível que pode ser medido através de um espetrofotómetro, fluorómetro ou luminómetro.
ELISA indireto
Para o teste ELISA indireto, são necessários um anticorpo primário e um anticorpo secundário. No entanto, ao contrário do ELISA direto, não é o anticorpo primário, mas o anticorpo secundário que é marcado com uma enzima. O antigénio é imobilizado na placa de poços e ligado ao anticorpo primário. Subsequentemente, o anticorpo secundário marcado com enzima liga-se ao anticorpo primário. Finalmente, a enzima ligada ao anticorpo secundário reage com o seu substrato para produzir um sinal visível que pode ser detectado.
ELISA em sanduíche
Enquanto nos testes ELISA diretos e indirectos, o antigénio é imobilizado e revestido na superfície da placa de poços, no ELISA em sanduíche o anticorpo é imobilizado na superfície de plástico da placa ELISA. Os anticorpos imobilizados no ELISA em sanduíche são conhecidos como anticorpos de captura. Para além dos anticorpos de captura, no ELISA em sanduíche também são necessários os chamados anticorpos de deteção. Os anticorpos de deteção incluem um anticorpo de deteção primário não marcado e um anticorpo de deteção secundário marcado com enzima.
Passo a passo, o antigénio de interesse liga-se ao anticorpo de captura imobilizado na placa. Em seguida, o anticorpo de deteção primário liga-se ao antigénio. Posteriormente, o anticorpo de deteção secundário liga-se ao anticorpo de deteção primário. No passo final da reação, a enzima reage com o seu substrato para produzir um sinal visível que pode ser detectado opticamente.
ELISA competitivo
O ELISA competitivo, também conhecido como ELISA de inibição, é o tipo de ELISA mais complexo, porque envolve a utilização de um antigénio inibidor. Cada um dos três formatos, ELISA direto, indireto e em sanduíche, pode ser adaptado ao formato ELISA competitivo. No ELISA competitivo, o antigénio inibidor e o antigénio de interesse competem pela ligação ao anticorpo primário.
No ELISA competitivo, o anticorpo não marcado é incubado na presença do seu antigénio, ou seja, da amostra. Estes complexos anticorpo/antigénio ligados são então adicionados a um poço revestido com antigénio.
A placa é lavada, para que os anticorpos não ligados sejam removidos. O nome ELISA competitivo deve-se ao facto de que quanto mais antigénio houver na amostra, mais complexos antigénio-anticorpo se formam. Isto significa que há menos anticorpos não ligados disponíveis para se ligarem ao antigénio no poço e os antigénios têm de competir por um anticorpo disponível. É adicionado um anticorpo secundário, correspondente ao anticorpo primário. Este segundo anticorpo está ligado à enzima. Quando o substrato é adicionado, as enzimas restantes produzem um sinal cromogénico ou fluorescente.
Neste ponto, a reação é interrompida para evitar a eventual saturação do sinal.
Alguns kits ELISA competitivos incluem um antigénio ligado a uma enzima em vez de um anticorpo ligado a uma enzima. O antigénio marcado compete pelos locais de ligação do anticorpo primário com o antigénio da amostra (não marcado). Quanto menos antigénio houver na amostra, mais antigénio marcado é retido no poço e mais forte é o sinal.
ELISA inverso
O ELISA inverso não utiliza placas com poços, mas deixa os antigénios suspensos no fluido de teste. O teste ELISA inverso mede a quantidade de anticorpos ligados através do antigénio. Foi desenvolvido especificamente para detetar e investigar a proteína do envelope do vírus do Nilo Ocidental e a forma como esta é capaz de encontrar anticorpos específicos do vírus.
Que marcadores enzimáticos são utilizados no ELISA?
A lista que se segue apresenta os marcadores enzimáticos mais comuns utilizados nos ensaios ELISA, que permitem medir os resultados do ensaio após a sua conclusão.
- O OPD (dicloridrato de o-fenilenodiamina) torna-se âmbar para detetar a HRP (peroxidase de rábano), que é frequentemente utilizada como uma proteína conjugada.
- TMB (3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina) torna-se azul quando detecta a HRP e torna-se amarelo após a adição de ácido sulfúrico ou fosfórico.
- ABTS (2,2′-Azinobis [ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico]-sal de diamónio) torna-se verde ao detetar a HRP.
- O PNPP (p-Nitrofenil Fosfato, Sal Dissódico) fica amarelo quando se detecta a fosfatase alcalina.