Protocolo para inativação do Coronavírus SARS-CoV-2 com sonicação

O Hielscher VialTweeter é uma unidade de preparação ultrassônica de multi-amostra única, que é usada para inativar o coronavírus SARS-COV-2. O VialTweeter permite preparar até 10 frascos de amostra simultaneamente e é, portanto, a unidade ideal para o processamento de amostras em massa.

Inativação do Coronavírus SARS-CoV-2 com o VialTweeter

Depois de remover o fixador, as monocamadas foram lavadas três vezes com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) antes de raspar células em 1mL MEM/5% FBS e sonicadas (3 × 10 segundos em diante, 10 segundos de desconto a 100% de potência e amplitude) usando o processador ultrassônico Hielscher UP200St com VialTweeter Anexo. Os supernantes foram esclarecidos por centrifugação a 3000 × g por 10 minutos. 

Leia o protocolo completo aqui para a inativação do coronavírus SARS-CoV-2 por Welch et al. (2020) abaixo:

Células e Vírus

Células Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) foram cultivados no meio essencial mínimo (MEM) modificado da Águia, complementado com 10% (v/v) soro de bezerro fetal (FCS). O vírus utilizado foi sars-cov-2 cepa hCOV-19/England/2/2020, isolado pela EPS do primeiro grupo de pacientes no Reino Unido em 29/01/2020. Este vírus foi obtido na passagem 1 e utilizado para estudos de inativação na passagem 2 ou 3.
Para reagentes e produtos químicos utilizados para a inativação SARS-CoV-2, bem como a remoção da citotoxicidade do reagente, consulte o relatório científico de Welch et al. (2020).

Inativação de vírus por detergentes – Protocolo de inativação do Coronavírus SARS-CoV-2 por Welch et al. 2020

Inativação SARS-CoV-2

Para produtos comerciais, preparações de vírus (fluido de cultura tecidual, titers variando de 1 × 10⁶ a 1 × 10⁸ PFU/ml) foram tratados em triplicado com reagentes em concentrações e para os horários de contato recomendados nas instruções de uso dos fabricantes, quando disponíveis, ou para concentrações e horários especificamente solicitados pelos laboratórios de testes. Quando uma série de concentrações foi dada pelo fabricante, a menor razão entre o produto e a amostra foi testada (ou seja, menor concentração recomendada do produto de teste). Os reagentes do tubo de transporte da amostra foram testados utilizando uma razão de um volume de fluido de cultura tecidual para dez volumes de reagente, a menos que uma razão de volume de fluido amostral para reagente foi especificada pelo fabricante. Detergentes, fixativos e solventes foram testados nas concentrações indicadas para os horários indicados. Todas as etapas de inativação foram realizadas à temperatura ambiente (18 – 25°C). Para testes de tipos de amostras alternativas, o vírus foi cravado na matriz amostral indicada em uma razão de 1:9, depois tratado com reagentes de teste como acima. Todos os experimentos incluíram amostras tratadas com controle de triplicado com um volume equivalente de PBS no lugar do reagente de teste. Imediatamente após o tempo de contato necessário, 1mL da amostra tratada foi processado utilizando-se a matriz de filtração devidamente selecionada. A remoção de reagentes para testes de inativação foi realizada em um formato de coluna de spin maior usando colunas de spin de remoção de detergente Pierce 4mL (Thermo Fisher), ou preenchendo colunas vazias de centrífugas de capacidade Pierce 10mL (Thermo Fisher) com Bio-Contas SM2, S-400HR sephacril ou Sephadex LH-20 para dar contas de 4mL/resina. Para purificação utilizando filtros Amicon, 2 × amostras de 500μl foram purificadas usando dois filtros centrífugas pelo método descrito anteriormente e, em seguida, agrupadas. Para formaldeído e formaldeído com remoção de glutaraldeído, foi utilizado um filtro com volume amostral de 1× 500μl, resuspended após o processamento em PBS de 500μl, e adicionado a 400ul MEM/5% FBS. Para inativação de infectados monocamadas, 12,5 cm² frascos de células Vero E6 (2,5 × 10⁶ células/frascos em 2,5mL MEM/5% FBS) foram infectados em MOI 0,001 e incubados a 37°C/5% CO₂ por 24 horas. Supernante foi removido, e células fixadas usando 5mL de formaldeído, ou formaldeído e glutaraldeído à temperatura ambiente por 15 ou 60 minutos. O fixador foi removido, e as monocamadas lavadas três vezes com PBS antes de raspar células em 1mL MEM/5% FBS e sonicated (3 × 10 segundos em diante, 10 segundos de desconto a 100% de potência e amplitude) usando um UP200St com acessório VialTweeter (Hielscher Ultrasound Technology). Os supernantes foram esclarecidos por centrifugação a 3000 × g por 10 minutos.

Detalhes do reagente usado para inativação do coronavírus SARS-CoV-2 com o VialTweeter ultrassônico de acordo com o protocolo de Welch et al. 2020

O protocolo completo, incluindo o uso do Hielscher VialTweeter pode ser encontrado aqui:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

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