Hielscher tecnologia de ultra-som

Preparação de amostra ultrassônica para ensaios ELISA

Ensaios como o ELISA são amplamente utilizados para diagnósticos in vitro, detecção de proteínas relacionadas a doenças e controle de qualidade (por exemplo, monitoramento de alérgenos alimentares). A preparação da amostra ultrassônica é uma técnica rápida, confiável e reprodutível para lise celular e isolar proteínas intracelulares, DNA, RNA e organelas. A Hielscher Ultrasonics oferece várias soluções ultrassônicas para a preparação conveniente de amostras únicas, frascos múltiplos, bem como para placas de microtétmetro e placas de 96 poços.

Elisa – Ensaio imunosorbente ligado à enzima

ELISA significa ensaio imunossorbente ligado à enzima e é uma técnica de análise bioquímica amplamente utilizada da categoria de ensaios de ligação de ligantes. Em ELISA, uma amostra líquida é adicionada em uma fase sólida estacionária com propriedades de ligação especiais. Normalmente, a fase sólida estacionária é aplicada como revestimento em uma placa de poço ou placa ELISA. Em seguida, vários reagentes líquidos são adicionados sequencialmente, incubados e lavados, de modo que finalmente uma mudança óptica (por exemplo, desenvolvimento de cores pelo produto de uma reação enzimática) ocorre no líquido final no poço. A mudança óptica permite medir a quantidade do analito por um chamado quantitativo “lendo". Para a leitura quantitativa, um espectrofotômetro, fluorômetro ou luminômetro é usado para detectar e medir a intensidade da luz transmitida. A sensibilidade da detecção é influenciada pela amplificação do sinal durante as reações analíticas. Uma vez que as reações enzimáticas são bem investigadas e processos de amplificação confiáveis, enzimas são usadas para criar o sinal. As enzimas estão ligadas aos reagentes de detecção em proporções fixas para permitir quantificação precisa, o que explica também o nome de ensaio imunossorbente "ligado à enzima".
Como os ensaios ELISA são realizados em placas de microtídeos / placas de 96 poços, é conhecido como técnica de ensaio à base de placas e é usado, por exemplo, em diagnóstico in vitro clínico, pesquisa, desenvolvimento de medicamentos etc. para detectar e quantificar anticorpos, peptídeos, proteínas e hormônios.
A técnica ELISA é frequentemente utilizada como ferramenta de diagnóstico em medicina, biotecnologia, patologia vegetal e também é uma importante medição de controle de qualidade em várias indústrias.

configuração VialTweeter completa: sonotrode VialTweeter pelo processador ultra-UP200St

A unidade de preparação de amostras ultrassônicas VialTweeter é usado para lise celular e extração de proteínas antes de ensaios ELISA

Pedido de informação





Preparação de amostra ultrassônica antes de ELISA

Antes que o ensaio ELISA possa ser realizado, as amostras requerem etapas de preparação, como lise celular e extração de proteínas intracelulares, DNA, RNA etc. A vantagem da lise celular ultrassônica e do isolamento de proteínas é sua alta eficiência, confiabilidade e reprodutibilidade. Todos esses fatores são importantes para obter diagnósticos de alta qualidade e resultados de pesquisa

Vantagens da Lysis Ultrassônica antes da ELISA

  • Tratamento amostral homogêneo
  • Lise completa
  • Extração completa de proteínas (por exemplo, anticorpos, DNA)
  • Adaptação ideal ao tipo celular
  • Para qualquer tamanho de amostra
  • reprodutível
  • Controlado pela temperatura
  • Protocolo automático de dados no cartão SD

Protocolo para Lise Celular Ultrassônica Pré-ELISA

Sonda de tipo insonifier UP200St para lise

  • Para culturas celulares: Antes da lise celular ultrassônica, as células centrífugas por 5 minutos a 270 x g em uma microcentrifuagem. Remova o supernatante por aspiração e resuspend células em 30 – 100 μL de buffer RIPA. Em seguida, incubar a pelota de célula no gelo por 30 minutos.
  • Agora, a amostra celular está pronta para a lise ultrassônica:
    Use um ultrassônico do tipo sonda (por exemplo. UP200Ht com sonda S26d2) ou um dispositivo ultrassônico multi-amostra (por exemplo, VialTweeter para sônica simultânea de até 10 frascos ou o UIP400MPT para placas de microtítmetro / placas de 96 poços) dependendo da quantidade de amostras que você precisa preparar.
    Para a sônica do tipo sonda de uma única amostra, coloque as células em tubos de microcentrifusagem de 1,5 mL.
  • Pré-defina sua duração ultrassônica, entrada total de energia, modo de ciclo e/ou limites de temperatura no menu digital do ultrassonicator. Isso garante sônica e repetibilidade altamente confiáveis.
  • Indeque o sonotrode e ligue o dispositivo ultrassônico. Mova suavemente a micro-ponta da sonda ultrassônica através da amostra para sonicar a amostra uniformemente.
    Para a maioria das células, a lise ultrassônica será concluída após 2 -4 ciclos de sonicação de 10 segundos.
  • Após a sônicação, remova o sonotrode da amostra. As amostras devem ser incubadas no gelo por 5 minutos. Em seguida, centrífuga a 10.000 x g por 20 minutos para pelotar os detritos. Transfira os supernantes para um novo tubo de microcentrífuga. Rotule os analitos e armazene a -20°C.
  • O sonotrode ultrassônico pode ser limpo limpando-o corretamente com álcool ou sonicato em um béquer cheio de álcool, por exemplo, 70% de etanol. Todas as sondas ultrassônicas feitas de titânio são autoclaváveis.

Para homogeneizadores de tecido:

  • Enxágüe o tecido com PBS gelado (0,01M, pH=7,4) para remover completamente o excesso de sangue de hemólise.
  • Pesar o tecido (rim, coração, pulmão, baço etc.) e macerá-lo em pequenos pedaços, que são homogeneizados na PBS. O volume de PBS necessário está relacionado ao peso do tecido. Como regra geral, 1g de tecido requer aproximadamente 9mL PBS. Recomenda-se adicionar algum inibidor de protease ao PBS. (Ripa ou tampão de lise hipotônica contendo protease e coquetel inibidor de fosfatase pode ser usado alternativamente.)
  • Dependendo do tamanho do tecido, um tratamento curto de vórtice (aproximadamente 1-2 min. em 15 segundos. pulsos) pode ser útil para pré-tratar o tecido.
  • Monte uma micro-ponta, por exemplo, S26d2, para o seu ultrassônico. Coloque o tubo de amostra com o tecido em um banho de gelo.
  • Sonicar a amostra com seu ultrassônico, por exemplo, UP200St (80% de amplitude) para 1 min. no modo de pulso (15seg em diante, pausa de 15seg). Mantenha a amostra no banho de gelo.
  • Os homogeneizadores são então centrifugados para obter piscinas específicas (citosolic, nuclear, mitocondrial ou lysosomal) a fim de enriquecer a proteína para análise. Centrifugando a amostra por 5 minutos a 5000×g, o supernante é recuperado.
O sonotrode MTP-24-8-96 tem oito sondas ultrassônicas para a sônica dos poços de placas de microtiter.

O sonotrode MTP-24-8-96 tem oito sondas ultrassônicas para a sônica dos poços de placas de microtiter.

Controle de temperatura confiável durante a sonicação

A temperatura é um fator crucial que influencia o processo que é especialmente importante para o tratamento de amostras biológicas, por exemplo, para evitar a degradação térmica das proteínas. Como todas as técnicas mecânicas de preparação de amostras, a sônica cria calor. No entanto, a temperatura das amostras pode ser bem controlada ao usar os dispositivos Hielscher Ultrasonics. Apresentamos várias opções para monitorar e controlar a temperatura de suas amostras enquanto as preparamos com o ultrassônico tipo sonda ou o VialTweeter pré-analítica.

  1. Monitorando a temperatura da amostra: Todos os processadores ultrassônicos digitais Hielscher são equipados com um software inteligente e um sensor de temperatura plugável. Conecte o sensor de temperatura ao dispositivo ultrassônico (por exemplo, UP200Ht, UP200St, VialTweeter, UIP400MTP) e insira a ponta do sensor de temperatura em um dos tubos de amostra. Através do touch-display colorido digital, você pode definir no menu do processador ultrassônico uma faixa de temperatura específica para sua sônica de amostra. O ultrassonicador pára automaticamente quando a temperatura máxima for atingida e pausará até que a temperatura da amostra seja reduzida ao menor valor da temperatura definida ∆. Em seguida, a sônica começa automaticamente novamente. Este recurso inteligente evita a degradação induzida pelo calor.
  2. Em relação à unidade ultrassônica de várias amostras VialTweeter, o bloco de titânio, que segura os tubos de amostra, pode ser pré-resfriado. Coloque o bloco Deserção (apenas o sonotrodo sem transdutor!) na geladeira ou no congelador para pré-resfriar o bloco de titânio ajuda a adiar o aumento da temperatura na amostra. Se possível, a amostra em si pode ser pré-resfriada também.
  3. Use um banho de gelo ou gelo seco para esfriar durante a sônicação. Coloque seu tubo de amostra durante a sônica em um banho de gelo. Para o VialTweeter, use uma bandeja rasa cheia de gelo seco e coloque o VialTweeter no gelo seco para que o calor possa se dissipar rapidamente.

Os clientes em todo o mundo usam os supersonicadores hielscher, bem como as unidades de sônica multi-amostra VialTweeter e UIP400MTP para seu trabalho diário de preparação de amostras em laboratórios biológicos, bioquímicos, médicos e clínicos. O software inteligente e o controle de temperatura dos processadores Hielscher, a temperatura é confiável e a degradação da amostra induzida pelo calor evitada. A preparação de amostras ultrassônicas com soluções ultrassônicas hielscher oferece resultados altamente confiáveis e reprodutíveis!

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Ultrasonic high-shear homogenizers are used in lab, bench-top, pilot and industrial processing.

A Hielscher Ultrasonics fabrica homogeneizadores ultrassônicos de alto desempenho para aplicações de mistura, dispersão, emulsificação e extração em escala laboratoria, piloto e industrial.

Literatura / Referências



Fatos, vale a pena conhecer

Tipos de ELISA

Existem vários tipos de ELISA, que se distinguem pelo seu princípio funcional. São conhecidas como ELISA direta, ELISA indireta, sanduíche ELISA, ELISA competitiva, e ELISA reversa. Abaixo, apresentamos uma visão geral sobre os vários tipos de ELISA e suas principais características e diferenças.
A ELISA pode ser executada em formato qualitativo ou quantitativo. Os resultados qualitativos fornecem um resultado positivo ou negativo simples, enquanto em ELISA quantitativa a densidade óptica (OD) da amostra é comparada a uma curva padrão, que é tipicamente uma diluição serial de uma solução de concentração conhecida da molécula alvo.

Direct ELISA

O ELISA direto é a forma de ensaio mais simples de Elisa, onde apenas um anticorpo primário rotulado por enzima é usado e anticorpos secundários não são necessários. O anticorpo primário rotulado por enzima se liga diretamente ao alvo, ou seja, antígeno. A solução de antígeno tamponado é adicionada a cada poço de uma placa de microtét (geralmente placas de 96 poços, placas ELISA), onde adere à superfície plástica através de interações de carga. Quando a enzima ligada ao anticorpo primário reage com seu substrato, produz um sinal visível que pode ser medido através de espectrofotômetro, fluorômetro ou luminômetro.

ELISA indireta

Para o teste ELISA indireto, tanto um anticorpo primário quanto um anticorpo secundário são necessários. No entanto, ao contrário do ELISA direto, não o anticorpo primário, mas o anticorpo secundário é rotulado com uma enzima. O antígeno é imobilizado na placa do poço e amarrado pelo anticorpo primário. Posteriormente, o anticorpo secundário rotulado por enzima se liga ao anticorpo primário. Finalmente, a enzima ligada ao anticorpo secundário reage com seu substrato para produzir um sinal visível que pode ser detectado.

Sanduíche ELISA

Enquanto em testes ELISA diretos e indiretos, o antígeno é imobilizado e revestido à superfície da placa do poço, no sanduíche ELISA o anticorpo é imobilizado à superfície plástica da placa ELISA. Os anticorpos imobilizados no sanduíche ELISA são conhecidos como anticorpos de captura. Além dos anticorpos de captura, no sanduíche ELISA também são necessários os chamados anticorpos de detecção. Os anticorpos de detecção incluem um anticorpo de detecção primária sem rótulo e um anticorpo de detecção secundário com etiqueta enzimética.
Stepwise, o antígeno de interesse se liga ao anticorpo de captura imobilizado à placa. Então, o anticorpo de detecção primária se liga ao antígeno. Posteriormente, o anticorpo de detecção secundária se liga ao anticorpo de detecção primária. Na etapa final de reação, a enzima reage com seu substrato para produzir um sinal visível que pode ser detectado opticamente.

ELISA competitiva

A ELISA competitiva, também conhecida como ELISA de inibição, é o tipo ELISA mais complexo porque envolve o uso de um antígeno inibidor. Cada um dos três formatos, direto, indireto e sanduíche ELISA, pode ser adaptado ao formato ELISA competitivo. Na ELISA competitiva, o antígeno inibidor e o antígeno de interesse competem pela vinculação ao anticorpo primário.
Para ELISA competitiva, o anticorpo não rotulado é incubado na presença de seu antígeno, ou seja, amostra. Estes complexos de anticorpos/antígenos ligados são então adicionados a um poço revestido de antígeno.
A placa é lavada, para que os anticorpos desvinculados sejam removidos. A ELISA competitiva tem seu nome devido ao fato de que quanto mais antígeno está na amostra, mais complexos de anticorpos de antígeno são formados. Isso significa que há menos anticorpos desvinculados disponíveis para se ligar ao antígeno no poço e os antígenos devem competir por um anticorpo disponível. Um anticorpo secundário, que corresponde ao anticorpo primário, é adicionado. Este segundo anticorpo está ligado à enzima. Quando o substrato é adicionado, as enzimas restantes produzem um sinal cromogênico ou fluorescente.
Neste ponto, a reação é interrompida para evitar a eventual saturação do sinal.
Alguns kits ELISA competitivos incluem um antígeno ligado à enzima em vez de um anticorpo ligado à enzima. O antígeno rotulado compete por locais primários de ligação de anticorpos com o antígeno amostral (sem rótulo). Quanto menos antígeno na amostra, mais o antígeno rotulado é retido no poço e mais forte o sinal.

ELISA reversa

A ELISA reversa não usa placas boas, mas deixa os antígenos suspensos no fluido de teste. O teste ELISA reverso mede a quantidade de anticorpos ligados via antígeno. Foi desenvolvido especificamente para detectar e investigar a proteína do vírus do Nilo Ocidental e como ele é capaz de encontrar anticorpos específicos do vírus.

Marcador enzimático usado para ELISA

A lista abaixo dá os marcadores enzimáticos mais comuns utilizados nos ensaios ELISA, que permitem que os resultados do ensaio sejam medidos após a conclusão.

  • OPD (o-fenilediamina dihidrocloide) transforma-se âmbar para detectar HRP (Horseradish Peroxidase), que é frequentemente usado como uma proteína conjugada.
  • TMB (3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina) fica azul ao detectar HRP e fica amarelo após a adição de ácido sulfúrico ou fosfórico.
  • ABTS (2,2′-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt) fica verde ao detectar HRP.
  • PNPP (p-Nitrophenyl Fosfato, Sal Disodium) fica amarelo ao detectar fosfattase alcalina.