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Lise ultrassônica de amostras de Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster é amplamente utilizada em laboratórios como organismo modelo. Portanto, etapas de preparação pré-analítica, como lise, ruptura celular, extração de proteínas e cisalhamento de DNA de amostras de Drosophila melanogaster, devem ser realizadas com frequência. Os desmembradores ultrassônicos são confiáveis e eficientes e podem ser usados para executar várias tarefas, como lise, extração de proteínas ou fragmentação de DNA com facilidade, ajustando apenas os parâmetros do processo ultrassônico. Os homogeneizadores ultrassônicos são, portanto, ferramentas flexíveis com uma ampla gama de aplicações.

Lise ultrassônica e extração de proteínas

Drosophila melanogaster é amplamente utilizado como organismo modelo em laboratórios biológicos. Encontre aqui protocolos para lise, extração de proteínas e cisalhamento de DNA de amostras de D. melanogaster.Lise, solubilização celular, homogeneização de tecidos e extração de proteínas são tarefas típicas para desmembradores ultrassônicos em laboratórios biológicos. Desmagnetizadores ultrassônicos e disruptores celulares são adequados para homogeneizar tecidos animais, insetos (por exemplo, Drosophila melanogaster, C. elegans) ou espécimes de plantas. As aplicações subsequentes da ultrassonografia são a lise de suspensões celulares e pellets, bem como a extração de proteínas intracelulares.
A lise ultrassônica e a extração de proteínas são processos altamente confiáveis e reprodutíveis, que podem ser realizados com base em protocolos estabelecidos. Como a intensidade do processo ultrassônico pode ser ajustada exatamente por meio de parâmetros de sonicação, como amplitude, modo de ciclo / pulso, temperatura e volume da amostra, uma vez que os protocolos comprovados podem ser repetidos com o mesmo resultado indefinidamente.

Vantagens da preparação ultrassônica da amostra

  • Altamente eficiente
  • Ajustável ao material específico da amostra
  • Adequado para qualquer volume
  • tratamento não térmico
  • Resultados reprodutíveis
  • Simples e seguro

Fragmentação ultrassônica de DNA e RNA

Após a lise celular e a extração de proteínas, uma etapa comum necessária na preparação da amostra é o cisalhamento e a fragmentação de DNA, RNA e cromatina, por exemplo, antes da imunoprecipitação da cromatina (ChIP). A fragmentação de DNA e RNA pode ser alcançada de forma confiável quebrando as ligações covalentes que mantêm o DNA unido por forças físicas. Usando cisalhamento físico, como sonicação, primeiro as fitas de DNA são quebradas, depois o DNA é fragmentado em pedaços menores.
A fragmentação ultrassônica do DNA é confiável e eficiente no cisalhamento do DNA em um comprimento alvo, por exemplo, 500bp (pares de bases). As principais vantagens da fragmentação ultrassônica de DNA incluem o controle preciso dos parâmetros e intensidade do processo ultrassônico. Os parâmetros do processo ultrassônico podem ser ajustados ajustando a intensidade, os ciclos e o tempo de sonicação com precisão. Isso torna possível criar os tamanhos de DNA desejados e o comprimento de DNA desejado pode ser produzido e reproduzido de forma confiável. O cisalhamento ultrassônico do ADN é igualmente ideal criar fragmentos do ADN do peso molecular alto.

Ultrasonicator UP200Ht com microponta S26d2 para lise ultrassônica de amostras de Drosophila

ultrassonicador UP200Ht microtip S26d2 de 2 mm para a sonicação de amostras de Drosophila

Pedido de Informação







Protocolos para lise ultrassônica de Drosophila melanogaster

Abaixo você pode encontrar vários protocolos para lise assistida por ultrassom, extração de proteínas e fragmentação de DNA ou cromatina de amostras de Drosophila.

Lise ultrassônica para ensaio de imunoprecipitação de reticulação (CLIP)

O ensaio CLIP foi realizado conforme relatado anteriormente com algumas modificações. Aproximadamente 20 mg de ovários de fêmeas do tipo selvagem de 0 a 1 dia de idade foram reticulados por UV (3 × 2000 μJ / cm2), homogeneizados em gelo em 1 mL de tampão RCB (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM de sacarose, 1 mM DTT, 1× inibidores completos de protease sem EDTA, 1 mM PMSF) suplementados com 300 U RNAseOUT e colocados em gelo por 30 min. O homogeneizado foi sonicado em gelo, a 80% da potência, cinco vezes em rajadas de 20 s com um descanso de 60 s entre o uso do processador ultrassônico Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) e centrifugado (16000 × g por 5 min a 4°C). O extrato solúvel foi pré-limpo com 20 μl de dynabeads de proteína-G por 20 min a 4 ° C. Após a remoção das amostras para immunoblotting e quantificação da entrada de RNA (1%), HP1 foi imunoprecipitado com anticorpo anti-HP1 9A9 de 450 μl de extrato pré-limpo por incubação por 4 h com 50 μl de dynabeads de proteína-G. Os imunoprecipitados foram lavados 4 vezes com RCB. Para eluir os RNAs imunoprecipitados, os grânulos peletizados foram fervidos em 100 μL de água tratada com DEPC UltraPure por 5 min. 900 μL de reagente de Qiazol foram adicionados ao sobrenadante recuperado para preparação de RNA. O RNA purificado foi usado como modelo para sintetizar cDNA usando oligo dT, hexâmeros aleatórios e transcriptase reversa SuperScript III de acordo com o protocolo do fabricante.
(Cassale et al. 2019)

Lise ultrassônica para ensaio de imunoprecipitação de cromatina

A imunoprecipitação da cromatina foi realizada de acordo com o método descrito por Menet com pequenas modificações. Aproximadamente 20 mg de ovários de fêmeas selvagens de 0 a 1 dia de idade foram homogeneizados em 1 mL de tampão NEB (10 mM HEPES-Na em pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na em pH 8, 0,5 mM EDTA-Na em pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM de espermidina, 0,15 mM de esperminina, 1× inibidores completos de protease sem EDTA) com um homogeneizador/dispersor de imersão 1 min (a 3000 rpm). O homogeneizado foi transferido para um copo pré-resfriado e 15 pinceladas completas foram aplicadas com um pilão apertado. Os núcleos livres foram então centrifugados a 6000xg por 10 min a 4 ° C. Os pellets contendo núcleos foram ressuspensos em 1 mL de NEB e centrifugados a 20000 × g por 20 min em gradiente de sacarose (0,65 mL de sacarose 1,6 M em NEB, 0,35 mL de sacarose 0,8 M em NEB). O pellet foi ressuspenso em 1 mL de NEB e formaldeído até uma concentração final de 1%. Os núcleos foram reticulados por 10 min à temperatura ambiente e temperados pela adição de 1/10 vol de glicina 1.375 M. Os núcleos foram coletados por centrifugação a 6000 × g por 5 min. Os núcleos foram lavados duas vezes em 1 mL de NEB e ressuspensos em 1 mL de tampão de lise (15 mM HEPES-Na em pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA em pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na Deoxycholate, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroylsarcosine e 1× inibidores de protease completos livres de EDTA). Os núcleos foram sonicados usando um processador ultrassônico Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) seis vezes por 20 s e 1 min no gelo. Os núcleos sonicados foram centrifugados a 13000 × g por 4 min a 4°C. A maioria da cromatina sonicada tinha 500 a 1000 pares de bases (pb) de comprimento. Para cada imunoprecipitação, 15 μg de cromatina foram incubados na presença de 10 μg de anticorpo monoclonal HP1 9A9 (3 h a 4°C em uma roda rotativa). Em seguida, 50 μl de proteína G de dynabeads foram adicionados e a incubação foi continuada durante a noite a 4°C. Os sobrenadantes foram descartados e as amostras foram lavadas duas vezes em tampão de lise (cada lavagem de 15 min a 4 °C) e duas vezes em tampão TE (1 mM de EDTA, 10 mM de TrisHCl a pH 8). A cromatina foi eluída das contas em duas etapas; primeiro em 100 μl de Eluition Buffer 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl a pH 8) a 65 ° C por 15 min, seguido de centrifugação e recuperação do sobrenadante. O material dos grânulos foi reextraído em 100 μl de TE + 0,67% de SDS. O eluato combinado (200 μl) foi incubado durante a noite a 65 ° C para reverter as ligações cruzadas e tratado com 50 μg / ml de RNaseA por 15 min a 65 ° C e por 500 μg / ml de proteinase K por 3 h a 65 ° C. As amostras foram extraídas com fenol-clorofórmio e precipitadas com etanol. O DNA foi ressuspenso em 25 μl de água. Para maximizar as análises moleculares com DNA imunoprecipitado, os genes candidatos foram amplificados em pares por meio de um protocolo de PCR duplex otimizado usando dois conjuntos diferentes de primers com temperaturas de fusão semelhantes em uma única reação.
(Casale et al. 2019)
 

Este tutorial explica que tipo de sonicador é melhor para suas tarefas de preparação de amostras, como lise, ruptura celular, isolamento de proteínas, fragmentação de DNA e RNA em laboratórios, análise e pesquisa. Escolha o tipo de sonicador ideal para sua aplicação, volume de amostra, número de amostra e rendimento. A Hielscher Ultrasonics tem o homogeneizador ultrassônico ideal para você!

Como encontrar o sonicador perfeito para ruptura celular e extração de proteínas em ciência e análise

Miniatura do vídeo

UP200St TD_CupHorn para a sonicação indireta de amostras

UP200St TD_CupHorn para a sonicação indireta de amostras como cisalhamento de DNA e cromatina

Disruptores de células ultrassônicos de alto desempenho para amostras biológicas

A Hielscher Ultrasonics é seu parceiro experiente quando se trata de ultrassonizadores de alto desempenho para ruptura celular, lise, extração de proteínas, fragmentação de DNA, RNA e cromatina, bem como outras etapas pré-analíticas de preparação de amostras. Oferecendo um portfólio abrangente de homogeneizadores de laboratório ultrassônico e unidades de preparação de amostras, a Hielscher tem o dispositivo ultrassônico ideal para sua aplicação e requisitos biológicos.
Insonificador tipo sonda UP200St para liseUltrasonicator clássico do tipo sonda com micro-ponta, como o UP200St (200W; veja a imagem à esquerda) ou uma das unidades ultrassônicas de preparação de amostras VialTweeter ou UP200St_TD_CupHorn com VialHolder são os modelos favoritos em laboratórios de pesquisa e analíticos. A sonda ultrassônica clássica é ideal, quando preparada menos amostras devem ser lisadas, extraídas ou fragmentadas. As unidades de preparação de amostras VialTweeter e UP200St_TD_CupHorn permitem a sonicação simultânea de até 10 ou 5 frascos para injetáveis, respectivamente.
Se for necessário processar um grande número de amostras (por exemplo, placas de 96 poços, placas de microtitulação, etc.), o UIP400MTP é a configuração de sonicação ideal. O UIP400MTP funciona como um cuphorn maior, que é preenchido com água e tem espaço suficiente para conter placas de micropoços. Alimentado por um poderoso processador ultrassônico de 400 watts, o UIP400MTP fornece uma sonicação muito uniforme e intensa de placas de vários poços para interromper células, lisar amostras, solubilizar pellets, extrair proteínas ou cisalhar DNA.

Controle preciso via software inteligente

Hielscher's industrial processors of the hdT series can be comfortable and user-friendly operated via browser remote control.Todas as soluções de sonicação Hielscher a partir de 200 watts estão equipadas com uma tela sensível ao toque digital colorida e um software inteligente. Através do protocolo de dados inteligente, todos os parâmetros do processo ultrassônico são salvos automaticamente como arquivo CSV em um cartão SD integrado assim que o ultrassom é iniciado. Isso torna a pesquisa e o protocolo muito mais convenientes. Após os testes de sonicação ou preparação da amostra, você pode simplesmente revisar os parâmetros de sonicação de cada execução de sonicação e compará-los.
Através do menu intuitivo, vários parâmetros podem ser predefinidos antes da sonicação: Por exemplo, para controlar a temperatura na amostra e evitar sua degradação térmica, um limite superior da temperatura da amostra pode ser definido. Um sensor de temperatura conectável, que vem com a unidade ultrassônica, fornece ao processador ultrassônico feedback sobre a temperatura real de sonicação. Quando o limite superior de temperatura é atingido, o dispositivo ultrassônico faz uma pausa até que o limite inferior do ∆T definido seja atingido e começa a sonicar automaticamente novamente.
Se a sonicação com uma entrada de energia específica for necessária, você pode predefinir a energia ultrassônica final da execução da sonicação. Obviamente, a pulsação ultrassônica e o modo de ciclo também podem ser definidos individualmente.
Para reutilizar seus parâmetros de sonicação mais bem-sucedidos, você pode salvar vários modos de sonicação (por exemplo, tempo de sonicação, intensidade, modo de ciclo, etc.) como modos predefinidos, para que possam ser reiniciados de forma fácil e rápida.
Para maior comodidade operacional, todas as unidades ultrassônicas digitais podem ser operadas via controle remoto do navegador em qualquer navegador comum (por exemplo, InternetExplorer, Safari, Chrome etc.). A conexão LAN é uma configuração plug-n-play simples e não requer instalação de software adicional.
Nós da Hielscher sabemos que a sonicação bem-sucedida de amostras biológicas requer precisão e repetibilidade. Portanto, projetamos nossos ultrassônicos como dispositivos inteligentes com todos os recursos que permitem uma preparação de amostra eficiente, confiável, reprodutível e conveniente.

Entre em contato conosco agora e conte-nos sobre suas amostras biológicas e as etapas de preparação necessárias. Vamos propor o dispositivo de preparação de amostras ultrassônico mais adequado e ajudá-lo com informações adicionais, como protocolos e recomendações.

A tabela abaixo fornece uma indicação da capacidade de processamento aproximada de nossos sistemas ultrassônicos, desde micropontas ultrassônicas e homogeneizadores ultrassônicos clássicos até ultrassonicadores MultiSample para a preparação conveniente e confiável de inúmeras amostras:

Volume do lote Vazão Dispositivos recomendados
Placas de 96 poços / microtitulação n.a. UIP400MTP
10 frascos para injetáveis à 0,5 a 1,5mL n.a. VialTweeter em UP200St
CupHorn para sonicação indireta, por exemplo, até 5 frascos n.a. UP200St_TD_CupHorn
00,01 a 250mL 5 a 100mL/min UP50H
00,01 a 500mL 10 a 200mL/min UP100H
00,02 a 1L 20 a 400mL/min UP200Ht / UP200St
10 a 2000mL 20 a 400mL/min UP200Ht, UP400St
0.25 a 5L 00,05 a 1L / min UIP500hdT

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O VialTweeter é um Ultraonicator MultiSample que permite a preparação confiável de amostras sob condições de temperatura controladas com precisão.

A unidade ultrassônica de preparação de várias amostras VialTweeter permite a sonicação simultânea de até 10 frascos. Com o dispositivo de fixação VialPress, até 4 tubos adicionais podem ser pressionados para a frente para uma sonicação intensa.



Fatos, vale a pena conhecer

Metabolômica

A metabolômica é o estudo de pequenas moléculas, conhecidas como metabólitos, presentes dentro de células, biofluidos, tecidos ou organismos. Essas pequenas moléculas e suas interações dentro de um sistema biológico são resumidas sob o termo guarda-chuva "metaboloma" e o campo de pesquisa é chamado de metabolômica. A pesquisa do metaboloma está intimamente ligada ao campo emergente da medicina de precisão. A compreensão do metaboloma e sua relação com várias doenças ajuda a desenvolver estratégias de prevenção de doenças e cuidados clínicos, enquanto a variabilidade individual no ambiente, estilo de vida, genética e fenótipo molecular. Para liberar moléculas de metabólitos das células, a ultrassonografia é frequentemente usada em laboratórios biológicos para preparação de amostras pré-analíticas, como ruptura celular, lise e extração de proteínas, lipídios e outras moléculas.


Literatura / Referências


A Hielscher Ultrasonics fornece homogeneizadores ultrassônicos de alto desempenho desde o laboratório até o tamanho industrial.

Ultrassom de alto desempenho! A linha de produtos da Hielscher cobre todo o espectro, desde o ultrassônico compacto de laboratório, passando por unidades de bancada, até sistemas ultrassônicos totalmente industriais.

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