Preparação ultrassónica de amostras para ensaios ELISA

Os ensaios como o ELISA são amplamente utilizados no diagnóstico in vitro, na deteção de proteínas associadas a doenças e no controlo de qualidade (por exemplo, na monitorização de alergénios alimentares). A preparação ultrassónica de amostras é uma técnica rápida, fiável e reprodutível para lisar células e isolar proteínas intracelulares, DNA, RNA e organelos. A Hielscher Ultrasonics oferece várias soluções ultrassónicas para a preparação prática de amostras individuais, de múltiplos frascos, bem como de placas de microtitulação e placas de 96 poços.

ELISA – Ensaio de imunoabsorção enzimática

ELISA significa ensaio de imunoabsorção enzimática e é uma técnica de análise bioquímica amplamente utilizada, pertencente à categoria dos ensaios de ligação a ligandos. No ELISA, adiciona-se uma amostra líquida a uma fase sólida estacionária com propriedades de ligação especiais. Normalmente, a fase sólida estacionária é aplicada como revestimento de uma placa de poços ou placa ELISA. Em seguida, adicionam-se sequencialmente vários reagentes líquidos, procede-se à incubação e à lavagem, de modo que, por fim, ocorre uma alteração ótica (por exemplo, o desenvolvimento de cor pelo produto de uma reação enzimática) no líquido final presente no poço. A alteração ótica permite medir a quantidade do analito através de uma chamada «leitura» quantitativa. Para a leitura quantitativa, utiliza-se um espectrofotómetro, fluorómetro ou luminómetro para detetar e medir a intensidade da luz transmitida. A sensibilidade da deteção é influenciada pela amplificação do sinal durante as reações analíticas. Uma vez que as reações enzimáticas são processos de amplificação bem estudados e fiáveis, utilizam-se enzimas para gerar o sinal. As enzimas estão ligadas aos reagentes de deteção em proporções fixas para permitir uma quantificação exata, o que também explica a designação «ligado a enzimas» do ensaio de imunoabsorção.
Como os ensaios ELISA são realizados em placas de microtitulação / placas de 96 poços, esta técnica é conhecida como uma técnica de ensaio baseada em placas e é utilizada, por exemplo, no diagnóstico clínico in vitro, na investigação, no desenvolvimento de fármacos, etc., para detetar e quantificar anticorpos, péptidos, proteínas e hormonas.
A técnica ELISA é frequentemente utilizada como ferramenta de diagnóstico em medicina, biotecnologia e fitopatologia, sendo também uma importante medida de controlo de qualidade em várias indústrias.

Preparação ultrassónica de amostras antes do ELISA

Antes de se poder realizar o ensaio ELISA, as amostras necessitam de etapas de preparação, como a lise celular e a extração de proteínas intracelulares, DNA, RNA, etc. A vantagem da lise celular ultrassónica e do isolamento de proteínas é a sua elevada eficiência, fiabilidade e reprodutibilidade. Todos estes fatores são importantes para obter diagnósticos e resultados de investigação de elevada qualidade

Protocolo de lise celular ultrassónica antes do ELISA

• Para culturas celulares: Antes da lise celular ultrassónica, centrifugue as células durante 5 min a 270 x g numa microcentrífuga. Remova o sobrenadante por aspiração e ressuspenda as células em 30 – 100 μL de tampão RIPA. Em seguida, incube o sedimento celular em gelo durante 30 min.
• A amostra celular está agora pronta para a lise ultrassónica:
  Utilize um sonicador de sonda (por exemplo, UP200Ht com sonda S26d2) ou um dispositivo ultrassónico para múltiplas amostras (por exemplo, VialTweeter para a sonicação simultânea de até 10 frascos ou o UIP400MPT para placas de microtitulação / placas de 96 poços), dependendo da quantidade de amostras que necessita de preparar.
  Para a sonicação de uma amostra individual com uma sonda, coloque as células em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
• Predefina a duração do tratamento ultrassónico, a energia total fornecida, o modo de ciclo e/ou os limites de temperatura no menu digital do sonicador. Isto garante uma sonicação altamente fiável e repetibilidade.
• Introduza o sonotrodo e ligue o dispositivo ultrassónico. Desloque suavemente a microponta da sonda ultrassónica através da amostra para a sonicar uniformemente.
  Para a maioria das células, a lise ultrassónica estará concluída após 2 – 4 ciclos de sonicação de 10 s.
• Após a sonicação, retire o sonotrodo da amostra. As amostras devem ser incubadas em gelo durante 5 min. Em seguida, centrifugue a 10 000 x g durante 20 min para sedimentar os detritos. Transfira os sobrenadantes para um novo tubo de microcentrífuga. Identifique os analitos e armazene a -20°C.
• O sonotrodo ultrassónico pode ser limpo passando-lhe cuidadosamente um pano com álcool ou por sonicação num copo de laboratório cheio de álcool, por exemplo, etanol a 70%. Todas as sondas ultrassónicas fabricadas em titânio podem ser esterilizadas em autoclave.

• Lave o tecido com PBS gelado (0,01M, pH=7,4) para remover completamente o excesso de sangue hemolisado.
• Pese o tecido (rim, coração, pulmão, baço, etc.) e macere-o em pequenos pedaços, que são homogeneizados em PBS. O volume de PBS necessário está relacionado com o peso do tecido. Como regra prática, 1g de tecido requer aproximadamente 9mL de PBS. Recomenda-se adicionar ao PBS um inibidor de proteases. (Em alternativa, pode utilizar-se RIPA ou um tampão de lise hipotónico que contenha uma mistura de inibidores de proteases e fosfatases.)
• Dependendo do tamanho do tecido, um breve tratamento com vórtex (aproximadamente 1–2 min. em impulsos de 15 s) pode ser útil para o pré-tratamento do tecido.
• Monte uma microponta, por exemplo, S26d2, no seu sonicador. Coloque o tubo de amostra com o tecido num banho de gelo.
• Sonique a amostra com o seu sonicador, por exemplo, UP200St (80% de amplitude), durante 1 min. em modo pulsado (15s ligado, 15s de pausa). Mantenha a amostra no banho de gelo.
• Os homogenatos são depois centrifugados para obter frações específicas (citosólicas, nucleares, mitocondriais ou lisossomais), a fim de enriquecer a proteína para análise. Ao centrifugar a amostra durante 5 minutos a 5000×g, recolhe-se o sobrenadante.

Controlo fiável da temperatura durante a sonicação

A temperatura é um fator crucial que influencia o processo e é especialmente importante no tratamento de amostras biológicas, por exemplo, para evitar a degradação térmica das proteínas. Tal como todas as técnicas mecânicas de preparação de amostras, a sonicação gera calor. Contudo, a temperatura das amostras pode ser bem controlada quando se utilizam os dispositivos da Hielscher Ultrasonics. Apresentamos várias opções para monitorizar e controlar a temperatura das suas amostras durante a preparação pré-analítica com um sonicador de sonda ou o VialTweeter.

1. Monitorização da temperatura da amostra: Todos os processadores ultrassónicos digitais da Hielscher estão equipados com software inteligente e um sensor de temperatura conectável. Ligue o sensor de temperatura ao dispositivo ultrassónico (por exemplo, UP200Ht, UP200St, VialTweeter, sonicador para placas de múltiplos poços UIP400MTP) e introduza a ponta do sensor de temperatura num dos tubos de amostra. Através do ecrã tátil digital a cores, pode definir, no menu do processador ultrassónico, um intervalo de temperatura específico para a sonicação da sua amostra. O sonicador para automaticamente quando se atinge a temperatura máxima e permanece em pausa até a temperatura da amostra descer para o valor inferior da temperatura ∆ definida. Em seguida, a sonicação recomeça automaticamente. Esta funcionalidade inteligente evita a degradação induzida pelo calor.
2. No caso da unidade ultrassónica para múltiplas amostras VialTweeter, o bloco de titânio que contém os tubos de amostra pode ser pré-arrefecido. Colocar o bloco VialTweeter (apenas o sonotrodo, sem o transdutor!) no frigorífico ou no congelador para pré-arrefecer o bloco de titânio ajuda a retardar o aumento da temperatura na amostra. Se possível, a própria amostra também pode ser pré-arrefecida.
3. Utilize um banho de gelo ou gelo seco para arrefecer durante a sonicação. Coloque o(s) tubo(s) de amostra num banho de gelo durante a sonicação. Para o VialTweeter, utilize um tabuleiro pouco profundo cheio de gelo seco e coloque o VialTweeter sobre o gelo seco, para que o calor se possa dissipar rapidamente.

Clientes de todo o mundo utilizam os sonicadores de sonda da Hielscher, bem como as unidades de sonicação para múltiplas amostras VialTweeter e UIP400MTP, no seu trabalho diário de preparação de amostras em laboratórios biológicos, bioquímicos, médicos e clínicos. Com o software inteligente e o controlo de temperatura dos processadores da Hielscher, a temperatura é controlada de forma fiável e evita-se a degradação das amostras induzida pelo calor. A preparação ultrassónica de amostras com as soluções ultrassónicas da Hielscher proporciona resultados altamente fiáveis e reprodutíveis!
Saiba mais sobre a sonicação com elevada capacidade de processamento utilizando o sonicador para placas de múltiplos poços UIP400MTP para ensaios!