Protocolo de inativação do coronavírus SARS-CoV-2 por sonicação

O Hielscher VialTweeter é uma unidade ultrassónica única para a preparação de múltiplas amostras, utilizada para inativar o coronavírus SARS-COV-2. O VialTweeter permite preparar até 10 frascos de amostras simultaneamente, sendo assim a unidade ideal para o processamento de amostras em massa.

Inativação do coronavírus SARS-CoV-2 com o VialTweeter

Após a remoção do fixador, as monocamadas foram lavadas três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS), antes de se recolherem as células por raspagem para 1mL de MEM/5% FBS e de se proceder à sonicação (3 × 10 segundos de funcionamento, 10 segundos de pausa, com potência e amplitude a 100%), utilizando o processador ultrassónico Hielscher UP200St com VialTweeter como acessório. Os sobrenadantes foram clarificados por centrifugação a 3000 × g durante 10 minutos. Leia abaixo o protocolo completo de Welch et al. (2020) para a inativação do coronavírus SARS-CoV-2:

Células e vírus

As células Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) foram cultivadas em meio essencial mínimo de Eagle modificado (MEM), suplementado com 10% (v/v) de soro fetal de vitelo (FCS). O vírus utilizado foi a estirpe hCOV-19/England/2/2020 de SARS-CoV-2, isolada pela PHE a partir do primeiro grupo de doentes no Reino Unido, em 29/01/2020. Este vírus foi obtido na passagem 1 e utilizado nos estudos de inativação na passagem 2 ou 3.
Para informações sobre os reagentes e produtos químicos utilizados na inativação do SARS-CoV-2, bem como sobre a remoção da citotoxicidade dos reagentes, consulte o relatório científico de Welch et al. (2020).

Inativação de vírus por detergentes – Protocolo de inativação do coronavírus SARS-CoV-2 de Welch et al. 2020

Inativação do SARS-CoV-2


No caso dos produtos comerciais, as preparações virais (líquido de cultura de tecidos, com títulos entre 1 × 10⁶ e 1 × 10⁸ PFU/ml) foram tratadas em triplicado com reagentes nas concentrações e durante os tempos de contacto recomendados nas instruções de utilização do fabricante, quando disponíveis, ou nas concentrações e durante os tempos especificamente solicitados pelos laboratórios de ensaio. Quando o fabricante indicava um intervalo de concentrações, foi testada a menor proporção de produto em relação à amostra (ou seja, a menor concentração recomendada do produto em ensaio). Os reagentes dos tubos de transporte de amostras foram testados utilizando uma proporção de um volume de líquido de cultura de tecidos para dez volumes de reagente, salvo quando o fabricante especificava uma proporção volumétrica entre o líquido da amostra e o reagente. Os detergentes, fixadores e solventes foram testados nas concentrações indicadas e durante os tempos indicados. Todas as etapas de inativação foram realizadas à temperatura ambiente (18 – 25°C). Para testar tipos alternativos de amostras, o vírus foi adicionado à matriz de amostra indicada numa proporção de 1:9, sendo depois tratado com os reagentes em ensaio conforme descrito acima. Todas as experiências incluíram amostras de controlo em triplicado submetidas a um tratamento simulado, com um volume equivalente de PBS em substituição do reagente em ensaio. Imediatamente após o tempo de contacto necessário, 1mL de amostra tratada foi processado utilizando a matriz de filtração adequadamente selecionada. A remoção dos reagentes para os ensaios de inativação foi realizada num formato de coluna de centrifugação de maior dimensão, utilizando Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher), ou enchendo colunas de centrifugação Pierce vazias com capacidade de 10mL (Thermo Fisher) com SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR ou Sephadex LH-20, de modo a obter 4mL de esferas/resina compactadas. Para a purificação com filtros Amicon, 2 × 500μl de amostras foram purificados utilizando dois filtros de centrifugação pelo método anteriormente descrito e depois reunidos. Para a remoção de formaldeído e de formaldeído com glutaraldeído, foi utilizado um filtro com um volume de amostra de 1× 500μl; após o processamento, a amostra foi ressuspensa em 500μl de PBS e adicionada a 400ul de MEM/5% FBS. Para a inativação de monocamadas infetadas, frascos de 12,5 cm² de células Vero E6 (2,5 × 10⁶ células/frasco em 2,5mL de MEM/5% FBS) foram infetados com uma MOI de 0,001 e incubados a 37°C/5% CO₂ durante 24 horas. O sobrenadante foi removido e as células foram fixadas utilizando 5mL de formaldeído, ou de formaldeído e glutaraldeído, à temperatura ambiente durante 15 ou 60 minutos. O fixador foi removido e as monocamadas foram lavadas três vezes com PBS, antes de se recolherem as células por raspagem para 1mL de MEM/5% FBS e de se proceder à sonicação (3 × 10 segundos de funcionamento, 10 segundos de pausa, com potência e amplitude a 100%), utilizando um UP200St com o acessório VialTweeter (Hielscher Ultrasound Technology). Os sobrenadantes foram clarificados por centrifugação a 3000 × g durante 10 minutos.


Pormenores do reagente utilizado na inativação do coronavírus SARS-CoV-2 com o VialTweeter ultrassónico, segundo o protocolo de Welch et al. 2020

O protocolo completo, incluindo a utilização do Hielscher VialTweeter, encontra-se aqui:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Desintegradores ultrassónicos e dispositivos de rutura celular sofisticados

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