Preparação de amostras ultrassônicas para ensaios ELISA

Ensaios como o ELISA são amplamente utilizados para diagnóstico in vitro, detecção de proteínas relacionadas a doenças e controle de qualidade (por exemplo, monitoramento de alérgenos alimentares). A preparação ultrassônica de amostras é uma técnica rápida, confiável e reprodutível para lisar células e isolar proteínas intracelulares, DNA, RNA e organelas. A Hielscher Ultrasonics oferece várias soluções ultrassônicas para a preparação conveniente de amostras únicas, vários frascos, bem como para placas de microtitulação e placas de 96 poços.

ELISA – Ensaio de imunoabsorção enzimática

ELISA significa ensaio imunoenzimático e é uma técnica de análise bioquímica amplamente utilizada na categoria de ensaios de ligação a ligantes. No ELISA, uma amostra líquida é adicionada a uma fase sólida estacionária com propriedades especiais de ligação. Normalmente, a fase sólida estacionária é aplicada como revestimento a uma placa de poço ou placa ELISA. Em seguida, vários reagentes líquidos são adicionados sequencialmente, incubados e lavados, de modo que, finalmente, ocorre uma mudança óptica (por exemplo, desenvolvimento de cor pelo produto de uma reação enzimática) no líquido final do poço. A mudança óptica permite medir a quantidade do analito por um chamado quantitativo “leitura". Para a leitura quantitativa, um espectrofotômetro, fluorômetro ou luminômetro é usado para detectar e medir a intensidade da luz transmitida. A sensibilidade de detecção é influenciada pela amplificação do sinal durante as reações analíticas. Como as reações enzimáticas são processos de amplificação bem investigados e confiáveis, as enzimas são usadas para criar o sinal. As enzimas estão ligadas aos reagentes de detecção em proporções fixas para permitir uma quantificação precisa, o que explica também o nome ensaio de imunoabsorção "ligado a enzimas".
Como os ensaios ELISA são realizados em placas de microtitulação / placas de 96 poços, é conhecido como técnica de ensaio baseado em placas e é usado, por exemplo, em diagnósticos clínicos in vitro, pesquisa, desenvolvimento de medicamentos, etc., para detectar e quantificar anticorpos, peptídeos, proteínas e hormônios.
A técnica ELISA é frequentemente usada como uma ferramenta de diagnóstico em medicina, biotecnologia, fitopatologia e também é uma importante medida de controle de qualidade em vários setores.

Preparação ultrassônica da amostra antes de ELISA

Antes que o ensaio ELISA possa ser realizado, as amostras requerem etapas de preparação, como lise celular e extração de proteínas intracelulares, DNA, RNA, etc. A vantagem da lise celular ultrassônica e do isolamento de proteínas é sua alta eficiência, confiabilidade e reprodutibilidade. Todos esses fatores são importantes para obter diagnósticos e resultados de pesquisa de alta qualidade

Protocolo para lise celular ultrassônica pré-ELISA

• Para culturas de células: Antes da lise celular ultrassônica, centrifugue as células por 5 minutos a 270 x g em uma microcentrífuga. Remova o sobrenadante por aspiração e ressuspenda as células em 30 a 100 μL de tampão RIPA. Em seguida, incube o pellet celular no gelo por 30 min.
• Agora, a amostra da célula está pronta para lise ultrassônica:
  Use um ultrassônico do tipo sonda (por exemplo, UP200Ht com sonda S26d2) ou um dispositivo ultrassônico multi-amostra (por exemplo, VialTweeter para sonicação simultânea de até 10 frascos ou o UIP400MPT para placas de microtitulação / placas de 96 poços), dependendo da quantidade de amostras que você precisa preparar.
  Para a sonicação do tipo sonda de uma única amostra, coloque as células em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
• Pré-defina sua duração ultrassônica, entrada total de energia, modo de ciclo e/ou limites de temperatura no menu digital do ultrassomizador. Isso garante sonicação e repetibilidade altamente confiáveis.
• Insira o sonotrodo e ligue o dispositivo ultrassônico. Mova suavemente a microponta da sonda ultrassônica através da amostra para sonicar a amostra uniformemente.
  Para a maioria das células, a lise ultrassônica será concluída após 2 a 4 ciclos de sonicação de 10 segundos.
• Após a sonicação, remova o sonotrodo da amostra. As amostras devem ser incubadas em gelo por 5 min. Em seguida, centrifugue a 10.000 x g por 20 min para peletar os detritos. Transferir os sobrenadantes para um novo tubo de microcentrífuga. Rotular os analitos e conservá-los a -20 °C.
• O sonotrodo ultrassônico pode ser limpo limpando-o adequadamente com álcool ou sonicado em um béquer cheio de álcool, por exemplo, etanol a 70%. Todas as sondas ultrassônicas feitas de titânio são autoclaváveis.

• Enxágue o tecido com PBS gelado (0,01M, pH = 7,4) para remover completamente o excesso de sangue de hemólise.
• Pese o tecido (rim, coração, pulmão, baço, etc.) e macere-o em pequenos pedaços, que são homogeneizados em PBS. O volume de PBS necessário está relacionado ao peso do tecido. Como regra geral, 1g de tecido requer aprox. 9mL de PBS. Recomenda-se adicionar algum inibidor de protease ao PBS. (RIPA ou tampão de lise hipotônico contendo protease e coquetel inibidor de fosfatase pode ser usado alternativamente.)
• Dependendo do tamanho do tecido, um tratamento de vórtice curto (aprox. 1-2 min. em pulsos de 15 segundos) pode ser útil para pré-tratar o tecido.
• Monte uma micro-ponta, por exemplo, S26d2, em seu ultrassom. Coloque o tubo de amostra com o tecido em um banho de gelo.
• Sonicate a amostra com seu ultrassônico, por exemplo, UP200St (amplitude de 80%) por 1 min. no modo de pulso (15 segundos ligado, 15 segundos de pausa). Manter a amostra no banho de gelo.
• Os homogeneizados são então centrifugados para obter pools específicos (citosólicos, nucleares, mitocondriais ou lisossômicos) para enriquecer a proteína para análise. Centrifugando a amostra durante 5 minutos a 5000× g, recupera-se o sobrenadante.

Controle de temperatura confiável durante a sonicação

A temperatura é um fator crucial que influencia o processo e é especialmente importante para o tratamento de amostras biológicas, por exemplo, para evitar a degradação térmica de proteínas. Como todas as técnicas mecânicas de preparação de amostras, a sonicação cria calor. No entanto, a temperatura das amostras pode ser bem controlada ao usar os dispositivos Hielscher Ultrasonics. Apresentamos várias opções para monitorar e controlar a temperatura de suas amostras enquanto as preparamos com o ultrassônico tipo sonda ou o VialTweeter pré-analiticamente.

1. Monitoramento da temperatura da amostra: Todos os processadores ultrassônicos digitais Hielscher são equipados com um software inteligente e um sensor de temperatura conectável. Conecte o sensor de temperatura ao dispositivo ultrassônico (por exemplo, UP200Ht, UP200St, VialTweeter, UIP400MTP) e insira a ponta do sensor de temperatura em um dos tubos de amostra. Através do ecrã tátil digital colorido, pode definir no menu do processador ultrassónico uma gama de temperaturas específica para a sonicação da sua amostra. O ultrassônico irá parar automaticamente quando a temperatura máxima for atingida e pausar até que a temperatura da amostra caia para o valor mais baixo da temperatura definida ∆. Em seguida, a sonicação começa automaticamente novamente. Esse recurso inteligente evita a degradação induzida pelo calor.
2. Em relação à unidade ultrassônica de várias amostras VialTweeter, o bloco de titânio, que contém os tubos de amostra, pode ser pré-resfriado. Coloque o bloco VialTweeter (apenas o sonotrodo sem transdutor!) na geladeira ou freezer para pré-resfriar o bloco de titânio ajuda a adiar o aumento da temperatura na amostra. Se possível, a própria amostra também pode ser pré-resfriada.
3. Use um banho de gelo ou gelo seco para esfriar durante a sonicação. Coloque o(s) tubo(s) de amostra durante a sonicação em um banho de gelo. Para o VialTweeter, use uma bandeja rasa cheia de gelo seco e coloque o VialTweeter no gelo seco para que o calor possa se dissipar rapidamente.

Clientes em todo o mundo usam os ultrassonicadores de sonda Hielscher, bem como as unidades de sonicação multi-amostra VialTweeter e UIP400MTP para seu trabalho diário de preparação de amostras em laboratórios biológicos, bioquímicos, médicos e clínicos. O software inteligente e o controle de temperatura dos processadores Hielscher, a temperatura é controlada de forma confiável e a degradação da amostra induzida pelo calor é evitada. A preparação ultrassônica de amostras com soluções ultrassônicas Hielscher oferece resultados altamente confiáveis e reprodutíveis!