Preparação de amostra ultrassônica para ensaios ELISA

Elisa – Ensaio imunosorbente ligado à enzima

ELISA significa ensaio imunossorbente ligado à enzima e é uma técnica de análise bioquímica amplamente utilizada da categoria de ensaios de ligação de ligantes. Em ELISA, uma amostra líquida é adicionada em uma fase sólida estacionária com propriedades de ligação especiais. Normalmente, a fase sólida estacionária é aplicada como revestimento em uma placa de poço ou placa ELISA. Em seguida, vários reagentes líquidos são adicionados sequencialmente, incubados e lavados, de modo que finalmente uma mudança óptica (por exemplo, desenvolvimento de cores pelo produto de uma reação enzimática) ocorre no líquido final no poço. A mudança óptica permite medir a quantidade do analito por um chamado quantitativo “lendo". Para a leitura quantitativa, um espectrofotômetro, fluorômetro ou luminômetro é usado para detectar e medir a intensidade da luz transmitida. A sensibilidade da detecção é influenciada pela amplificação do sinal durante as reações analíticas. Uma vez que as reações enzimáticas são bem investigadas e processos de amplificação confiáveis, enzimas são usadas para criar o sinal. As enzimas estão ligadas aos reagentes de detecção em proporções fixas para permitir quantificação precisa, o que explica também o nome de ensaio imunossorbente "ligado à enzima".
Como os ensaios ELISA são realizados em placas de microtídeos / placas de 96 poços, é conhecido como técnica de ensaio à base de placas e é usado, por exemplo, em diagnóstico in vitro clínico, pesquisa, desenvolvimento de medicamentos etc. para detectar e quantificar anticorpos, peptídeos, proteínas e hormônios.
A técnica ELISA é frequentemente utilizada como ferramenta de diagnóstico em medicina, biotecnologia, patologia vegetal e também é uma importante medição de controle de qualidade em várias indústrias.

Preparação de amostra ultrassônica antes de ELISA

Antes que o ensaio ELISA possa ser realizado, as amostras requerem etapas de preparação, como lise celular e extração de proteínas intracelulares, DNA, RNA etc. A vantagem da lise celular ultrassônica e do isolamento de proteínas é sua alta eficiência, confiabilidade e reprodutibilidade. Todos esses fatores são importantes para obter diagnósticos de alta qualidade e resultados de pesquisa

Protocolo para Lise Celular Ultrassônica Pré-ELISA

• Para culturas celulares: Antes da lise celular ultrassônica, as células centrífugas por 5 minutos a 270 x g em uma microcentrifuagem. Remova o supernatante por aspiração e resuspend células em 30 – 100 μL de buffer RIPA. Em seguida, incubar a pelota de célula no gelo por 30 minutos.
• Agora, a amostra celular está pronta para a lise ultrassônica:
  Use um ultrassônico do tipo sonda (por exemplo. UP200Ht com sonda S26d2) ou um dispositivo ultrassônico multi-amostra (por exemplo, VialTweeter para sônica simultânea de até 10 frascos ou o UIP400MPT para placas de microtítmetro / placas de 96 poços) dependendo da quantidade de amostras que você precisa preparar.
  Para a sônica do tipo sonda de uma única amostra, coloque as células em tubos de microcentrifusagem de 1,5 mL.
• Pré-defina sua duração ultrassônica, entrada total de energia, modo de ciclo e/ou limites de temperatura no menu digital do ultrassonicator. Isso garante sônica e repetibilidade altamente confiáveis.
• Indeque o sonotrode e ligue o dispositivo ultrassônico. Mova suavemente a micro-ponta da sonda ultrassônica através da amostra para sonicar a amostra uniformemente.
  Para a maioria das células, a lise ultrassônica será concluída após 2 -4 ciclos de sonicação de 10 segundos.
• Após a sônicação, remova o sonotrode da amostra. As amostras devem ser incubadas no gelo por 5 minutos. Em seguida, centrífuga a 10.000 x g por 20 minutos para pelotar os detritos. Transfira os supernantes para um novo tubo de microcentrífuga. Rotule os analitos e armazene a -20°C.
• O sonotrode ultrassônico pode ser limpo limpando-o corretamente com álcool ou sonicato em um béquer cheio de álcool, por exemplo, 70% de etanol. Todas as sondas ultrassônicas feitas de titânio são autoclaváveis.

Para homogeneizadores de tecido:

• Enxágüe o tecido com PBS gelado (0,01M, pH=7,4) para remover completamente o excesso de sangue de hemólise.
• Pesar o tecido (rim, coração, pulmão, baço etc.) e macerá-lo em pequenos pedaços, que são homogeneizados na PBS. O volume de PBS necessário está relacionado ao peso do tecido. Como regra geral, 1g de tecido requer aproximadamente 9mL PBS. Recomenda-se adicionar algum inibidor de protease ao PBS. (Ripa ou tampão de lise hipotônica contendo protease e coquetel inibidor de fosfatase pode ser usado alternativamente.)
• Dependendo do tamanho do tecido, um tratamento curto de vórtice (aproximadamente 1-2 min. em 15 segundos. pulsos) pode ser útil para pré-tratar o tecido.
• Monte uma micro-ponta, por exemplo, S26d2, para o seu ultrassônico. Coloque o tubo de amostra com o tecido em um banho de gelo.
• Sonicar a amostra com seu ultrassônico, por exemplo, UP200St (80% de amplitude) para 1 min. no modo de pulso (15seg em diante, pausa de 15seg). Mantenha a amostra no banho de gelo.
• Os homogeneizadores são então centrifugados para obter piscinas específicas (citosolic, nuclear, mitocondrial ou lysosomal) a fim de enriquecer a proteína para análise. Centrifugando a amostra por 5 minutos a 5000×g, o supernante é recuperado.

Controle de temperatura confiável durante a sonicação

A temperatura é um fator crucial que influencia o processo que é especialmente importante para o tratamento de amostras biológicas, por exemplo, para evitar a degradação térmica das proteínas. Como todas as técnicas mecânicas de preparação de amostras, a sônica cria calor. No entanto, a temperatura das amostras pode ser bem controlada ao usar os dispositivos Hielscher Ultrasonics. Apresentamos várias opções para monitorar e controlar a temperatura de suas amostras enquanto as preparamos com o ultrassônico tipo sonda ou o VialTweeter pré-analítica.

1. Monitorando a temperatura da amostra: Todos os processadores ultrassônicos digitais Hielscher são equipados com um software inteligente e um sensor de temperatura plugável. Conecte o sensor de temperatura ao dispositivo ultrassônico (por exemplo, UP200Ht, UP200St, VialTweeter, UIP400MTP) e insira a ponta do sensor de temperatura em um dos tubos de amostra. Através do touch-display colorido digital, você pode definir no menu do processador ultrassônico uma faixa de temperatura específica para sua sônica de amostra. O ultrassonicador pára automaticamente quando a temperatura máxima for atingida e pausará até que a temperatura da amostra seja reduzida ao menor valor da temperatura definida ∆. Em seguida, a sônica começa automaticamente novamente. Este recurso inteligente evita a degradação induzida pelo calor.
2. Em relação à unidade ultrassônica de várias amostras VialTweeter, o bloco de titânio, que segura os tubos de amostra, pode ser pré-resfriado. Coloque o bloco Deserção (apenas o sonotrodo sem transdutor!) na geladeira ou no congelador para pré-resfriar o bloco de titânio ajuda a adiar o aumento da temperatura na amostra. Se possível, a amostra em si pode ser pré-resfriada também.
3. Use um banho de gelo ou gelo seco para esfriar durante a sônicação. Coloque seu tubo de amostra durante a sônica em um banho de gelo. Para o VialTweeter, use uma bandeja rasa cheia de gelo seco e coloque o VialTweeter no gelo seco para que o calor possa se dissipar rapidamente.

Os clientes em todo o mundo usam os supersonicadores hielscher, bem como as unidades de sônica multi-amostra VialTweeter e UIP400MTP para seu trabalho diário de preparação de amostras em laboratórios biológicos, bioquímicos, médicos e clínicos. O software inteligente e o controle de temperatura dos processadores Hielscher, a temperatura é confiável e a degradação da amostra induzida pelo calor evitada. A preparação de amostras ultrassônicas com soluções ultrassônicas hielscher oferece resultados altamente confiáveis e reprodutíveis!