Lise ultra-sónica de amostras de Drosophila Melanogaster

A Drosophila melanogaster é amplamente utilizada em laboratórios como organismo modelo. Por conseguinte, as etapas de preparação pré-analítica, como a lise, a rutura celular, a extração de proteínas e a fragmentação do ADN das amostras de Drosophila melanogaster, devem ser realizadas com frequência. Os desmembradores ultra-sónicos são fiáveis e eficientes e podem ser utilizados para realizar várias tarefas, tais como a lise, a extração de proteínas ou a fragmentação do ADN, ajustando apenas os parâmetros do processo ultrassónico. Homogeneizadores ultra-sônicos são, portanto, ferramentas flexíveis com uma ampla gama de aplicações.

Lise ultra-sónica e extração de proteínas

A lise, a solubilização de células, a homogeneização de tecidos e a extração de proteínas são tarefas típicas dos desmembradores de ultra-sons em laboratórios biológicos. Desmembradores ultra-sônicos e disruptores de células são bem adequados para homogeneizar tecidos animais, insetos (por exemplo, Drosophila melanogaster, C. elegans) ou espécimes de plantas. As aplicações subsequentes de ultra-sons são a lise de suspensões e pellets de células, bem como a extração de proteínas intracelulares.
A lise ultra-sónica e a extração de proteínas são processos altamente fiáveis e reprodutíveis, que podem ser realizados com base em protocolos estabelecidos. Uma vez que a intensidade do processo de ultra-sons pode ser ajustada com exatidão através de parâmetros de sonicação como a amplitude, o modo de ciclo/pulso, a temperatura e o volume da amostra, os protocolos comprovados podem ser repetidos com o mesmo resultado vezes sem conta.

Fragmentação ultra-sónica de ADN e ARN

Após a lise celular e a extração de proteínas, uma etapa comum necessária na preparação de amostras é o corte e a fragmentação do ADN, ARN e cromatina, por exemplo, antes da imunoprecipitação da cromatina (ChIP). A fragmentação do ADN e do ARN pode ser conseguida de forma fiável através da quebra das ligações covalentes que mantêm o ADN unido por forças físicas. Utilizando o cisalhamento físico, como a sonicação, primeiro as cadeias de ADN são quebradas e depois o ADN é fragmentado em pedaços mais pequenos.
A fragmentação ultra-sónica do ADN é fiável e eficiente no corte do ADN até um comprimento pretendido, por exemplo, 500 pb (pares de bases). As principais vantagens da fragmentação ultra-sónica do ADN incluem o controlo preciso dos parâmetros e da intensidade do processo ultrassónico. Os parâmetros do processo ultrassónico podem ser ajustados através da afinação precisa da intensidade, dos ciclos e do tempo de sonicação. Isto torna possível criar tamanhos de ADN desejados e o comprimento de ADN pretendido pode ser produzido de forma fiável, bem como reproduzido. O corte ultrassónico do ADN é também ideal para criar fragmentos de ADN de elevado peso molecular.

Protocolos para a lise ultra-sónica de Drosophila melanogaster

Abaixo pode encontrar vários protocolos para a lise assistida por ultra-sons, extração de proteínas e fragmentação de ADN ou cromatina de amostras de Drosophila.

Lise ultra-sónica para o ensaio de imunoprecipitação por ligação cruzada (CLIP)

O ensaio CLIP foi realizado conforme relatado anteriormente, com algumas modificações. Aproximadamente 20 mg de ovários de fêmeas do tipo selvagem com 0 a 1 dia de idade foram reticulados por UV (3 × 2000 μJ/cm2), homogeneizados em gelo em 1 mL de tampão RCB (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM sacarose, 1 mM DTT, 1 × EDTA-free Complete Protease Inhibitors, 1 mM PMSF) suplementado com 300 U RNAseOUT e colocado no gelo durante 30 min. O homogenato foi submetido a ultra-sons no gelo, a 80% de potência, cinco vezes em rajadas de 20 s com um descanso de 60 s entre elas, utilizando o processador ultrassónico Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) e centrifugado (16000 × g durante 5 min a 4°C). O extrato solúvel foi previamente limpo com 20 μl de dynabeads Protein-G durante 20 minutos a 4°C. Após a remoção das amostras para imunotransferência e quantificação da entrada de ARN (1%), a HP1 foi imunoprecipitada com anticorpo anti-HP1 9A9 a partir de 450 μl de extrato pré-limpo por incubação durante 4 h com 50 μl de dynabeads de proteína-G. Os imunoprecipitados foram lavados 4 vezes com RCB. Para eluir os ARN imunoprecipitados, os grânulos foram fervidos em 100 μL de água ultrapura tratada com DEPC durante 5 min. 900 μL de reagente Qiazol foram adicionados ao sobrenadante recuperado para a preparação do ARN. O ARN purificado foi utilizado como modelo para sintetizar o ADNc utilizando oligo dT, hexâmeros aleatórios e transcriptase reversa SuperScript III, de acordo com o protocolo do fabricante.
(Cassale et al. 2019)

Lise ultra-sónica para o ensaio de imunoprecipitação da cromatina

A imunoprecipitação da cromatina foi efectuada de acordo com o método descrito por Menet, com pequenas modificações. Aproximadamente 20 mg de ovários de fêmeas do tipo selvagem com 0 a 1 dia de idade foram homogeneizados em 1 mL de tampão NEB (10 mM HEPES-Na a pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na a pH 8, 0.5 mM EDTA-Na a pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM Spermidina, 0,15 mM Spermina, 1× EDTA- free Complete Protease Inhibitors) com um homogeneizador/dispersor de imersão 1 min (a 3000 rpm). O homogenato foi transferido para um balão de vidro previamente arrefecido e foram aplicados 15 golpes completos com um pilão apertado. Os núcleos livres foram então centrifugados a 6000xg durante 10 minutos a 4°C. Os pellets contendo núcleos foram ressuspensos em 1 mL de NEB e centrifugados a 20000 × g durante 20 min em gradiente de sacarose (0,65 mL de sacarose 1,6 M em NEB, 0,35 mL de sacarose 0,8 M em NEB). O sedimento foi ressuspendido em 1 mL de NEB e formaldeído até uma concentração final de 1%. Os núcleos foram reticulados durante 10 minutos à temperatura ambiente e arrefecidos pela adição de 1/10 vol de 1,375 M de glicina. Os núcleos foram recolhidos por centrifugação a 6000 × g durante 5 minutos. Os núcleos foram lavados duas vezes em 1 ml de NEB e ressuspendidos em 1 ml de tampão de lise (15 mM HEPES-Na a pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA a pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na Desoxicolato, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroylsarcosina e 1× Inibidores de protease completos sem EDTA). Os núcleos foram submetidos a ultra-sons utilizando um processador ultrassónico Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) seis vezes durante 20 s e 1 min no gelo. Os núcleos sonicados foram centrifugados a 13000 × g durante 4 min a 4°C. A maioria da cromatina sonicada tinha 500 a 1000 pares de bases (pb) de comprimento. Para cada imunoprecipitação, 15 μg de cromatina foram incubados na presença de 10 μg de anticorpo monoclonal HP1 9A9 (3 h a 4°C numa roda rotativa). Em seguida, foram adicionados 50 μl de proteína G dynabeads e a incubação foi continuada durante a noite a 4°C. Os sobrenadantes foram eliminados e as amostras foram lavadas duas vezes em Lysis Buffer (cada lavagem 15 min a 4 °C) e duas vezes em TE Buffer (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl a pH 8). A cromatina foi eluída das esferas em duas etapas; primeiro em 100 μl de Eluition Buffer 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl a pH 8) a 65 °C durante 15 min, seguido de centrifugação e recuperação do sobrenadante. O material das esferas foi re-extraído em 100 μl de TE + 0,67% SDS. O eluato combinado (200 μl) foi incubado durante a noite a 65°C para reverter as ligações cruzadas e tratado com 50 μg/ml de RNaseA durante 15 min a 65°C e com 500 μg/ml de proteinase K durante 3 h a 65°C. As amostras foram extraídas com fenol-clorofórmio e precipitadas com etanol. O ADN foi ressuspenso em 25 μl de água. Para maximizar as análises moleculares com ADN imunoprecipitado, os genes candidatos foram amplificados aos pares através de um protocolo optimizado de duplex-PCR, utilizando dois conjuntos diferentes de iniciadores com temperaturas de fusão semelhantes numa única reação.
(Casale et al. 2019)
 

Disruptores celulares ultra-sónicos de elevado desempenho para amostras biológicas

Hielscher Ultrasonics é o seu parceiro de longa experiência quando se trata de ultrasonicators de alto desempenho para rutura celular, lise, extração de proteínas, DNA, RNA e fragmentação de cromatina, bem como outras etapas de preparação de amostras pré-analíticas. Oferecendo um portfólio abrangente de homogeneizadores ultrassónicos de laboratório e unidades de preparação de amostras, a Hielscher tem o dispositivo ultrassónico ideal para a sua aplicação e requisitos biológicos.
Ultrasonizador clássico de tipo sonda com micro-ponta, como o UP200St (200W; ver figura à esquerda) ou uma das unidades de preparação de amostras por ultra-sons VialTweeter OU UP200ST_TD_CupHorn com VialHolder são os modelos preferidos nos laboratórios de investigação e de análise. A sonda de ultra-sons clássica é ideal quando é necessário lisar, extrair ou fragmentar um número reduzido de amostras. As unidades de preparação de amostras VialTweeter e UP200St_TD_CupHorn permitem a sonicação simultânea de até 10 ou 5 frascos, respetivamente.
Se for necessário processar um elevado número de amostras (por exemplo, placas de 96 poços, placas de microtitulação, etc.), o UIP400MTP é a configuração de sonicação ideal. O UIP400MTP funciona como um cuphorn maior, que é preenchido com água e tem espaço suficiente para conter placas de micropoços. Alimentado por um poderoso processador ultrassónico de 400 watts, o UIP400MTP proporciona uma sonicação muito uniforme e intensa de placas de múltiplos poços, a fim de romper as células, lisar amostras, solubilizar pellets, extrair proteínas ou cisalhar o ADN.

Controlo preciso através de software inteligente

Todas as soluções de sonicação Hielscher de 200 watts para cima estão equipadas com um ecrã tátil digital a cores e um software inteligente. Através do protocolo de dados inteligente, todos os parâmetros do processo ultrassónico são automaticamente guardados como ficheiro CSV num cartão SD incorporado, assim que o ultrassonicador é iniciado. Isto torna a investigação e o protocolo muito mais convenientes. Após os ensaios de sonicação ou preparação de amostras, pode simplesmente rever os parâmetros de sonicação de cada execução de sonicação e compará-los.
Através do menu intuitivo, podem ser predefinidos vários parâmetros antes da sonicação: Por exemplo, para controlar a temperatura na amostra e evitar a sua degradação térmica, pode ser definido um limite superior da temperatura da amostra. Um sensor de temperatura conectável, que vem com a unidade de ultra-sons, dá ao processador de ultra-sons um feedback sobre a temperatura real da sonicação. Quando o limite superior de temperatura é atingido, o dispositivo de ultra-sons faz uma pausa até que o limite inferior do ∆T definido seja atingido e começa então a sonicar automaticamente de novo.
Se for necessária a sonicação com uma entrada de energia específica, é possível predefinir a energia ultrassónica final da execução da sonicação. Naturalmente, a pulsação ultra-sónica e o modo de ciclo também podem ser definidos individualmente.
Para reutilizar os seus parâmetros de sonicação mais bem sucedidos, pode guardar vários modos de sonicação (por exemplo, tempo de sonicação, intensidade, modo de ciclo, etc.) como modos predefinidos, para que possam ser fácil e rapidamente iniciados de novo.
Para maior comodidade operacional, todas as unidades ultrassónicas digitais podem ser operadas através do controlo remoto do navegador em qualquer navegador comum (por exemplo, Internet Explorer, Safari, Chrome, etc.). A ligação LAN é uma configuração simples "plug-n-play" e não requer a instalação de software adicional.
Nós, na Hielscher, sabemos que a sonicação bem sucedida de amostras biológicas requer precisão e repetibilidade. Portanto, nós projetamos nossos ultrasonicators como dispositivos inteligentes com todas as caraterísticas que permitem uma preparação de amostra eficiente, confiável, reprodutível e conveniente.

O quadro seguinte dá-lhe uma indicação da capacidade de processamento aproximada dos nossos sistemas de ultra-sons, desde as micro-pontas de ultra-sons e os homogeneizadores de ultra-sons clássicos até aos ultra-sons MultiSample para a preparação conveniente e fiável de numerosas amostras: