Lise ultrassónica de amostras de Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster é amplamente utilizada em laboratórios como organismo modelo. Por isso, é necessário realizar frequentemente etapas de preparação pré-analítica, como lise, rutura celular, extração de proteínas e cisalhamento do DNA de amostras de Drosophila melanogaster. Os desintegradores ultrassónicos são fiáveis e eficientes e podem ser utilizados para realizar facilmente várias tarefas, como lise, extração de proteínas ou fragmentação do DNA, ajustando apenas os parâmetros do processo ultrassónico. Os homogeneizadores ultrassónicos são, assim, ferramentas flexíveis com uma vasta gama de aplicações.

Lise ultrassónica e extração de proteínas

A lise, a solubilização celular, a homogeneização de tecidos e a extração de proteínas são tarefas típicas dos desintegradores ultrassónicos em laboratórios de biologia. Os desintegradores ultrassónicos e os equipamentos de rutura celular são adequados para homogeneizar tecidos animais, insetos (por exemplo, Drosophila melanogaster, C. elegans) ou espécimes vegetais. As aplicações subsequentes dos ultrassons são a lise de suspensões celulares e sedimentos, bem como a extração de proteínas intracelulares.
A lise ultrassónica e a extração de proteínas são processos altamente fiáveis e reprodutíveis, que podem ser realizados com base em protocolos estabelecidos. Como a intensidade do processo ultrassónico pode ser ajustada com precisão através de parâmetros de sonicação, como a amplitude, o modo de ciclo / impulso, a temperatura e o volume da amostra, os protocolos, uma vez comprovados, podem ser repetidos sucessivamente com o mesmo resultado.

Fragmentação ultrassónica de DNA e RNA

Após a lise celular e a extração de proteínas, uma etapa habitualmente necessária na preparação de amostras é o cisalhamento e a fragmentação do DNA, do RNA e da cromatina, por exemplo, antes da imunoprecipitação da cromatina (ChIP). A fragmentação do DNA e do RNA pode ser obtida de forma fiável através da rutura, por forças físicas, das ligações covalentes que mantêm o DNA unido. Com o cisalhamento físico, como a sonicação, as cadeias de DNA são primeiro quebradas e, em seguida, o DNA é fragmentado em pedaços mais pequenos.
A fragmentação ultrassónica do DNA é fiável e eficiente no cisalhamento do DNA até um comprimento pretendido, por exemplo, 500bp (pares de bases). As principais vantagens da fragmentação ultrassónica do DNA incluem o controlo preciso dos parâmetros e da intensidade do processo ultrassónico. Os parâmetros do processo ultrassónico podem ser ajustados regulando com precisão a intensidade, os ciclos e o tempo de sonicação. Isto permite obter os tamanhos de DNA desejados, e o comprimento pretendido do DNA pode ser produzido e reproduzido de forma fiável. O cisalhamento ultrassónico do DNA é também ideal para criar fragmentos de DNA de elevado peso molecular.

Protocolos de lise ultrassónica de Drosophila melanogaster

Abaixo encontrará vários protocolos para a lise assistida por ultrassons, a extração de proteínas e a fragmentação do DNA ou da cromatina de amostras de Drosophila.

Lise ultrassónica para o ensaio de imunoprecipitação com reticulação (CLIP)

O ensaio CLIP foi realizado conforme anteriormente descrito, com algumas modificações. Aproximadamente 20 mg de ovários de fêmeas de tipo selvagem com 0 a 1 dia de idade foram reticulados por UV (3 × 2000 μJ/cm2), homogeneizados em gelo em 1 mL de tampão RCB (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM sacarose, 1 mM DTT, 1× Inibidores de Proteases Complete sem EDTA, 1 mM PMSF) suplementado com 300 U de RNAseOUT e colocados em gelo durante 30 min. O homogeneizado foi sonicado em gelo, a 80% de potência, cinco vezes em impulsos de 20 s, com um intervalo de repouso de 60 s entre eles, utilizando o processador ultrassónico Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) e centrifugado (16 000 × g durante 5 min a 4°C). O extrato solúvel foi pré-clarificado com 20 μl de Dynabeads de proteína G durante 20 min a 4°C. Após a retirada de amostras para imunotransferência e quantificação do RNA de entrada (1%), a HP1 foi imunoprecipitada com o anticorpo anti-HP1 9A9 a partir de 450 μl de extrato pré-clarificado, por incubação durante 4 h com 50 μl de Dynabeads de proteína G. Os imunoprecipitados foram lavados 4 vezes com RCB. Para eluir os RNA imunoprecipitados, as esferas sedimentadas foram fervidas em 100 μL de água UltraPure tratada com DEPC durante 5 min. Adicionaram-se 900 μL de reagente Qiazol ao sobrenadante recuperado para a preparação do RNA. O RNA purificado foi utilizado como molde para sintetizar cDNA, utilizando oligo dT, hexâmeros aleatórios e a transcriptase reversa SuperScript III, de acordo com o protocolo do fabricante.
(Cassale et al. 2019)

Lise ultrassónica para o ensaio de imunoprecipitação da cromatina

A imunoprecipitação da cromatina foi realizada de acordo com o método descrito por Menet, com pequenas modificações. Aproximadamente 20 mg de ovários de fêmeas de tipo selvagem com 0 a 1 dia de idade foram homogeneizados em 1 mL de tampão NEB (10 mM HEPES-Na a pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na a pH 8, 0,5 mM EDTA-Na a pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM espermidina, 0,15 mM espermina, 1× Inibidores de Proteases Complete sem EDTA) com um homogeneizador / dispersor de imersão durante 1 min (a 3000 rpm). O homogeneizado foi transferido para um homogeneizador Dounce de vidro previamente arrefecido e foram realizados 15 movimentos completos com um êmbolo de ajuste apertado. Os núcleos livres foram então centrifugados a 6000xg durante 10 min a 4°C. Os sedimentos que continham os núcleos foram ressuspensos em 1 mL de NEB e centrifugados a 20 000 × g durante 20 min num gradiente de sacarose (0,65 mL de sacarose 1,6 M em NEB, 0,35 mL de sacarose 0,8 M em NEB). O sedimento foi ressuspenso em 1 mL de NEB e formaldeído até uma concentração final de 1%. Os núcleos foram reticulados durante 10 min à temperatura ambiente e a reação foi interrompida adicionando 1/10 vol de glicina 1,375 M. Os núcleos foram recolhidos por centrifugação a 6000 × g durante 5 min. Os núcleos foram lavados duas vezes em 1 mL de NEB e ressuspensos em 1 mL de tampão de lise (15 mM HEPES-Na a pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA a pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% desoxicolato de Na, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroilsarcosina e 1× Inibidores de Proteases Complete sem EDTA). Os núcleos foram sonicados utilizando um processador ultrassónico Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) seis vezes, com 20 s de funcionamento e 1 min em gelo. Os núcleos sonicados foram centrifugados a 13 000 × g durante 4 min a 4°C. A maior parte da cromatina sonicada tinha um comprimento de 500 a 1000 pares de bases (bp). Para cada imunoprecipitação, foram incubados 15 μg de cromatina na presença de 10 μg de anticorpo monoclonal HP1 9A9 (3 h a 4°C numa roda rotativa). Em seguida, adicionaram-se 50 μl de Dynabeads de proteína G e a incubação prosseguiu durante a noite a 4°C. Os sobrenadantes foram descartados e as amostras foram lavadas duas vezes em tampão de lise (cada lavagem durante 15 min a 4 °C) e duas vezes em tampão TE (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl a pH 8). A cromatina foi eluída das esferas em duas etapas; primeiro em 100 μl de tampão de eluição 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl a pH 8) a 65°C durante 15 min, seguindo-se a centrifugação e a recuperação do sobrenadante. O material das esferas foi novamente extraído em 100 μl de TE + 0,67% SDS. O eluato combinado (200 μl) foi incubado durante a noite a 65°C para reverter as ligações cruzadas e tratado com 50 μg/ml de RNaseA durante 15 min a 65°C e com 500 μg/ml de proteinase K durante 3 h a 65°C. As amostras foram extraídas com fenol–clorofórmio e precipitadas com etanol. O DNA foi ressuspenso em 25 μl de água. Para maximizar as análises moleculares com o DNA imunoprecipitado, os genes candidatos foram amplificados aos pares através de um protocolo otimizado de PCR duplex, utilizando dois conjuntos diferentes de primers com temperaturas de fusão semelhantes numa única reação.
(Casale et al. 2019)
 

Equipamentos ultrassónicos de alto desempenho para a rutura celular de amostras biológicas

A Hielscher Ultrasonics é o seu parceiro com vasta experiência em sonicadores de alto desempenho para rutura celular, lise, extração de proteínas, fragmentação de DNA, RNA e cromatina, bem como outras etapas de preparação pré-analítica de amostras. Com uma gama abrangente de homogeneizadores ultrassónicos de laboratório e unidades de preparação de amostras, a Hielscher tem o dispositivo ultrassónico ideal para a sua aplicação biológica e os seus requisitos.
Um sonicador clássico de sonda com microponta, como o UP200St (200W; ver imagem à esquerda), ou uma das unidades ultrassónicas de preparação de amostras VialTweeter ou UP200ST_TD_CupHorn com VialHolder são modelos preferidos nos laboratórios de investigação e análise. A sonda ultrassónica clássica é ideal quando é necessário realizar a lise, a extração ou a fragmentação de um número reduzido de amostras. As unidades de preparação de amostras VialTweeter e UP200St_TD_CupHorn permitem a sonicação simultânea de até 10 ou 5 frascos, respetivamente.
Se for necessário processar um elevado número de amostras (por exemplo, placas de 96 poços, placas de microtitulação, etc.), o UIP400MTP é a configuração de sonicação ideal. O UIP400MTP funciona como um sonotrodo de copo de maiores dimensões, que é enchido com água e dispõe de espaço suficiente para alojar placas de micropoços. Alimentado por um potente processador ultrassónico de 400 watts, o UIP400MTP proporciona uma sonicação muito uniforme e intensa de placas multipoços, para romper células, efetuar a lise de amostras, solubilizar sedimentos, extrair proteínas ou cisalhar DNA.

Controlo preciso através de software inteligente

Todas as soluções de sonicação Hielscher a partir de 200 watts estão equipadas com um ecrã tátil digital a cores e software inteligente. Através do registo inteligente de dados, todos os parâmetros do processo ultrassónico são automaticamente guardados num ficheiro CSV num cartão SD integrado assim que o sonicador é iniciado. Isto torna a investigação e o registo muito mais cómodos. Após os ensaios de sonicação ou a preparação das amostras, pode simplesmente consultar os parâmetros de sonicação de cada execução e compará-los.
Através do menu intuitivo, é possível predefinir numerosos parâmetros antes da sonicação: por exemplo, para controlar a temperatura da amostra e evitar a sua degradação térmica, pode definir-se um limite superior para a temperatura da amostra. Um sensor de temperatura conectável, fornecido com a unidade ultrassónica, transmite ao processador ultrassónico informações sobre a temperatura efetiva de sonicação. Quando o limite superior de temperatura é atingido, o dispositivo ultrassónico faz uma pausa até ser atingido o limite inferior do ∆T definido e, em seguida, reinicia automaticamente a sonicação.
Se for necessária uma sonicação com um aporte de energia específico, pode predefinir a energia ultrassónica final da execução de sonicação. Naturalmente, a pulsação ultrassónica e o modo de ciclo também podem ser definidos individualmente.
Para reutilizar os parâmetros de sonicação que deram melhores resultados, pode guardar vários modos de sonicação (por exemplo, tempo de sonicação, intensidade, modo de ciclo, etc.) como modos predefinidos, para que possam ser novamente iniciados de forma fácil e rápida.
Para maior comodidade de operação, todas as unidades ultrassónicas digitais podem ser operadas por controlo remoto através de qualquer navegador comum (por exemplo, InternetExplorer, Safari, Chrome, etc.). A ligação LAN tem uma configuração simples plug-n-play e não requer a instalação de software adicional.
Na Hielscher, sabemos que a sonicação bem-sucedida de amostras biológicas exige precisão e repetibilidade. Por isso, concebemos os nossos sonicadores como dispositivos inteligentes, com todas as funcionalidades que permitem uma preparação de amostras eficiente, fiável, reprodutível e cómoda.

A tabela abaixo dá-lhe uma indicação da capacidade aproximada de processamento dos nossos sistemas ultrassónicos, desde micropontas ultrassónicas e homogeneizadores ultrassónicos clássicos até sonicadores MultiSample, para a preparação cómoda e fiável de numerosas amostras: