Hielscher tecnologia de ultra-som

Protocolo para inativação do Coronavírus SARS-CoV-2 com sonicação

O Hielscher VialTweeter é uma unidade de preparação ultrassônica de multi-amostra única, que é usada para inativar o coronavírus SARS-COV-2. O VialTweeter permite preparar até 10 frascos de amostra simultaneamente e é, portanto, a unidade ideal para o processamento de amostras em massa.

Inativação do Coronavírus SARS-CoV-2 com o VialTweeter

Depois de remover o fixador, as monocamadas foram lavadas três vezes com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) antes de raspar células em 1mL MEM/5% FBS e sonicadas (3 × 10 segundos em diante, 10 segundos de desconto a 100% de potência e amplitude) usando o processador ultrassônico Hielscher UP200St com VialTweeter Anexo. Os supernantes foram esclarecidos por centrifugação a 3000 × g por 10 minutos. 

Leia o protocolo completo aqui para a inativação do coronavírus SARS-CoV-2 por Welch et al. (2020) abaixo:

Células e Vírus

Células Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) foram cultivados no meio essencial mínimo (MEM) modificado da Águia, complementado com 10% (v/v) soro de bezerro fetal (FCS). O vírus utilizado foi sars-cov-2 cepa hCOV-19/England/2/2020, isolado pela EPS do primeiro grupo de pacientes no Reino Unido em 29/01/2020. Este vírus foi obtido na passagem 1 e utilizado para estudos de inativação na passagem 2 ou 3.
Para reagentes e produtos químicos utilizados para a inativação SARS-CoV-2, bem como a remoção da citotoxicidade do reagente, consulte o relatório científico de Welch et al. (2020).

The ultrasonic sample preparation unit VialTweeter is used for the inactivation of SARS-CoV-2 coronavirus

Inativação de vírus por detergentes – Protocolo de inativação do Coronavírus SARS-CoV-2 por Welch et al. 2020

Inativação SARS-CoV-2

Para produtos comerciais, preparações de vírus (fluido de cultura tecidual, titers variando de 1 × 106 a 1 × 108 PFU/ml) foram tratados em triplicado com reagentes em concentrações e para os horários de contato recomendados nas instruções de uso dos fabricantes, quando disponíveis, ou para concentrações e horários especificamente solicitados pelos laboratórios de testes. Quando uma série de concentrações foi dada pelo fabricante, a menor razão entre o produto e a amostra foi testada (ou seja, menor concentração recomendada do produto de teste). Os reagentes do tubo de transporte da amostra foram testados utilizando uma razão de um volume de fluido de cultura tecidual para dez volumes de reagente, a menos que uma razão de volume de fluido amostral para reagente foi especificada pelo fabricante. Detergentes, fixativos e solventes foram testados nas concentrações indicadas para os horários indicados. Todas as etapas de inativação foram realizadas à temperatura ambiente (18 – 25°C). Para testes de tipos de amostras alternativas, o vírus foi cravado na matriz amostral indicada em uma razão de 1:9, depois tratado com reagentes de teste como acima. Todos os experimentos incluíram amostras tratadas com controle de triplicado com um volume equivalente de PBS no lugar do reagente de teste. Imediatamente após o tempo de contato necessário, 1mL da amostra tratada foi processado utilizando-se a matriz de filtração devidamente selecionada. A remoção de reagentes para testes de inativação foi realizada em um formato de coluna de spin maior usando colunas de spin de remoção de detergente Pierce 4mL (Thermo Fisher), ou preenchendo colunas vazias de centrífugas de capacidade Pierce 10mL (Thermo Fisher) com Bio-Contas SM2, S-400HR sephacril ou Sephadex LH-20 para dar contas de 4mL/resina. Para purificação utilizando filtros Amicon, 2 × amostras de 500μl foram purificadas usando dois filtros centrífugas pelo método descrito anteriormente e, em seguida, agrupadas. Para formaldeído e formaldeído com remoção de glutaraldeído, foi utilizado um filtro com volume amostral de 1× 500μl, resuspended após o processamento em PBS de 500μl, e adicionado a 400ul MEM/5% FBS. Para inativação de infectados VialTweeter at the ultrasonic processor UP200STmonocamadas, 12,5 cm2 frascos de células Vero E6 (2,5 × 106 células/frascos em 2,5mL MEM/5% FBS) foram infectados em MOI 0,001 e incubados a 37°C/5% CO2 por 24 horas. Supernante foi removido, e células fixadas usando 5mL de formaldeído, ou formaldeído e glutaraldeído à temperatura ambiente por 15 ou 60 minutos. O fixador foi removido, e as monocamadas lavadas três vezes com PBS antes de raspar células em 1mL MEM/5% FBS e sonicated (3 × 10 segundos em diante, 10 segundos de desconto a 100% de potência e amplitude) usando um UP200St com acessório VialTweeter (Hielscher Ultrasound Technology). Os supernantes foram esclarecidos por centrifugação a 3000 × g por 10 minutos.

VialTweeter para o sonication intenso de frascos fechados

Frascol para a Sonicação Intensa de Frascos Fechados

Pedido de informação





Various reagents have been tested for the inactivation of the SARS-CoV-2 coronavirus using the ultrasonic sample prep unit VialTweeter.

Detalhes do reagente usado para inativação do coronavírus SARS-CoV-2 com o VialTweeter ultrassônico de acordo com o protocolo de Welch et al. 2020

O protocolo completo, incluindo o uso do Hielscher VialTweeter pode ser encontrado aqui:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

The multi-sample ultrasonicator VialTweeter allows for simultaneous sample preparation of up to 10 vials under same process conditions. The VialTweeter is an established ultrasonic device used for the inactivation of corona virus SARS-CoV-2 (Click to enlarge!)

VialTweeter para inativação do vírus ultrassônico

Vantagens da VialTweeter em resumo

  • Sonicação de até 10 frascos simultaneamente
  • Sem contaminação cruzada
  • Nenhuma perda de amostra
  • Registro automático de dados
  • Fácil e seguro para operar
O VialTweeter também é usado para

  • Lise celular
  • Interrupção de partículas virais
  • Extração de ácido nucleico: isolamento dna/RNA
  • Fragmentação de DNA/RNA
  • Solubilização de Lysate
  • Dismembradores ultrassônicos sofisticados e disruptores celulares

    O ultrassonador multi-amostra VialTweeter é apenas uma das muitas soluções ultrassônicas para preparação de amostras em laboratórios biológicos, bioquímicos e clínicos. Hielscher Ultrasonics oferece o dismembrador ultrassônico ideal para sua aplicação, por exemplo, lise celular, extração celular, homogeneização de tecidos, solubilização de lise, dissolução, desgaseamento de amostra etc.
    Deixe-nos saber quantas amostras você tem que processar por hora e dia, se você preferir sônica direta ou indireta e qual é o alvo do tratamento da amostra ultrassônica. Recomendaremos a unidade ultrassônica mais adequada para sua rotina diária de trabalho!
    Os processadores ultrassônicos digitais da Hielscher Ultrasonics são equipados com software inteligente, gravação automática de dados, opções fáceis de pré-configuração para controle de temperatura, duração de sônica, modo ciclo/pulso, bem como iluminação de amostras e controle remoto do navegador. Nós nos esforçamos para tornar nossos dispositivos ultrassônicos o mais inteligente possível para que sua rotina de pesquisa e trabalho se torne o mais conveniente e bem sucedido possível.
    Clique aqui, para encontrar mais aplicações, incluindo protocolos de preparação de amostras ultrassônicas com o VialTweeter!

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    Ultrasonic high-shear homogenizers are used in lab, bench-top, pilot and industrial processing.

    A Hielscher Ultrasonics fabrica homogeneizadores ultrassônicos de alto desempenho para aplicações de mistura, dispersão, emulsificação e extração em escala laboratoria, piloto e industrial.

    Literatura / Referências



    Fatos, vale a pena conhecer

    O que são Vero Cells?

    Vero E6, também conhecido como Vero C1008 (ATCC No. CRL-1586) é uma linha de células clones do Vero 76 e é usada na pesquisa de coronavírus SARS-CoV e SARS-CoV-2. Células vero são uma linhagem de células usadas em culturas celulares. O 'Vero’ a linhagem foi isolada das células epiteliais renais extraídas de um macaco verde africano (Chlorocebus sp.).
    As células Vero E6 mostram alguma inibição de contato, por isso são adequadas para propagar vírus que se replicam lentamente. As linhas celulares Vero E6 são comumente usadas para investigar a citopatologia dos coronavírus SARS-CoV e SARS-CoV-2, pois as células vero (células renais de macaco verde africano) exibem uma expressão abundante de receptores enzimáticos convertidos por angiotensina 2 (ACE2). Os receptores ACE2 são um dos principais acoplamentos para o coronavírus SARS-CoV-2.
    Por exemplo, Ogando et al. (2020) descobriram que SARS-CoV-2 – em comparação com sars-cov – gerou níveis mais elevados de RNA viral intracelular, mas surpreendentemente cerca de 50 vezes menos progêneria viral infecciosa foi recuperada do meio de cultura. Além disso, eles determinaram que a sensibilidade dos dois vírus a três inibidores estabelecidos da replicação do coronavírus (Remdesivir, Alisporivir e cloroquina) é muito semelhante, mas que a infecção pelo SARS-CoV-2 era substancialmente mais sensível ao pré-tratamento de células com interferon alfa películado. Uma diferença importante entre os dois vírus é o fato de que – ao passar em células Vero E6 – Sars-CoV-2 aparentemente está sob forte pressão de seleção para adquirir mutações adaptativas em seu gene de proteína de pico. Essas mutações alteram ou excluem um "site de decotes putinoso" na região que conecta os domínios S1 e S2 e resultam em uma mudança fenotípica muito proeminente nos ensaios da placa.