Preparação ultrassónica de amostras de C. Elegans

C. elegans, um verme nemátode, é um organismo modelo amplamente utilizado em biologia. A preparação de amostras antes da análise requer lise, extração de proteínas e lípidos, bem como fragmentação de RNA, que podem ser realizadas de forma fiável por sonicação. Os disruptores celulares ultrassónicos são dispositivos fiáveis, sofisticados e fáceis de utilizar para a preparação rápida de amostras de C. elegans.

Preparação ultrassónica de amostras de C. elegans

Caenorhabditis elegans são vermes cilíndricos amplamente utilizados em laboratórios de investigação para estudar a genómica, a biologia do desenvolvimento e doenças. Muitos genes do genoma de C. elegans têm equivalentes funcionais nos seres humanos. Assim, este verme nemátode é um modelo extremamente útil para doenças humanas. Outras vantagens que contribuem para a utilização generalizada de C. elegans são o seu cultivo fácil e económico em placas contendo bactérias (por exemplo, E. coli), a sua transparência, o manuseamento cómodo, bem como a possibilidade de congelar e armazenar os vermes durante um período prolongado.
A análise de proteínas e lípidos é um procedimento habitual nos laboratórios, e a preparação ultrassónica de amostras é o método estabelecido para lisar nemátodes C. elegans em qualquer estádio de desenvolvimento (isto é, embriões, larvas L1-L4, adultos). Como C. elegans também é utilizado como sistema de expressão de proteínas para sobre-expressar proteínas alvo, é necessário um método fiável e reprodutível de lise e extração de proteínas que proporcione elevados rendimentos proteicos. Os sistemas de rutura celular e extração ultrassónicas estão disponíveis como homogeneizadores de sonda e como sonicadores para múltiplas amostras. Para uma preparação cómoda de amostras de todos os tamanhos e em qualquer número, a Hielscher Ultrasonics dispõe do disruptor celular ultrassónico ideal para o seu procedimento laboratorial.

Protocolos ultrassónicos para a rutura e lise de C. Elegans

A homogeneização e a lise ultrassónicas de C. elegans e a subsequente extração de proteínas e lípidos podem ser realizadas através de vários procedimentos, utilizando diferentes tampões de homogeneização e lise, etc. Todos os protocolos de lise têm em comum a necessidade de manter as amostras continuamente em gelo para evitar a degradação das proteínas. A seguir, apresentamos alguns protocolos fiáveis e rápidos de lise e extração ultrassónicas para a preparação de amostras de C. elegans de elevada qualidade contendo proteínas ou lípidos.

Vantagens da lise ultrassónica de C. elegans

• fiável
• reprodutível
• temperatura controlada com precisão
• controlo fiável do processo
• método suave
• fácil de aplicar
• segura

Extração ultrassónica de proteínas de amostras de C. elegans

A lise ultrassónica e a extração de proteínas de vermes C. elegans podem ser realizadas utilizando vários protocolos. A seguir, apresentamos alguns protocolos de lise fiáveis e rápidos para obter resultados reprodutíveis na extração de proteínas.

Preparação rápida de extrato citosólico de vermes C. elegans por sonicação

Com o protocolo seguinte, pode preparar lisados de C. elegans em menos de 30 minutos.
Recolha de C. elegans
Recolha os vermes C. elegans pretendidos para um tubo de 1,5ml contendo solução salina tamponada com fosfato (PBS), ou lave-os de uma placa com 1,5ml de PBS. Centrifugue durante 1min a 2000rpm para formar um sedimento. Mantenha as amostras sempre em gelo.
Em seguida, lave os vermes duas vezes com PBS.
Depois, lave os vermes duas vezes com ddH₂O.
Ressuspenda os vermes em pelo menos 500ul de tampão de homogeneização (HB). As amostras de vermes estão agora prontas para a lise ultrassónica.
Para obter um extrato proteico de maior qualidade, poderá reduzir a contaminação bacteriana lavando os vermes durante 5min em cada um dos seguintes meios: PBS e água ultrapura estéril (ddH₂O), ou realizar uma flotação em sacarose. Mantenha as amostras de vermes continuamente em gelo.

Protocolo de lise ultrassónica de C. elegans

• Certifique-se de que prepara previamente o sonicador, para que o homogeneizador ultrassónico esteja pronto a utilizar (sonda montada, programa de sonicação predefinido). 

Se o seu sonicador estiver montado num suporte, coloque o banho de gelo com os tubos de amostra sob a sonda ultrassónica e introduza a sonda ultrassónica no tubo de 1,5ml.

• Para a lise de C. elegans com o UP200St ou o UP200Ht, a sonicação deve ser realizada utilizando uma microponta (por exemplo, a sonda S26d2 de 2mm; ver imagem à esquerda) a 40% de amplitude durante 1sec, com pausas de 30sec entre os impulsos. 5 ciclos de sonicação de 1 segundo cada, com pausas de 30sec, são ideais para a lise de C. elegans. Se realizar a lise pela primeira vez, pode verificar a sua progressão em pequenas alíquotas da amostra após cada impulso, utilizando um microscópio.
• A lise é concluída com sucesso quando os vermes apresentam rutura. A sonicação excessiva provoca a rutura dos núcleos e torna-se visível quando a amostra fica viscosa ou forma espuma. Para evitar a degradação da amostra, utilize mais impulsos, se necessário. Não aumente a duração de cada ciclo de impulsos ultrassónicos, para obter extratos proteicos de elevada qualidade.
• Clarifique o lisado celular centrifugando os vermes lisados por ultrassons a 14 000rpm durante 10min a 4ºC.
• Em seguida, transfira o sobrenadante para um tubo novo e prepare-o para imunoprecipitação ou outros ensaios.

Nota sobre o tampão de homogeneização: prepare o tampão de homogeneização para o protocolo de lise ultrassónica acima da seguinte forma:

Lise de C. elegans com elevada capacidade de processamento em placas de 96 poços utilizando o sonicador de placas UIP400MTP

Lise de C. elegans (nemátodes adultos)
UIP400MTP a 80% de amplitude, 20 ciclos (cada ciclo de sonicação: 30 sec ligado, 30 sec desligado)
Tampão de lise:

• Opção 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Opção 2) para coimunoprecipitação (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (cocktail completo de inibidores de proteinases)

Fragmentação de DNA com elevada capacidade de processamento
DNA de C. elegans (nemátodes adultos) de 200–300bp: sonicador de placas UIP400MTP – definir 80% de amplitude, 30 impulsos – cada um com 30sec ligado e 30sec desligado

O sonicador de placas UIP400MTP para a preparação de amostras com elevada capacidade de processamento aplica sonicação uniformemente às amostras em placas de múltiplos poços, placas de microtitulação e placas de 96 poços

Lise ultrassónica de C. elegans para ensaios quantitativos de purificação por afinidade

Embriões de C. elegans (∼2 milhões por réplica) foram recolhidos de fresco em triplicado biológico por tratamento de hermafroditas jovens grávidos com lixívia e submetidos a sonicação em gelo (ciclo: 0,5 s, amplitude: 40–45%, 5 impulsos/sessão, 5 sessões, intervalo entre sessões: 30 s; processador ultrassónico UP200S com microponta S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) em tampão de lise (volume total: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% glicerol, mistura de inibidores de proteases, 0,1% Nonidet P-40 Substitute). Após a sonicação, adicionou-se Nonidet P-40 Substitute até 1% e os lisados foram incubados com rotação de ponta a ponta a 4°C durante 30 min, seguida de centrifugação a 20 000 × g durante 20 min a 4°C. O lisado clarificado foi então aspirado sem perturbar a camada lipídica superior e dividido em duas metades, uma para as esferas de agarose anti-GFP e outra para as esferas de controlo bloqueadas (40–50 μl). Após rotação de ponta a ponta a 4°C durante 60–90 min, as esferas foram lavadas uma vez com tampão de lise contendo 0,1% Nonidet P-40 Substitute, seguindo-se duas lavagens com o tampão I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2), com o tampão II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) ou com ambos. Para os ensaios de captura por afinidade de GFP:MBK-2, foram realizadas duas experiências separadas com diferentes condições de lavagem. As proteínas foram eluídas por agitação orbital em 50 μl de ureia 6 m/tioureia 2 M à temperatura ambiente. Para as experiências de captura por afinidade de MBK-1::GFP, as proteínas foram eluídas duas vezes por agitação em 50μl de cloreto de guanidínio 8 m a 90°C, seguida de precipitação com etanol. As amostras de proteínas eluídas foram então digeridas em solução.
(cf. Chen et al., 2016)

Homogeneização e lise ultrassónicas de vermes

Para o procedimento de lise e extração de proteínas de C.elegans, foram recolhidos 30 000 nemátodes do estádio relevante por amostra, lavados em S-basal arrefecido em gelo, concentrados por centrifugação a 1500 rpm durante 2 min., lavados seis vezes com S-basal arrefecido em gelo para remover as bactérias residuais e, em seguida, mantidos em gelo até estarem prontos a utilizar. Para a extração de proteínas, deixou-se que os vermes adultos grávidos formassem um sedimento compacto após a última lavagem com S-basal. Os sedimentos de vermes foram então ressuspensos em 1 ml de tampão de extração arrefecido em gelo [20 mM fosfato de potássio, pH 7,4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, inibidores de proteases (Sigma P2714)] e processados imediatamente.
∼30 000 vermes adultos grávidos (correspondentes a ∼100 mg de peso húmido) foram submetidos a sonicação em gelo utilizando um sonicador de sonda (por exemplo, UP50H com microponta MS2) a 40% de amplitude durante 10 ciclos de 3 sec ligado e 30 sec desligado, em 1 ml de tampão de extração arrefecido em gelo. (cf. Baskharan et al. 2012)

Extração ultrassónica de lípidos de C. elegans

Na lipidómica, um ramo da metabolómica, caracteriza-se e analisa-se o conjunto de lípidos dos sistemas biológicos. C. elegans é amplamente utilizado em lipidómica para investigar a interação dos lípidos metabólicos e os seus efeitos na saúde e na longevidade.
A lise e a extração ultrassónicas são utilizadas para libertar lípidos, como os esfingolípidos, de embriões, larvas e vermes adultos de C. elegans. A sonicação é utilizada para preparar homogenatos de vermes e, posteriormente, extrair os lípidos da amostra.
Protocolo de extração ultrassónica de lípidos de C. elegans
Descongele o sedimento de C. elegans em gelo e ressuspenda-o com 0,5 ml de ultrawater. Submeta as amostras de C. elegans a sonicação em tubos de ensaio de 1,5mL, mantendo as amostras continuamente em gelo.
A sonicação pode ser realizada utilizando um sonicador de sonda, como o UP200Ht, a unidade ultrassónica de preparação de amostras VialTweeter (sonicação simultânea de 10 amostras) ou o UIP400MTP (para a sonicação de placas de múltiplos poços, como placas de 96 poços). Para a lise ultrassónica com o UP200Ht, utilize a microponta S26d2. Predefina o modo de ciclo ultrassónico no menu digital. Defina a amplitude para 10% e o modo de ciclo de sonicação para 20 ciclos de impulsos de 2 sec, com uma pausa de 30 sec. entre cada série de impulsos ultrassónicos.
Transfira os sobrenadantes para tubos de vidro com tampa de rosca. Realize a extração de Folch adicionando 1 ml de ultrawater a cada tubo de vidro, seguido da adição de 6 ml de mistura de clorofórmio/metanol (proporção = 2:1) a cada tubo de vidro.
Agite cada tubo de vidro num agitador de vórtex durante 30 sec, 4 vezes. Centrifugue os tubos a 1 258 x g durante 15 min (Eppendorf, 5810 R) para melhorar ainda mais a separação de fases. Transfira a fração hidrofóbica inferior para um tubo de vidro limpo com uma pipeta de Pasteur de vidro. Seque a fração hidrofóbica inferior sob fluxo de azoto num evaporador de azoto. Armazene o sedimento seco num congelador a -80 °C até à utilização. 


Preparação ultrassónica de lisados de vermes

Lisado de vermes: os vermes no estádio L4 foram recolhidos e lavados três vezes com tampão M9 (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl e 0,87 mM MgSO₄) para remover todas as bactérias. Após remover o máximo possível de tampão M9, os vermes foram ressuspensos em tampão de lise: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM fosfato de β-glicerol, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM fluoreto de sódio, 1 mM ortovanadato de sódio, 5 mM pirofosfato de sódio, 0,2 mM fluoreto de fenilmetanossulfonilo e inibidor de proteases. Os vermes foram congelados em azoto líquido e descongelados a 37°C três vezes; em seguida, foram submetidos a sonicação sobre gelo seco com uma unidade ultrassónica VialTweeter para a preparação simultânea de 10 tubos de amostra. A sonicação foi realizada a 50% de amplitude em 10 ciclos de 2 sec., com uma pausa de 30 sec entre as séries de impulsos de sonicação. Posteriormente, as amostras foram centrifugadas a 12 000 rpm a 4°C durante 15 min. O sobrenadante foi recolhido e armazenado a -70°C. Foi utilizada uma alíquota para a quantificação de proteínas pelo ensaio de Bradford.
Determinação de glutationa total, GSH e GSSG: para a quantificação de glutationa, os lisados e a determinação foram realizados no mesmo dia. As larvas L4 alimentadas com glucose e as larvas de controlo foram recolhidas e lavadas três vezes com tampão M9. Após remover o máximo possível de tampão M9, os vermes foram ressuspensos em ácido metafosfórico arrefecido em gelo (5% w/v) e, em seguida, submetidos a sonicação em gelo com um VialTweeter ultrassónico a 50% de amplitude em dez ciclos de sonicação de 2 sec., com uma pausa de 30 sec. entre cada ciclo. Posteriormente, foram centrifugados a 12 000 rpm a 4 ̊C durante 15 min.
(cf. Alcántar-Fernández et al., 2018)

Preparação de amostras de C. elegans antes da imunoprecipitação e do Western blotting

Resumidamente, para os extratos embrionários, as larvas L1 de C. elegans foram cultivadas até à idade adulta em culturas líquidas de meio S em grande escala. Os embriões foram recolhidos utilizando o método padrão com lixívia e suspensos em tampão de lise (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% glicerol, 0,05% NP-40, 1􏰅 cocktail de inibidores de proteases e 1􏰅 cocktail de inibidores de fosfatases I e II), rapidamente congelados em azoto líquido e lisados por rutura celular ultrassónica utilizando um sonicador com microponta, como o UP200Ht com S26d2, com 10 impulsos ao longo de 10 s a 30% de amplitude. Se for necessário preparar um maior número de amostras, recomenda-se o dispositivo ultrassónico VialTweeter ou o sonicador para múltiplas amostras UIP400MTP para placas de poços. Após a sonicação, os extratos foram pré-clarificados por centrifugação a 30 000g durante 20 min a 4°C. O extrato pré-clarificado (300µg de proteína total) foi incubado com 40µ􏰂g de anticorpo anti-CDC-25.1 purificado por afinidade (este estudo), ligado covalentemente a proteína A-agarose, ou, como controlo, foi utilizada uma quantidade semelhante de imunoglobulina (Ig)G de coelho ligada covalentemente a proteína A-agarose, num volume total de 200µl de tampão de lise contendo 1% NP-40, cuja inclusão reduziu a ligação inespecífica das proteínas à matriz. As amostras foram colocadas em rotação durante 1 h a 4°C, as esferas foram lavadas três vezes com tampão de lise e a eluição foi realizada com 30µl de glicina/HCl e 200 mM NaCl, pH 2,2. Após a imunoprecipitação, os eluatos foram diluídos em 30µ􏰂l de tampão de amostra SDS, aquecidos a 95°C durante 4 min e, normalmente, 3% do total para a amostra inicial e 30% para os eluatos foram aplicados a SDS-PAGE, seguido de Western blotting com anticorpos anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubiquitina (1:1000), anti-GSK3􏰁 (1:500) ou anti-􏰁β-actina (1:2000). Quando os extratos não foram submetidos a imunoprecipitação, a mesma quantidade de proteína total proveniente desses extratos foi ressuspensa em tampão de amostra SDS, aquecida a 95°C e, em seguida, diretamente aplicada a SDS-PAGE e analisada por Western blotting. (cf. Segref et al. 2020)

Lise ultrassónica com controlo preciso da temperatura

O controlo preciso e fiável da temperatura é crucial no manuseamento de amostras biológicas. As temperaturas elevadas desencadeiam a degradação das proteínas nas amostras induzida pelo calor.
Tal como todas as técnicas mecânicas de preparação de amostras, a sonicação gera calor. No entanto, a temperatura das amostras pode ser bem controlada quando se utiliza o VialTweeter. Apresentamos várias opções para monitorizar e controlar a temperatura das suas amostras enquanto as prepara com o VialTweeter e o VialPress para análise.

1. Monitorização da temperatura da amostra: o processador ultrassónico UP200St, que aciona o VialTweeter, está equipado com software inteligente e um sensor de temperatura conectável. Ligue o sensor de temperatura ao UP200St e introduza a ponta do sensor de temperatura num dos tubos de amostra. Através do ecrã tátil digital a cores, pode definir no menu do UP200St um intervalo de temperatura específico para a sonicação da sua amostra. O sonicador para automaticamente quando a temperatura máxima é atingida e permanece em pausa até a temperatura da amostra descer para o valor inferior do intervalo de temperatura ∆ definido. Em seguida, a sonicação recomeça automaticamente. Esta funcionalidade inteligente evita a degradação induzida pelo calor.
2. O bloco VialTweeter pode ser pré-arrefecido. Coloque o bloco VialTweeter (apenas o sonotrodo, sem o transdutor!) no frigorífico ou no congelador para pré-arrefecer o bloco de titânio, o que ajuda a retardar a subida da temperatura na amostra. Se possível, a própria amostra também pode ser pré-arrefecida.
3. Utilize gelo seco para arrefecer durante a sonicação. Utilize um tabuleiro pouco profundo cheio de gelo seco e coloque o VialTweeter sobre o gelo seco, para que o calor se possa dissipar rapidamente.

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A Hielscher Ultrasonics é um fabricante com longa experiência em disruptores celulares e homogeneizadores ultrassónicos de elevado desempenho para laboratórios, sistemas de bancada e sistemas à escala industrial. A dimensão da sua cultura de células bacterianas, o seu objetivo de investigação ou produção e o volume de células a processar por hora ou por dia são fatores essenciais para encontrar o disruptor celular ultrassónico adequado à sua aplicação.
A Hielscher Ultrasonics oferece várias soluções para a sonicação simultânea de múltiplas amostras (até 10 frascos), bem como de amostras em grande número (isto é, placas de microtitulação / placas de 96 poços), desde o clássico sonicador laboratorial de sonda com diferentes níveis de potência de 50 a 400 watts até processadores ultrassónicos totalmente industriais com até 16 000watts por unidade para a rutura celular comercial e a extração de proteínas em produção de grande escala. Todos os sonicadores Hielscher são concebidos para funcionamento 24/7/365 à carga máxima. A robustez e a fiabilidade são características fundamentais dos nossos dispositivos ultrassónicos.
Todos os homogeneizadores ultrassónicos digitais estão equipados com software inteligente, ecrã tátil a cores e registo automático de dados, que tornam o dispositivo ultrassónico numa ferramenta de trabalho prática em laboratórios e instalações de produção.
Indique-nos que tipo de células, que volume, com que frequência e com que objetivo precisa de processar as suas amostras biológicas. Recomendaremos o disruptor celular ultrassónico mais adequado aos requisitos do seu processo.

A tabela abaixo dá-lhe uma indicação da capacidade de processamento aproximada dos nossos sistemas ultrassónicos, desde homogeneizadores compactos de mão e sonicadores para múltiplas amostras até processadores ultrassónicos industriais para aplicações comerciais: