Lise de células BL21 por ultrassons

As células BL21 são uma estirpe de E. coli amplamente utilizada em laboratórios de investigação, na biotecnologia e na produção industrial devido à sua capacidade de expressar proteínas com elevada eficiência. A rutura celular, a lise e a extração de proteínas por ultrassons constituem o método comum para isolar e recolher as proteínas pretendidas do interior das células BL21. O tratamento por ultrassons rompe completamente a célula e liberta todas as proteínas retidas, disponibilizando 100% da proteína.

Células BL21 para expressão de proteínas

A célula BL21 é uma estirpe bacteriana de E. coli quimicamente competente, adequada para transformação e expressão de proteínas a níveis elevados utilizando um sistema de indução T7 RNA polimerase-IPTG. As células BL21 permitem a expressão, com elevada eficiência, de proteínas de qualquer gene que esteja sob o controlo de um promotor T7. A estirpe de E. coli BL21(DE3) é uma estirpe de produção de proteínas baseada na RNA polimerase T7, combinada com vetores de expressão baseados no promotor T7, e é amplamente utilizada em laboratórios e na indústria para produzir proteínas recombinantes. Em BL21(DE3), a expressão do gene que codifica a proteína recombinante é transcrita pela RNA polimerase T7 codificada no cromossoma (T7 RNAP), que transcreve oito vezes mais depressa do que a RNAP convencional de E. coli. Isto torna a estirpe BL21(DE3) altamente eficiente e faz dela um dos sistemas celulares preferidos para a expressão de proteínas.

Protocolo de lise ultrassónica e extração de proteínas de células BL21

A lise das células BL21 é realizada sobretudo por ultrassons em combinação com lauroil sarcosinato de sódio (também conhecido como sarkosyl) como tampão de lise. As vantagens da rutura celular e da extração de proteínas por ultrassons residem na fiabilidade, na reprodutibilidade e na utilização simples, segura e rápida dos sonicadores. O protocolo abaixo fornece instruções passo a passo para a lise ultrassónica de células BL21:

• Para remover as proteínas chaperonas, os sedimentos bacterianos de BL21 foram ressuspensos em 50 ml de tampão Tris-EDTA de sódio (STE) gelado (constituído por 10 mM de Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM de EDTA, 150 mM de NaCl, suplementado com 100 mM de PMSF).
• Em seguida, adicionam-se 500 ul de lisozima (10 mg/ ml) e incubam-se as células em gelo durante 15 min.
• Posteriormente, adicionam-se 500 ul de DTT e 7 ml de sarkosyl (10% (w/v) preparado em tampão STE).
• É essencial manter todos os tampões de purificação gelados e conservar as amostras em gelo durante todo o tempo. Todas as etapas de purificação devem ser realizadas na câmara fria, se possível.



• Para a lise ultrassónica e a extração de proteínas, as amostras são sonicadas no sonicador multiamostras VialTweeter durante 4 x 30 sec a 100% de amplitude, com um intervalo de 2 min entre cada sonicação. Em alternativa, pode utilizar-se um homogeneizador ultrassónico de sonda com microponta, por exemplo, UP200Ht com S26d2 (3 x 30 sec, pausa de 2 min. entre ciclos ultrassónicos, 80% de amplitude).
• Para as etapas de purificação seguintes, as amostras devem ser mantidas em gelo ou, em alternativa, armazenadas a -80°C até ao processamento posterior.

Lise ultrassónica com controlo preciso da temperatura

O controlo preciso e fiável da temperatura é crucial ao manusear amostras biológicas. As temperaturas elevadas desencadeiam a degradação térmica das proteínas nas amostras.
Como todas as técnicas mecânicas de preparação de amostras, a sonicação gera calor. No entanto, a temperatura das amostras pode ser bem controlada ao utilizar o VialTweeter. Apresentamos várias opções para monitorizar e controlar a temperatura das suas amostras durante a preparação com o VialTweeter e o VialPress para análise.

1. Monitorização da temperatura da amostra: o processador ultrassónico UP200St, que aciona o VialTweeter, está equipado com software inteligente e um sensor de temperatura conectável. Ligue o sensor de temperatura ao UP200St e introduza a ponta do sensor de temperatura num dos tubos de amostra. Através do ecrã tátil digital a cores, pode definir no menu do UP200St um intervalo de temperatura específico para a sonicação das suas amostras. O sonicador para automaticamente quando a temperatura máxima é atingida e permanece em pausa até que a temperatura da amostra desça para o valor inferior da temperatura ∆ definida. Em seguida, a sonicação recomeça automaticamente. Esta funcionalidade inteligente evita a degradação causada pelo calor.
2. O bloco VialTweeter pode ser previamente arrefecido. Coloque o bloco VialTweeter (apenas o sonotrodo, sem transdutor!) no frigorífico ou no congelador para arrefecer previamente o bloco de titânio, o que ajuda a retardar o aumento da temperatura na amostra. Se possível, a própria amostra também pode ser previamente arrefecida.
3. Utilize gelo seco para arrefecer durante a sonicação. Utilize um tabuleiro pouco profundo cheio de gelo seco e coloque o VialTweeter sobre o gelo para que o calor se possa dissipar rapidamente.

Clientes de todo o mundo utilizam o VialTweeter e o VialPress no seu trabalho diário de preparação de amostras em laboratórios biológicos, bioquímicos, médicos e clínicos. Com o software inteligente e o controlo da temperatura do processador UP200St, a temperatura é controlada de forma fiável e evita-se a degradação das amostras causada pelo calor. A preparação ultrassónica de amostras com o VialTweeter e o VialPress proporciona resultados altamente fiáveis e reprodutíveis!
 

Encontre o disruptor ultrassónico ideal para a sua aplicação de lise

A Hielscher Ultrasonics é um fabricante com muitos anos de experiência em disruptores celulares e homogeneizadores ultrassónicos de elevado desempenho para laboratórios, sistemas de bancada e sistemas à escala industrial. A dimensão da sua cultura de células bacterianas, o seu objetivo de investigação ou de produção e o volume de células a processar por hora ou por dia são fatores essenciais para encontrar o disruptor celular ultrassónico adequado à sua aplicação.
A Hielscher Ultrasonics oferece várias soluções para a sonicação simultânea de múltiplas amostras (até 10 frascos com o VialTweeter) e de amostras em massa (ou seja, placas de microtitulação / placas ELISA com o UIP400MTP), bem como o clássico sonicador de laboratório de sonda, com diferentes níveis de potência de 50 a 400 watts, até processadores ultrassónicos totalmente industriais com até 16 000watts por unidade para rutura celular comercial e extração de proteínas na produção em grande escala. Todos os sonicadores Hielscher são construídos para funcionar 24/7/365 em plena carga. A robustez e a fiabilidade são características essenciais dos nossos dispositivos ultrassónicos.
Todos os homogeneizadores ultrassónicos digitais estão equipados com software inteligente, ecrã tátil a cores e registo automático de dados, que tornam o dispositivo ultrassónico numa ferramenta de trabalho prática em laboratórios e instalações de produção.
Indique-nos o tipo de células, o volume, a frequência e o objetivo com que precisa de processar as suas amostras biológicas. Recomendaremos o disruptor celular ultrassónico mais adequado aos requisitos do seu processo.

A tabela abaixo dá-lhe uma indicação da capacidade de processamento aproximada dos nossos sistemas ultrassónicos, desde homogeneizadores compactos de mão e sonicadores multiamostras até processadores ultrassónicos industriais para aplicações comerciais:

Bibliografia / Referências

• Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
• LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
• Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
• Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.