Protocolo para Inativação do Coronavírus SARS-CoV-2 com Sonicação

O Hielscher VialTweeter é uma unidade ultrassônica exclusiva de preparação de várias amostras, usada para inativar o coronavírus SARS-COV-2. O VialTweeter permite preparar até 10 frascos de amostra simultaneamente e, portanto, é a unidade ideal para o processamento de amostras em massa.

Inativação do coronavírus SARS-CoV-2 com o VialTweeter

Após a remoção do fixador, as monocamadas foram lavadas três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) antes de raspar as células em 1mL MEM/5% FBS e sonicadas (3 × 10 segundos ligado, 10 segundos desligado a 100% de potência e amplitude) usando o processador ultrassônico Hielscher UP200St com VialTweeter anexo. Os sobrenadantes foram clarificados por centrifugação a 3000 × g por 10 minutos. 

Leia o protocolo completo aqui para a inativação do coronavírus SARS-CoV-2 por Welch et al. (2020) abaixo:

Células e vírus

As células Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) foram cultivados em meio essencial mínimo de Eagle modificado (MEM) suplementado com 10% (v/v) de soro fetal de bezerro (FCS). O vírus utilizado foi a cepa SARS-CoV-2 hCOV-19/England/2/2020, isolada por PHE do primeiro cluster de pacientes no Reino Unido em 29/01/2020. Este vírus foi obtido na passagem 1 e usado para estudos de inativação na passagem 2 ou 3.
Para reagentes e produtos químicos usados para a inativação do SARS-CoV-2, bem como a remoção da citotoxicidade do reagente, consulte o relatório científico de Welch et al. (2020).

Inativação do vírus por detergentes – Protocolo de inativação do coronavírus SARS-CoV-2 por Welch et al. 2020

Inativação do SARS-CoV-2

Para produtos comerciais, preparações de vírus (fluido de cultura de tecidos, títulos variando de 1 × 10⁶ a 1 × 10⁸ PFU/ml) foram tratados em triplicata com reagentes nas concentrações e nos tempos de contacto recomendados nas instruções de utilização dos fabricantes, quando disponíveis, ou nas concentrações e tempos especificamente solicitados pelos laboratórios de ensaio. Nos casos em que o fabricante indicou uma gama de concentrações, foi ensaiada a menor proporção de produto para amostra (ou seja, a concentração mais baixa recomendada do produto em estudo). Os reagentes do tubo de transporte de amostras foram testados usando uma proporção de um volume de fluido de cultura de tecidos para dez volumes de reagente, a menos que uma proporção de volume de fluido de amostra para reagente tenha sido especificada pelo fabricante. Detergentes, fixadores e solventes foram testados nas concentrações indicadas para os tempos indicados. Todas as etapas de inativação foram realizadas à temperatura ambiente (18 – 25°C). Para testes de tipos de amostra alternativos, o vírus foi cravado na matriz de amostra indicada na proporção de 1:9 e, em seguida, tratado com reagentes de teste como acima. Todos os experimentos incluíram amostras de controle triplicado tratadas simuladamente com um volume equivalente de PBS no lugar do reagente de teste. Imediatamente após o tempo de contato necessário, 1mL de amostra tratada foi processada usando a matriz de filtração apropriadamente selecionada. A remoção de reagentes para testes de inativação foi realizada em um formato de coluna de centrifugação maior usando as colunas de centrifugação de remoção de detergente Pierce 4mL (Thermo Fisher) ou preenchendo colunas centrífugas vazias com capacidade de 10mL (Thermo Fisher) com SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR ou Sephadex LH-20 para dar 4mL de grânulos/resina embalados. Para purificação usando filtros Amicon, amostras de 2 × 500μl foram purificadas usando dois filtros centrífugos pelo método descrito anteriormente e, em seguida, agrupadas. Para remoção de formaldeído e formaldeído com glutaraldeído, foi utilizado um filtro com 1× volume de amostra de 500μl, ressuspenso após processamento em 500μl de PBS e adicionado a 400ul MEM/5% FBS. Para inativação de infectados monocamadas, 12,5 cm² Frascos de células Vero E6 (2,5 × 10⁶ células/frasco em 2,5mL MEM/5% FBS) foram infectados em MOI 0,001 e incubados a 37°C/5% CO₂ por 24 horas. O sobrenadante foi removido e as células fixadas com 5mL de formaldeído, ou formaldeído e glutaraldeído em temperatura ambiente por 15 ou 60 minutos. O fixador foi removido e as monocamadas lavadas três vezes com PBS antes de raspar as células em 1mL MEM/5% FBS e sonicadas (3 × 10 segundos ligado, 10 segundos desligado a 100% de potência e amplitude) usando um UP200St com acessório VialTweeter (Hielscher Ultrasound Technology). Os sobrenadantes foram clarificados por centrifugação a 3000 × g por 10 minutos.

Detalhes do reagente usado para a inativação do coronavírus SARS-CoV-2 com o VialTweeter ultrassônico de acordo com o protocolo de Welch et al. 2020

O protocolo completo, incluindo o uso do Hielscher VialTweeter, pode ser encontrado aqui:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Sofisticados desincorporadores ultrassônicos e disruptores celulares

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