Protocolo de Inativação do Coronavírus SARS-CoV-2 por Sonicação

O VialTweeter da Hielscher é uma unidade ultra-sónica única de preparação de múltiplas amostras, utilizada para inativar o coronavírus SARS-COV-2. O VialTweeter permite preparar até 10 frascos de amostras em simultâneo, sendo assim a unidade ideal para o processamento de amostras em massa.

Inativação do Coronavírus SARS-CoV-2 com o VialTweeter

Após a remoção do fixador, as monocamadas foram lavadas três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) antes de se rasparem as células para 1 ml de MEM/5% FBS e de se proceder à sonicação (3 × 10 segundos ligado, 10 segundos desligado a 100% de potência e amplitude) utilizando o processador ultrassónico Hielscher UP200St com VialTweeter fixação. Os sobrenadantes foram clarificados por centrifugação a 3000 × g durante 10 minutos. Leia aqui o protocolo completo para a inativação do coronavírus SARS-CoV-2 por Welch et al. (2020) abaixo:

Células e vírus

As células Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) foram cultivadas em meio essencial mínimo de Eagle modificado (MEM) suplementado com 10% (v/v) de soro fetal de vitelo (FCS). O vírus utilizado foi a estirpe hCOV-19/England/2/2020 do SARS-CoV-2, isolada pela PHE do primeiro grupo de doentes no Reino Unido em 29/01/2020. Este vírus foi obtido na passagem 1 e utilizado para estudos de inativação na passagem 2 ou 3.
Para conhecer os reagentes e os produtos químicos utilizados na inativação do SARS-CoV-2, bem como a remoção da citotoxicidade dos reagentes, consultar o relatório científico de Welch et al. (2020).

Inativação de vírus por detergentes – Protocolo de inativação do coronavírus SARS-CoV-2 por Welch et al. 2020

Inativação do SARS-CoV-2

Para os produtos comerciais, as preparações de vírus (fluido de cultura de tecidos, títulos que variam de 1 × 10⁶ a 1 × 10⁸ PFU/ml) foram tratados em triplicado com reagentes nas concentrações e nos tempos de contacto recomendados nas instruções de utilização dos fabricantes, quando disponíveis, ou nas concentrações e tempos especificamente solicitados pelos laboratórios de ensaio. Nos casos em que o fabricante indicou uma gama de concentrações, foi testado o rácio mais baixo entre o produto e a amostra (ou seja, a concentração mais baixa recomendada do produto de ensaio). Os reagentes dos tubos de transporte de amostras foram testados utilizando um rácio de um volume de fluido de cultura de tecidos para dez volumes de reagente, a menos que o fabricante tenha especificado um rácio de volume de fluido de amostra para reagente. Os detergentes, fixadores e solventes foram testados nas concentrações indicadas durante os tempos indicados. Todas as etapas de inativação foram realizadas à temperatura ambiente (18 - 25°C). Para testar tipos de amostras alternativos, o vírus foi adicionado à matriz da amostra indicada numa proporção de 1:9 e depois tratado com reagentes de teste como acima indicado. Todas as experiências incluíram amostras triplicadas de controlo simulado tratadas com um volume equivalente de PBS em vez do reagente de ensaio. Imediatamente após o tempo de contacto necessário, 1mL de amostra tratada foi processado utilizando a matriz de filtração adequadamente selecionada. A remoção do reagente para o ensaio de inativação foi efectuada num formato de coluna de centrifugação maior, utilizando Colunas de Centrifugação de Remoção de Detergentes Pierce 4mL (Thermo Fisher), ou enchendo colunas de centrifugação Pierce vazias de 10mL de capacidade (Thermo Fisher) com SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR ou Sephadex LH-20 para obter 4mL de esferas/resina embaladas. Para a purificação utilizando filtros Amicon, purificaram-se 2 × 500μl de amostras utilizando dois filtros centrífugos segundo o método descrito anteriormente e, em seguida, agruparam-se. Para a remoção do formaldeído e do formaldeído com glutaraldeído, foi utilizado um filtro com um volume de amostra de 1 × 500 μl, ressuspendido após o processamento em 500 μl de PBS e adicionado a 400 μl de MEM/5% FBS. Para a inativação de células infectadas monocamadas, 12,5 cm² frascos de células Vero E6 (2,5 × 10⁶ células/flasco em 2,5mL MEM/5% FBS) foram infectadas com MOI 0,001 e incubadas a 37°C/5% CO₂ durante 24 horas. O sobrenadante foi removido e as células fixadas com 5 ml de formaldeído ou formaldeído e glutaraldeído à temperatura ambiente durante 15 ou 60 minutos. O fixador foi removido e as monocamadas foram lavadas três vezes com PBS antes de as células serem raspadas para 1 ml de MEM/5% FBS e submetidas a ultra-sons (3 × 10 segundos ligado, 10 segundos desligado a 100% de potência e amplitude) utilizando um UP200St com acessório VialTweeter (Hielscher Ultrasound Technology). Os sobrenadantes foram clarificados por centrifugação a 3000 × g durante 10 minutos.

Pormenores do reagente utilizado para a inativação do coronavírus SARS-CoV-2 com o VialTweeter ultrassónico, de acordo com o protocolo de Welch et al. 2020

O protocolo completo, incluindo a utilização do Hielscher VialTweeter, pode ser consultado aqui:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Desmembradores ultra-sónicos e disruptores celulares sofisticados

O ultrasonicator multi-amostra VialTweeter é apenas uma das muitas soluções ultra-sônicas para a preparação de amostras em laboratórios biológicos, bioquímicos e clínicos. A Hielscher Ultrasonics oferece o desmembrador ultrassónico ideal para a sua aplicação, por exemplo, lise celular, extração de células, homogeneização de tecidos, solubilização de lisados, dissolução, desgaseificação de amostras, etc.
Diga-nos quantas amostras tem de processar por hora e por dia, se prefere a sonicação direta ou indireta e qual o objetivo do tratamento ultrassónico da amostra. Iremos recomendar-lhe a unidade de ultra-sons mais adequada para a sua rotina de trabalho diária!
Os processadores ultra-sónicos digitais da Hielscher Ultrasonics estão equipados com software inteligente, gravação automática de dados, opções fáceis de pré-configuração para controlo da temperatura, duração da sonicação, modo de ciclo/pulso, bem como iluminação da amostra e controlo remoto do navegador. Esforçamo-nos por tornar os nossos dispositivos ultra-sónicos tão inteligentes quanto possível, para que a sua rotina de investigação e trabalho se torne tão conveniente e bem sucedida quanto possível.
Clique aqui para encontrar mais aplicações, incluindo protocolos de preparação de amostras por ultra-sons com o VialTweeter!