Lise celular de células BL21 por ultra-sons
As células BL21 são uma estirpe de E. coli que é amplamente utilizada em laboratórios de investigação, biotecnologia e produção industrial devido à sua capacidade de expressar proteínas de forma altamente eficiente. A rutura celular ultra-sónica, a lise e a extração de proteínas é o método comum para isolar e recolher as proteínas visadas do interior celular das células BL21. A ultrassonografia rompe completamente a célula e liberta todas as proteínas aprisionadas, tornando 100% da proteína disponível.
Células BL21 para expressão de proteínas
A célula BL21 é uma estirpe bacteriana de E. coli quimicamente competente, adequada para transformação e expressão proteica de alto nível utilizando um sistema de indução T7 RNA polimerase-IPTG. As células BL21 permitem a expressão proteica de alta eficiência de qualquer gene que esteja sob o controlo de um promotor T7. A estirpe de E. coli BL21(DE3) é uma estirpe de produção de proteínas baseada na polimerase de RNA T7 combinada com vectores de expressão baseados no promotor T7 e é amplamente aplicada em laboratórios e na indústria para produzir proteínas recombinantes. Na BL21(DE3), a expressão do gene que codifica a proteína recombinante é transcrita pela T7 RNA polimerase (T7 RNAP) codificada cromossomicamente, que transcreve oito vezes mais depressa do que a RNAP convencional da E. coli. Este facto torna a estirpe BL21(DE3) altamente eficiente e transforma-a num dos sistemas celulares de expressão de proteínas mais preferidos.
Protocolo para lise ultra-sónica e extração de proteínas de células BL21
A lise celular das células BL21 é realizada principalmente utilizando ultra-sons em combinação com lauroil sarcosinato de sódio (também conhecido como sarkosyl) como tampão de lise. As vantagens da rutura de células por ultra-sons e da extração de proteínas residem na fiabilidade, reprodutibilidade, bem como no funcionamento simples, seguro e rápido dos ultra-sons. O protocolo abaixo dá uma direção passo a passo para a lise ultra-sónica de células BL21:
- Para remover as proteínas da chaperona, os pellets de bactérias BL21 foram ressuspendidos em 50 ml de tampão Sodium Tris-EDTA (STE) gelado (constituído por Tris-HCL 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, NaCl 150 mM suplementado com PMSF 100 mM).
- São adicionados 500 ul de lisozima (10 mg/ml) e as células são incubadas em gelo durante 15 min.
- Em seguida, adicionam-se 500 ul de DTT e 7 ml de sarkosil (10% (p/v) em tampão STE).
- É essencial manter todos os tampões de purificação gelados e manter as amostras sempre em gelo. Todas as etapas de purificação devem ser efectuadas na câmara fria, se possível.
- Para a lise por ultra-sons e a extração de proteínas, as amostras são sonicadas no VialTweeter MultiSample Ultrasonicator durante 4 x 30 segundos a 100% de amplitude, com um intervalo de 2 minutos entre cada sonicação. Em alternativa, um homogeneizador ultrassónico do tipo sonda com micro-ponta, por exemplo UP200Ht com S26d2 (3 x 30 seg., pausa de 2 min. entre ciclos ultra-sónicos, amplitude de 80%) pode ser utilizado.
- Para outras etapas de purificação, as amostras devem ser mantidas em gelo ou, em alternativa, armazenadas a -80°C até ao processamento posterior.
Desintegrador de células ultrassónico UP200St com micro-ponta S26d2 para lise e extração de proteínas
Lise ultra-sónica sob controlo preciso da temperatura
O controlo preciso e fiável da temperatura é crucial no manuseamento de amostras biológicas. As temperaturas elevadas iniciam a degradação de proteínas induzida termicamente nas amostras.
Como todas as técnicas mecânicas de preparação de amostras, a sonicação gera calor. No entanto, a temperatura das amostras pode ser bem controlada quando se utiliza o VialTweeter. Apresentamos-lhe várias opções para monitorizar e controlar a temperatura das suas amostras enquanto as prepara para análise com o VialTweeter e o VialPress.
- Monitorização da temperatura da amostra: O processador ultrassónico UP200St, que aciona o VialTweeter, está equipado com um software inteligente e um sensor de temperatura conectável. Ligue o sensor de temperatura ao UP200St e insira a ponta do sensor de temperatura num dos tubos de amostra. Através do ecrã tátil digital colorido, pode definir no menu do UP200St um intervalo de temperatura específico para a sonicação da sua amostra. O ultrassom pára automaticamente quando a temperatura máxima é atingida e faz uma pausa até que a temperatura da amostra desça para o valor mais baixo da temperatura definida ∆. Em seguida, a sonicação recomeça automaticamente. Esta funcionalidade inteligente evita a degradação induzida pelo calor.
- O bloco VialTweeter pode ser pré-arrefecido. Colocar o bloco VialTweeter (apenas o sonotrodo sem transdutor!) no frigorífico ou no congelador para pré-arrefecer o bloco de titânio ajuda a adiar o aumento da temperatura na amostra. Se possível, a própria amostra também pode ser pré-arrefecida.
- Utilizar gelo seco para arrefecer durante a sonicação. Utilize um tabuleiro pouco profundo cheio de gelo seco e coloque o VialTweeter sobre o gelo para que o calor se possa dissipar rapidamente.
Clientes de todo o mundo utilizam o VialTweeter e o VialPress para o seu trabalho diário de preparação de amostras em laboratórios biológicos, bioquímicos, médicos e clínicos. Com o software inteligente e o controlo de temperatura do processador UP200St, a temperatura é controlada de forma fiável e a degradação da amostra induzida pelo calor é evitada. A preparação de amostras por ultra-sons com o VialTweeter e o VialPress proporciona resultados altamente fiáveis e reprodutíveis!
Encontre o disruptor ultrassónico ideal para a sua aplicação de lise
A Hielscher Ultrasonics é um fabricante experiente e de longa data de desreguladores e homogeneizadores de células ultra-sónicos de elevado desempenho para laboratórios, sistemas de bancada e sistemas à escala industrial. O tamanho da sua cultura de células bacterianas, o seu objetivo de investigação ou de produção e o volume de células a processar por hora ou por dia são factores essenciais para encontrar o disruptor de células ultrassónico adequado à sua aplicação.
A Hielscher Ultrasonics oferece várias soluções para a sonicação simultânea de amostras múltiplas (até 10 frascos com o VialTweeter) e amostras de massa (ou seja, placas de microtitulação / placas ELISA com o UIP400MTP), bem como o clássico ultrasonicador de laboratório tipo sonda com diferentes níveis de potência de 50 a 400 watts para processadores ultrassônicos totalmente industriais com até 16.000watts por unidade para rompimento de células comerciais e extração de proteínas em grande produção. Todos os ultrasonicadores Hielscher são construídos para funcionar 24 horas por dia, 7 dias por semana, 365 dias por ano, em plena carga. A robustez e a fiabilidade são caraterísticas essenciais dos nossos aparelhos de ultra-sons.
Todos os homogeneizadores ultra-sónicos digitais estão equipados com software inteligente, ecrã tátil a cores e protocolo automático de dados, o que torna o dispositivo ultrassónico numa ferramenta de trabalho conveniente em laboratórios e instalações de produção.
Diga-nos que tipo de células, que volume, com que frequência e com que objetivo tem de processar as suas amostras biológicas. Recomendar-lhe-emos o disruptor de células por ultra-sons mais adequado aos requisitos do seu processo.
O quadro seguinte dá-lhe uma indicação da capacidade de processamento aproximada dos nossos sistemas de ultra-sons, desde homogeneizadores portáteis compactos e ultrassons MultiSample até processadores industriais de ultra-sons para aplicações comerciais:
| Volume do lote | caudal | Dispositivos recomendados |
|---|---|---|
| Placas de 96 poços / microtitulação | n.d. | UIP400MTP |
| 10 frascos à 0,5 a 1,5mL | n.d. | VialTweeter em UP200St |
| 0.01 a 250mL | 5 a 100mL/min | UP50H |
| 0.01 a 500mL | 10 a 200mL/min | UP100H |
| 10 a 2000mL | 20 a 400mL/min | UP200Ht, UP400ST |
| 0.1 a 20L | 0.2 a 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 a 100L | 2 a 10L/min | UIP4000hdt |
| n.d. | 10 a 100L/min | UIP16000 |
| n.d. | maior | grupo de UIP16000 |
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Sonicador de placas UIP400MTP para a rutura de células de alto rendimento em placas de 96 poços
Ultrasonicador UP200Ht com microponta de 2 mm S26d2 para a sonicação de pequenas amostras
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Fatos, vale a pena conhecer
Bactérias Escherichia Coli
A Escherichia coli é um tipo de bactéria não formadora de esporos, Gram-negativa e caracterizada pela sua forma de bastonete reto. As bactérias E. coli estão presentes no ambiente, nos alimentos e nos intestinos dos seres humanos e dos animais. A E. coli é geralmente móvel, utilizando flagelos peritríquios, mas também existem tipos não móveis. As E. coli são os chamados organismos quimioorganotróficos facultativamente anaeróbios, o que significa que são capazes de metabolismo respiratório e fermentativo. A maioria dos tipos de E.coli são benignos e desempenham funções úteis no organismo, por exemplo, suprimir o crescimento de espécies bacterianas nocivas, sintetizar vitaminas, etc.
As células bacterianas Escherichia coli do chamado tipo B são uma categoria especial de estirpes de E.coli, que são amplamente utilizadas na investigação para investigar mecanismos como a sensibilidade a bacteriófagos ou sistemas de modificação de restrição. Além disso, as bactérias E.coli são valorizadas como um cavalo de batalha fiável para a expressão de proteínas em laboratórios de biotecnologia e ciências da vida. Por exemplo, a E.coli é utilizada para sintetizar compostos como proteínas e oligossacáridos à escala industrial. Devido a caraterísticas específicas, como a deficiência de proteases, a baixa produção de acetato a um nível elevado de glucose e a maior permeabilidade, as células B de E. coli são as células hospedeiras mais frequentemente utilizadas para a produção de proteínas geneticamente modificadas.
Proteína Recombinante
As proteínas recombinantes (rProt) estão a ganhar uma importância significativa em vários ramos, incluindo na produção química, farmacêutica, cosmética, medicina humana e animal, agricultura, alimentação e tratamento de resíduos.
A produção de proteínas recombinantes requer a utilização de um sistema de expressão. Como sistemas celulares de expressão para a produção de ADN recombinante, podem ser utilizadas células procarióticas e eucarióticas. Embora as células bacterianas sejam as mais utilizadas para a expressão de proteínas, devido a factores como o baixo custo, a fácil escalabilidade e a simplicidade das condições do meio, os sistemas de mamíferos, leveduras, algas, insectos e sistemas sem células são alternativas estabelecidas. O tipo de proteína, a atividade funcional, bem como o rendimento necessário da proteína expressa influenciam a seleção do sistema celular utilizado para a expressão de proteínas.
Para exprimir uma proteína recombinante, uma determinada célula deve ser transfectada com um vetor de ADN que contenha o modelo de ADN recombinante. As células transfectadas com o modelo são então cultivadas. Como consequência do mecanismo celular, as células transcrevem e traduzem a proteína de interesse, produzindo assim a proteína-alvo.
Como as proteínas expressas estão presas na matriz celular, a célula tem de ser lisada (rompida e quebrada) para libertar as proteínas. Numa fase subsequente de purificação, a proteína é separada e purificada.
A primeira proteína recombinante utilizada num tratamento foi a insulina humana recombinante, em 1982. Atualmente, são produzidos em todo o mundo mais de 170 tipos de proteínas recombinantes para tratamentos médicos. As proteínas recombinantes mais utilizadas em medicina são, por exemplo, as hormonas recombinantes, os interferões, as interleucinas, os factores de crescimento, os factores de necrose tumoral, os factores de coagulação do sangue, os medicamentos trombolíticos e as enzimas para o tratamento de doenças graves como a diabetes, nanismo, enfarte do miocárdio, insuficiência cardíaca congestiva, apoplexia cerebral, esclerose múltipla, neutropenia, trombocitopenia, anemia, hepatite, artrite reumatoide, asma, doença de Crohn e terapias contra o cancro. (cf. Phuc V. Pham, em Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)
Literatura / Referências
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
Sonicador VialTweeter para a sonicação simultânea de 10 amostras, por exemplo, para romper células BL21
Ultrassom de alto desempenho! A gama de produtos da Hielscher abrange todo o espectro, desde o ultrasonicator de laboratório compacto sobre unidades de bancada até sistemas ultrassônicos totalmente industriais.