Lise celular de células BL21 por ultrassom
As células BL21 são uma cepa de E. coli amplamente utilizada em laboratórios de pesquisa, biotecnologia e produção industrial devido à sua capacidade de expressar proteínas altamente eficientes. A ruptura celular ultrassônica, lise e extração de proteínas é o método comum para isolar e coletar as proteínas-alvo do interior celular das células BL21. A ultrassonografia interrompe completamente a célula e libera todas as proteínas aprisionadas, disponibilizando 100% da proteína.
Células BL21 para expressão de proteínas
A célula BL21 é uma cepa bacteriana de E. coli quimicamente competente, adequada para transformação e expressão proteica de alto nível usando um sistema de indução T7 RNA polimerase-IPTG. As células BL21 permitem a expressão proteica de alta eficiência de qualquer gene que esteja sob o controle de um promotor T7. A cepa de E. coli BL21 (DE3) é uma cepa de produção de proteínas à base de RNA polimerase T7 combinada com vetores de expressão baseados em promotores T7 e é amplamente aplicada em laboratórios e na indústria para produzir proteínas recombinantes. Em BL21(DE3), a expressão do gene que codifica a proteína recombinante é transcrita pela RNA polimerase T7 codificada cromossomicamente (T7 RNAP), que transcreve oito vezes mais rápido que a E. coli RNAP convencional. Isso torna a cepa BL21 (DE3) altamente eficiente e a transforma em um dos sistemas celulares de expressão de proteínas mais preferidos.
Protocolo para Lise Ultrassônica e Extração de Proteínas de Células BL21
A lise celular de células BL21 é realizada principalmente usando ultrassom em combinação com lauroil sarcosinato de sódio (também conhecido como sarkosyl) como tampão de lise. As vantagens da ruptura celular ultrassônica e da extração de proteínas residem na confiabilidade, reprodutibilidade, bem como na operação simples, segura e rápida dos ultrassônicos. O protocolo abaixo fornece uma direção passo a passo para a lise celular ultrassônica BL21:
- Para remover as proteínas chaperonas, os pellets bacterianos BL21 foram ressuspensos em 50 ml de tampão Tris-EDTA de sódio (STE) gelado (consistindo em 10 mM de Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM de EDTA, 150 mM de NaCl suplementado com 100 mM de PMSF).
- Adicionam-se 500 ul de lisozima (10 mg/ml) e as células são incubadas em gelo durante 15 min.
- Em seguida, adicionam-se 500 ul de TDT e 7 ml de sarkosyl (10% (p/v) constituídos em tampão STE).
- É essencial manter todos os tampões de purificação gelados e manter as amostras no gelo o tempo todo. Todas as etapas de purificação devem ser realizadas na câmara fria, se possível.
- Para lise ultrassônica e extração de proteínas, as amostras são sonicadas no Ultrassônico VialTweeter MultiSample por 4 x 30 segundos a 100% de amplitude com um intervalo de 2 minutos entre cada sonicação. Alternativamente, um homogeneizador ultrassônico tipo sonda com microponta, por exemplo, UP200Ht com S26d2 (3 x 30 seg, 2 min. pausa entre ciclos ultrassônicos, 80% de amplitude) pode ser usado.
- Para outras etapas de purificação, as amostras devem ser mantidas no gelo ou, alternativamente, armazenadas a -80 ° C até processamento posterior.
Disruptor de célula ultrassônico UP200St com micro-ponta S26d2 para lise e extração de proteínas
Lise ultrassônica sob controle de temperatura Prescise
O controle preciso e confiável da temperatura é crucial ao manusear amostras biológicas. Altas temperaturas iniciam a degradação de proteínas induzida termicamente nas amostras.
Como todas as técnicas mecânicas de preparação de amostras, a sonicação cria calor. No entanto, a temperatura das amostras pode ser bem controlada ao usar o VialTweeter. Apresentamos-lhe várias opções para monitorizar e controlar a temperatura das suas amostras enquanto as prepara com o VialTweeter e o VialPress para análise.
- Monitoramento da temperatura da amostra: O processador ultrassônico UP200St, que aciona o VialTweeter, está equipado com um software inteligente e um sensor de temperatura conectável. Conecte o sensor de temperatura no UP200St e insira a ponta do sensor de temperatura em um dos tubos de amostra. Através do ecrã tátil digital colorido, pode definir no menu do UP200St uma gama de temperaturas específica para a sonicação da sua amostra. O ultrassônico irá parar automaticamente quando a temperatura máxima for atingida e pausar até que a temperatura da amostra caia para o valor mais baixo da temperatura definida ∆. Em seguida, a sonicação começa automaticamente novamente. Esse recurso inteligente evita a degradação induzida pelo calor.
- O bloco VialTweeter pode ser pré-resfriado. Coloque o bloco VialTweeter (apenas o sonotrodo sem transdutor!) na geladeira ou freezer para pré-resfriar o bloco de titânio ajuda a adiar o aumento da temperatura na amostra. Se possível, a própria amostra também pode ser pré-resfriada.
- Use gelo seco para esfriar durante a sonicação. Use uma bandeja rasa cheia de gelo seco e coloque o VialTweeter no gelo para que o calor possa se dissipar rapidamente.
Clientes em todo o mundo usam o VialTweeter e o VialPress para seu trabalho diário de preparação de amostras em laboratórios biológicos, bioquímicos, médicos e clínicos. O software inteligente e o controle de temperatura do processador UP200St, a temperatura é controlada de forma confiável e a degradação da amostra induzida pelo calor é evitada. A preparação ultrassônica de amostras com o VialTweeter e o VialPress oferece resultados altamente confiáveis e reprodutíveis!
Encontre o disruptor ultrassônico ideal para sua aplicação de lise
A Hielscher Ultrasonics é um fabricante experiente de longa data de desreguladores e homogeneizadores de células ultrassônicas de alto desempenho para laboratórios, sistemas de bancada e em escala industrial. O tamanho da cultura de células bacterianas, sua meta de pesquisa ou produção e o volume de células a serem processadas por hora ou dia são fatores essenciais para encontrar o disruptor de células ultrassônico certo para sua aplicação.
A Hielscher Ultrasonics oferece várias soluções para a sonicação simultânea de amostras múltiplas (até 10 frascos com o VialTweeter) e amostras de massa (ou seja, placas de microtitulação / placas ELISA com o UIP400MTP), bem como o clássico ultrassônico de laboratório tipo sonda com diferentes níveis de potência de 50 a 400 watts para processadores ultrassônicos totalmente industriais com até 16.000 watts por unidade para ruptura celular comercial e extração de proteínas em grande produção. Todos os ultrasonicadores Hielscher são construídos para a operação 24/7/365 sob carga total. Robustez e confiabilidade são características centrais de nossos dispositivos ultrassônicos.
Todos os homogeneizadores ultrassônicos digitais são equipados com software inteligente, display sensível ao toque colorido e protocolo automático de dados, o que torna o dispositivo ultrassônico uma ferramenta de trabalho conveniente em laboratórios e instalações de produção.
Deixe-nos saber, que tipo de células, que volume, com que frequência e com que alvo você tem para processar suas amostras biológicas. Recomendaremos o disruptor de célula ultrassônico mais adequado para seus requisitos de processo.
A tabela abaixo fornece uma indicação da capacidade de processamento aproximada de nossos sistemas ultrassônicos, desde homogeneizadores portáteis compactos e ultrassônicos MultiSample até processadores ultrassônicos industriais para aplicações comerciais:
| Volume do lote | Vazão | Dispositivos recomendados |
|---|---|---|
| Placas de 96 poços / microtitulação | n.a. | UIP400MTP |
| 10 frascos para injetáveis à 0,5 a 1,5mL | n.a. | VialTweeter em UP200St |
| 00,01 a 250mL | 5 a 100mL/min | UP50H |
| 00,01 a 500mL | 10 a 200mL/min | UP100H |
| 10 a 2000mL | 20 a 400mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 a 20L | 0.2 a 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 a 100L | 2 a 10L/min | UIP4000hdT |
| n.a. | 10 a 100L/min | UIP16000 |
| n.a. | maior | cluster de UIP16000 |
Entre em contato conosco! / Pergunte-nos!
Sonicador de placas UIP400MTP para ruptura celular de alto rendimento em placas de 96 poços
ultrassonicador UP200Ht com microponta S26d2 de 2 mm para a sonicação de pequenas amostras
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Fatos, vale a pena conhecer
Bactéria Escherichia coli
Escherichia coli é um tipo de bactéria, que não é formadora de esporos, Gram-negativa e é caracterizada por sua forma de bastonete reto. A bactéria E.coli está presente no meio ambiente, alimentos e intestinos de humanos e animais. E. coli é geralmente móvel usando flagelos peritricosos, mas também existem tipos imóveis. E.coli são os chamados organismos quimioorganotróficos anaeróbicos facultativos, o que significa que são capazes de metabolismo respiratório e fermentativo. A maioria dos tipos de E.coli são benignos e desempenham funções úteis no corpo, por exemplo, suprimir o crescimento de espécies bacterianas nocivas, sintetizar vitaminas, etc.
As células da bactéria Escherichia coli do chamado tipo B são uma categoria especial de cepas de E.coli, amplamente utilizadas em pesquisas para investigar mecanismos como sensibilidade a bacteriófagos ou sistemas de modificação de restrição. Além disso, as bactérias E.coli são valorizadas como um cavalo de batalha confiável para a expressão de proteínas em laboratórios de biotecnologia e ciências da vida. Por exemplo, E.coli são usados para sintetizar compostos como proteínas e oligossacarídeos em escala industrial. Devido a características específicas, como deficiência de protease, baixa produção de acetato em alto nível de glicose e permeabilidade aumentada, as células B de E. coli são as células hospedeiras mais frequentemente usadas para a produção de proteínas geneticamente modificadas.
Proteína Recombinante
As proteínas recombinantes (rProt) estão ganhando importância significativa em vários ramos, inclusive na produção química, farmacêutica, cosmética, medicina humana e animal, agricultura, alimentos e indústrias de tratamento de resíduos.
A produção de proteína recombinante requer o uso de um sistema de expressão. Como sistemas celulares expressores para a produção de DNA recombinante, podem ser utilizadas células procarióticas e eucarióticas. Enquanto as células bacterianas são mais amplamente utilizadas para a expressão de proteínas devido a fatores como baixo custo, fácil escalabilidade e condições de meio simples, sistemas livres de mamíferos, leveduras, algas, insetos e células são alternativas estabelecidas. O tipo de proteína, a atividade funcional, bem como o rendimento necessário da proteína expressa influenciam a seleção do sistema celular usado para a expressão da proteína.
Para expressar a proteína recombinante, uma célula específica deve ser transfectada com um vetor de DNA contendo o molde de DNA recombinante. As células transfectadas com o molde são então cultivadas. Como consequência do mecanismo celular, as células transcrevem e traduzem a proteína de interesse, produzindo assim a proteína alvo.
Como as proteínas expressas são aprisionadas na matriz celular, a célula deve ser lisada (interrompida e quebrada) para liberar as proteínas. Em uma etapa de purificação subsequente, a proteína é separada e purificada.
A primeira proteína recombinante usada no tratamento foi a insulina humana recombinante em 1982. Hoje, mais de 170 tipos de proteína recombinante são produzidos em todo o mundo para tratamentos médicos. As proteínas recombinantes comumente usadas na medicina são, por exemplo, hormônios recombinantes, interferons, interleucinas, fatores de crescimento, fatores de necrose tumoral, fatores de coagulação do sangue, drogas trombolíticas e enzimas para o tratamento de doenças importantes, como diabetes, nanismo, infarto do miocárdio, insuficiência cardíaca congestiva, apoplexia cerebral, esclerose múltipla, neutropenia, trombocitopenia, anemia, hepatite, artrite reumatóide, asma, doença de Crohn e terapias contra o câncer. (cf. Phuc V. Pham, em Tecnologias Ômicas e Bioengenharia, 2018)
Literatura / Referências
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
Sinalizador VialTweeter para a sonicação simultânea de 10 amostras, por exemplo, para interromper células BL21
Ultrassom de alto desempenho! A linha de produtos da Hielscher cobre todo o espectro, desde o ultrassônico compacto de laboratório, passando por unidades de bancada, até sistemas ultrassônicos totalmente industriais.