Lise ultrassônica de Drosophila melanogaster Amostras

Drosophila melanogaster é amplamente utilizado em laboratórios como organismo modelo. Portanto, devem ser realizadas etapas de preparação pré-analítica, como lise, ruptura celular, extração de proteínas e corte de DNA de amostras de melanogaster de Drosophila. Os dismembradores ultrassônicos são confiáveis e eficientes e podem ser usados para realizar várias tarefas como lise, extração de proteínas ou fragmentação de DNA à vontade apenas ajustando parâmetros de processo ultrassônico. Homogeneizadores ultrassônicos são, portanto, ferramentas flexíveis com uma ampla gama de aplicações.

Lise ultrassônica e extração de proteínas

Drosophila melanogaster is widely used as model organism in biological labs. Find here protocols for lysis, protein extracion and DNA shearing of D. melanogaster samples.Lise, solubilização celular, homogeneização de tecidos e extração de proteínas são tarefas típicas para dismembradores ultrassônicos em laboratórios biológicos. Dismembradores ultrassônicos e disruptores celulares são adequados para homogeneizar tecidos animais, insetos (por exemplo, Drosophila melanogaster, C. elegans) ou espécimes de plantas. As aplicações subsequentes da ultrassonização são a lise de suspensões celulares e pelotas, bem como a extração de proteínas intracelulares.
A lise ultrassônica e a extração de proteínas são processos altamente confiáveis e reprodutíveis, que podem ser realizados com base em protocolos estabelecidos. Uma vez que a intensidade do processo ultrassônico pode ser exatamente ajustada através de parâmetros de sônica, como amplitude, ciclo/modo de pulso, temperatura e volume amostral, uma vez comprovados protocolos podem ser repetidos com o mesmo resultado repetidamente.

Vantagens da Preparação de Amostras Ultrassônicas

  • altamente eficiente
  • Ajustável ao material amostral específico
  • Adequado para qualquer volume
  • Tratamento não térmico
  • resultados reprodutíveis
  • Simples e seguro

DNA ultrassônico e fragmentação de RNA

Após a lise celular e extração de proteínas, um passo comum necessário na preparação da amostra é a tesoura e fragmentação do DNA, RNA e cromatina, por exemplo, antes da imunoprecipitação de cromatina (CHIP). A fragmentação do DNA e do RNA pode ser seguramente alcançada quebrando as ligações covalentes que mantêm o DNA unido por forças físicas. Usando cisalhamento físico, como a sônicação, no início os fios de DNA são quebrados, então o DNA é fragmentado em pedaços menores.
A fragmentação do DNA ultrassônico é confiável e eficiente na cisalhamento do DNA a um comprimento direcionado, por exemplo, 500bp (pares de base). As principais vantagens da fragmentação do DNA ultrassônico incluem o controle preciso dos parâmetros e intensidade do processo ultrassônico. Os parâmetros do processo ultrassônico podem ser ajustados afinando a intensidade, os ciclos e o tempo com precisão. Isso torna possível criar tamanhos de DNA desejados e o comprimento do DNA direcionado pode ser produzido de forma confiável, bem como reproduzido. A cisalhamento de DNA ultrassônico também é ideal para criar fragmentos de DNA de alto peso molecular.

Ultrasonicator UP200Ht with microtip S26d2 for ultrasonic lysis of Drosophila samples

ultrasonicator UP200Ht com 2mm microtip S26d2 para a sônica de amostras de Drosophila

Pedido de informação





Protocolos para Lise Ultrassônica de Drosophila melanogaster

Abaixo você pode encontrar vários protocolos para a lise ultrasonicamente assistida, extração de proteínas e fragmentação de DNA ou cromatina de amostras de Drosophila.

Lysis ultrassônica para ensaio de imunoprecipitação transversal (CLIP)

O ensaio CLIP foi realizado como relatado anteriormente com algumas modificações. Aproximadamente 20 mg de ovários de 0 a 1 dia de idade fêmeas do tipo selvagem foram UV crosslinked (3 × 2000 μJ/cm2), homogeneizados no gelo em 1 mL RCB tampão (50 mM HEPES pH 7.4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM de sacarose, 1 mM DTT, 1× Inibidores completos de Protease sem EDTA, 1 mM PMSF) complementado com 300 U RNAseOUT e colocado no gelo por 30 min. O homogeneizado foi sonicado no gelo, com 80% de potência, cinco vezes em rajadas de 20 s com um descanso de 60 s entre eles usando o processador Ultrassônico Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) e centrifusa (16000 × g por 5 min a 4°C). O extrato solúvel foi pré-esclarido com 20 μl de dínamas de proteína-G por 20 min a 4°C. Após a remoção de amostras para imunoblotação e quantitação de entrada de RNA (1%), HP1 foi imunoprecipitado com anticorpo anti-HP1 9A9 de 450 μl extrato pré-claro por incubação por 4h com 50 μl dínapors protein-G. Os imunoprecipitatos foram lavados 4 vezes com rcb. Para elutar as RNAs imunoprecipitadas, as contas de pelotização foram fervidas em 100 μL de água tratada com UltraPure DEPC por 5 min. 900 μL Qiazol Reagente foi adicionado ao supernante recuperado para preparação de RNA. O RNA purificado foi usado como um modelo para sintetizar cDNA usando oligo dT, hexamers aleatórios e transcriptase reversa SuperScript III de acordo com o protocolo do fabricante.
(Cassale et al. 2019)

Lise ultrassônica para ensaio de imunoprecipitação de Chromatina

A imunoprecipitação de cromatina foi realizada de acordo com o método descrito por Menet com pequenas modificações. Aproximadamente 20 mg de ovários de 0 a 1 dia de idade fêmeas do tipo selvagem foram homogeneizados em 1 mL de tampão NEB (10 mM HEPES-Na no pH 8.0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na no pH 8, 0,5 mM EDTA-Na no pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM Spermidina, 0,15 mM Spermna, 1× Inibidores completos de Protease livres de EDTA) com homogeneizador / dispersão de imersão 1 min (a 3000 rpm). O homogeneado foi transferido para um dounce de vidro pré-refrigerado e 15 traçados completos foram aplicados com um pilão apertado. Os núcleos livres foram então centrifugados a 6000xg por 10 min a 4°C. As pelotas contendo núcleos foram resuspengiadas em 1 mL de NEB e centrífugas a 20000 × g por 20 min em gradiente de sacarose (0,65 mL de 1,6 M de sacarose no NEB, 0,35 mL de 0,8 M de sacarose no NEB). A pelota foi resuspendida em 1 mL de NEB e formaldeído para uma concentração final de 1%. Os núcleos foram cruzados por 10 minutos à temperatura ambiente e saciados adicionando 1/10 vol de 1,375 M de glycina. Os núcleos foram coletados por centrifugação a 6000 × g por 5 min. Os núcleos foram lavados duas vezes em 1 mL de NEB e resuspensados em 1 mL de Tampão de Lysis (15 mM HEPES-Na no pH 7.6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA no pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na Deoxicolato, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroylsarcosine e 1× Inibidores de Protease Completa sem EDTA). Os núcleos foram sonicados usando um processador Ultrassônico Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) seis vezes por 20 s on e 1 min no gelo. Núcleos sonicados foram centrifugados a 13000 × g por 4 min a 4°C. A maioria da cromatina sônica foi de 500 a 1000 pares de base (bp) de comprimento. Para cada imunoprecipitação, 15 μg de cromatina foram incubados na presença de 10 μg de anticorpo monoclonal HP1 9A9 (3 h a 4°C em uma roda giratória). Em seguida, 50 μl de proteína de dínamo G foi adicionado e a incubação foi continuada durante a noite a 4°C. Os supernantes foram descartados e as amostras foram lavadas duas vezes em Lysis Buffer (cada lavagem 15 min a 4 °C) e duas vezes em Te Buffer (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl em pH 8). Cromatina foi elucidado de contas em duas etapas; primeiro em 100 μl de Eluition Buffer 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl no pH 8) a 65°C por 15 min, seguido por centrifugação e recuperação do supernante. O material das contas foi re-extraído em 100 μl de TE + 0,67% SDS. O eluato combinado (200 μl) foi incubado durante a noite a 65°C para reverter as ligações cruzadas e tratado por 50 μg/ml RNaseA por 15 min a 65°C e por 500 μg/ml Proteinase K por 3 h a 65°C. As amostras foram extraídas fenol-clorofórmio e etanol precipitado. O DNA foi resuspengado em 25 μl de água. Para maximizar as análises moleculares com DNA imunoprecipitado, os genes candidatos foram amplificados em pares através de um protocolo duplex-PCR otimizado usando dois conjuntos diferentes de primers com temperaturas de fusão semelhantes em uma única reação.
(Casale et al. 2019)

UP200St TD_CupHorn para a sônica indireta de amostras

UP200St TD_CupHorn para a sônica indireta de amostras como DNA e cisalhamento de cromatina

Disruptores de células ultrassônicas de alto desempenho para amostras biológicas

Hielscher Ultrasonics é seu parceiro de longa experiência quando se trata de ultrassononicadores de alto desempenho para interrupção celular, lise, extração de proteínas, DNA, RNA e fragmentação de cromatina, bem como outras etapas de preparação de amostras pré-analíticas. Oferecendo um portfólio abrangente de homogeneizadores de laboratório ultrassônicos e unidades de preparação de amostras, a Hielscher possui o dispositivo ultrassônico ideal para sua aplicação biológica e requisitos.
Sonda de tipo insonifier UP200St para liseUltrassonicator clássico do tipo sonda com micro-ponta, como o UP200St (200W; veja imagem à esquerda) ou uma das unidades de preparação de amostras ultrassônicas VialTweeter ou UP200St_TD_CupHorn com o VialHolder são modelos favoritos em laboratórios de pesquisa e análise. A sonda ultrassônica clássica é ideal, quando preparar menos amostras deve ser lístida, extraída ou fragmentada. As unidades de preparação da amostra VialTweeter e UP200St_TD_CupHorn permitem a sônica simultânea de até 10 ou 5 frascos, respectivamente.
Se devem ser processados números de amostrais elevados (por exemplo, placas de 96 poços, placas de microtéter etc.) UIP400MTP é a configuração ideal de sônicação. O UIP400MTP funciona como um cuphorn maior, que é preenchido com água e tem espaço suficiente para segurar placas de micro-poço. Alimentado por um poderoso processador ultrassônico de 400 watts, o UIP400MTP oferece uma sônica muito uniforme e intensa de placas multi-poços, a fim de interromper células, amostras de lise, pelotas solubilizadas, extrair proteínas ou DNA de cisalhamento.

Controle Preciso via Software Inteligente

processadores industriais da Hielscher da série HDT pode ser confortável e amigável operado através de controle remoto browser.Todas as soluções de sônica hielscher de 200 watts para cima são equipadas com uma tela sensível ao toque de cores digital e um software inteligente. Através da protocolo de dados inteligentes, todos os parâmetros de processo ultrassônicos são automaticamente salvos como arquivo CSV em um cartão SD embutido assim que o ultrassonicator é iniciado. Isso torna a pesquisa e o protocolo muito mais convenientes. Após os ensaios de sônicação ou preparação da amostra, você pode simplesmente rever os parâmetros de sônicação de cada sonicação executada e compará-los.
Através do menu intuitivo, numerosos parâmetros podem ser predefinidos antes da sônica: Por exemplo, para controlar a temperatura na amostra e para evitar sua degradação térmica, um limite superior da temperatura da amostra pode ser definido. Um sensor de temperatura plugável, que vem com a unidade ultrassônica, dá ao processador ultrassônico feedback sobre a temperatura real da sônica. Quando o limite de temperatura superior é atingido, o dispositivo ultrassônico pausa até que o limite inferior do conjunto ∆T seja atingido e comece a sonicar automaticamente novamente.
Se a sônica com uma entrada de energia específica for necessária, você pode predefinir a energia ultrassônica final da corrida de sônica. Claro, a pulsação ultrassônica e o modo de ciclo também podem ser definidos individualmente.
Para reutilizar seus parâmetros de sônica mais bem sucedidos, você pode salvar vários modos de sônicação (por exemplo, tempo de sônicação, intensidade, modo de ciclo etc.) como modos pré-definidos, para que eles possam ser fáceis e rapidamente iniciados novamente.
Para maior comodidade operacional, todas as unidades ultrassônicas digitais podem ser operadas através do controle remoto do navegador em qualquer navegador comum (por exemplo, InternetExplorer, Safari, Chrome etc.). A conexão LAN é uma configuração simples de plug-n-play e não requer nenhuma instalação adicional de software.
Nós da Hielscher sabemos que a sônica bem sucedida de amostras biológicas requer precisão e repetibilidade. Por isso, projetamos nossos ultrassonicadores como dispositivos inteligentes com todos os recursos que permitem uma preparação eficiente, confiável, reprodutível e conveniente da amostra.

Entre em contato conosco agora e nos conte sobre suas amostras biológicas e as etapas necessárias de preparação. Vamos propor-lhe o dispositivo de preparação de amostras ultrassônicas mais adequado e ajudá-lo com informações adicionais, como protocolos e recomendações.

A tabela abaixo dá-lhe uma indicação da capacidade aproximada de processamento de nossos sistemas ultrassônicos desde micro-pontas ultrassônicas e homogeneizadores ultrassônicos clássicos até ultrassonicadores MultiSample para a preparação conveniente e confiável de inúmeras amostras:

Volume batch Quociente de vazão Dispositivos Recomendados
Placas de 96 poços / microtiter n / D. UIP400MTP
10 frascos a 0,5 a 1,5mL n / D. VialTweeter em UP200St
CupHorn para sônica indireta, por exemplo, até 5 frascos n / D. UP200St_TD_CupHorn
0.01 a 250mL 5 a 100mL/min UP50H
0.01 a 500mL 10 a 200 mL / min UP100H
0.02 a 1L 20 a 400 mL / min UP200Ht / UP200St
10 a 2000 mL 20 a 400 mL / min UP200Ht, UP400St
0.25 a 5L 0.05 a 1L/min UIP500hdT

Contate-Nos! / Pergunte-nos!

Solicite mais informações

Por favor, use o formulário abaixo para solicitar informações adicionais sobre processadores ultrassônicos, aplicativos e preço. Ficaremos felizes em discutir seu processo com você e oferecer-lhe um sistema ultrassônico atendendo aos seus requisitos!









Por favor, note que o nosso Política de Privacidade.


The VialTweeter is a MultiSample Ultraonicator that allows for reliable sample preparation under precisely controlled temperature conditions.

A unidade de preparação ultrassônica de várias amostras VialTweeter permite a sônica simultânea de até 10 frascos. Com o dispositivo de fixação VialPress, até 4 tubos adicionais podem ser pressionados à frente para sônicação intensa.

Literatura / Referências



Hielscher Ultrasonics supplies high-performance ultrasonic homogenizers from lab to industrial size.

Ultrassônicos de alto desempenho! A gama de produtos da Hielscher abrange todo o espectro desde o ultrassônico de laboratório compacto sobre unidades de bancada até sistemas ultrassônicos industriais completos.


Fatos, vale a pena conhecer

Metabolômica

Metabolômica é o estudo de pequenas moléculas, conhecidas como metabólitos, presentes dentro de células, biofluidos, tecidos ou organismos. Essas pequenas moléculas e suas interações dentro de um sistema biológico são resumidas sob o termo "metabolome" e o campo de pesquisa é chamado metabolômico. A pesquisa metabolome está intimamente ligada ao campo emergente da medicina de precisão. A compreensão do metabolo e sua relação com várias doenças ajuda a desenvolver estratégias de prevenção de doenças e cuidados clínicos, enquanto a variabilidade individual no ambiente, estilo de vida, genética e fenótipo molecular. Para liberar moléculas metabólitos das células, a ultrassônica é frequentemente usada em laboratórios biológicos para preparação de amostras pré-analíticas, como ruptura celular, lise e extração de proteínas, lipídios e outras moléculas.