Preparação ultrassônica de amostras de C. elegans

C. elegans, um verme nematóide, é um organismo modelo amplamente utilizado em biologia. A preparação da amostra antes da análise requer lise, extração de proteínas e lipídios, bem como fragmentação de RNA, que pode ser realizada de forma confiável por meio de sonicação. Os disruptores celulares ultrassônicos são dispositivos confiáveis, sofisticados e fáceis de usar para a preparação rápida de amostras de C. elegans.

Preparação ultrassônica de amostras de C. elegans

C. elegans são lombrigas, amplamente utilizadas em laboratórios de pesquisa para investigar genômica, biologia do desenvolvimento e doenças. Muitos genes no genoma de C. elegans têm contrapartes funcionais em humanos. Assim, o verme nematóide é um modelo extremamente útil para doenças humanas. Outras vantagens para o amplo uso de C. elegans são seu cultivo fácil e barato em placas contendo bactérias (por exemplo, E. coli), sua transparência, manuseio conveniente, bem como a possibilidade de congelar e armazenar os vermes por um período mais longo.
A análise de proteínas e lipídios são procedimentos regulares em laboratórios e a preparação de amostras ultrassônicas é o método estabelecido para lisar nematóides C. elegans em todos os estágios de desenvolvimento (ou seja, embriões, larvas L1-L4, adultos). Como C. elegans também é usado como sistema de expressão de proteínas para superexpressar proteínas-alvo, é necessário um método confiável e reprodutível de lise e extração de proteínas, que forneça altos rendimentos de proteína. Os sistemas ultrassônicos de ruptura e extração de células estão disponíveis como homogeneizadores do tipo sonda e como ultrassonicadores de várias amostras. Atendendo à preparação conveniente de amostras e a todos os tipos de números de tamanhos de amostra, a Hielscher Ultrasonics tem o disruptor de células ultrassônico ideal para o seu procedimento de laboratório.

Protocolos ultrassônicos para ruptura e lise de C. elegans

A homogeneização ultrassônica e a lise de C. elegans e a subsequente extração de proteínas e lipídios podem ser realizadas usando procedimentos variados, usando diferentes tampões de homogeneização e lise, etc. Todos os protocolos de lise têm em comum que as amostras devem ser continuamente mantidas em gelo para evitar a degradação da proteína. Abaixo, apresentamos alguns protocolos de lise e extração ultrassônica confiáveis e rápidos para a preparação de amostras de C. elegans contendo proteínas ou lipídios de alta qualidade.

Vantagens da lise ultrassônica de C. elegans

• Confiável
• Reprodutíveis
• com precisãocom controle de temperatura
• Controle de processo confiável
• Método suave
• Fácil de aplicar
• Seguro

Extração ultrassônica de proteínas de amostras de C. elegans

A lise ultrassônica e a extração de proteínas de vermes C. elegans podem ser realizadas usando vários protocolos. Abaixo, apresentamos alguns protocolos de lise confiáveis e rápidos para resultados de extração de proteínas reprodutíveis.

Preparação rápida de extrato citosólico de vermes C. elegans por sonicação

Com o protocolo a seguir, você pode preparar lisados de C. elegans em menos de 30 minutos.
Coleção de C. elegans
Escolha os vermes C. elegans desejados em um tubo de 1,5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou lave-os de um prato com 1,5 ml de PBS. Centrifugue por 1min a 2000rpm para granular. Mantenha as amostras sempre no gelo.
Em seguida, lave as minhocas duas vezes com PBS.
Depois, lave as minhocas duas vezes com ddH₂O.
Ressuspenda os vermes em pelo menos 500ul de tampão de homogeneização (HB). As amostras de vermes estão agora prontas para lise ultrassônica.
Para uma maior qualidade do extrato de proteína, você pode querer reduzir a contaminação bacteriana lavando as minhocas por 5 minutos cada em PBS e água estéril e ultrapura (ddH₂O) ou realizar a flutuação da sacarose. Mantenha as amostras de minhocas continuamente no gelo.

Protocolo ultrassônico da lise do elegans do C.

• Certifique-se de preparar o ultrassônico antecipadamente para que o homogeneizador ultrassônico esteja pronto para uso (montado na sonda, programa de sonicação predefinido).

Se o seu ultrassônico for montado em suporte, coloque o banho de gelo com seus sample tubos sob a sonda ultrassônica e insira a sonda ultrassônica no tubo de 1.5 ml.

• Para a lise de C. elegans com UP200St ou UP200Ht, a ultrassonografia deve ser realizada usando uma microponta (por exemplo, sonda de 2 mm S26d2; veja a figura à esquerda) a 40% de amplitude por 1 segundo com pausas de 30 segundos entre elas. 5 ciclos de sonicação para cada 1 segundo com pausas de 30 segundos são ideais para a lise de C. elegans. Se você realizar a lise pela primeira vez, poderá verificar a progressão da lise em pequenas alíquotas da amostra após cada pulso usando um microscópio.
• A lise é concluída com sucesso quando os vermes são interrompidos. A ultrassonografia resulta na quebra dos núcleos e torna-se visível quando a amostra fica viscosa ou espuma. Para evitar a degradação da amostra, use mais pulsos, se necessário. Não aumente o tempo de cada ciclo de pulso ultrassônico para obter extratos de proteína de alta qualidade.
• Limpar lisado celular centrifugando os vermes lisados por ultrassom a 14.000 rpm por 10 min a 4ºC.
• Em seguida, transfira o sobrenadante para um tubo novo e prepare-se para imunoprecipitação ou outros ensaios.

Nota para tampão de homogeneização: Prepare o tampão de homogeneização para o protocolo de lise ultrassônica acima da seguinte forma:

Lise de alto rendimento de C. elegans em placas de 96 poços usando o UIP400MTP Plate Sonicator

C. elegans Lysis (nematóides adultos)
UIP400MTP 80% de amplitude, 20 ciclos (cada ciclo de sonicação: 30 segundos LIGADO, 30 segundos DESLIGADO)
Tampão de lise:

• Opção 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Opção 2) para co-imunoprecipitação (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5% NP-40 (coquetel completo de inibidores de proteinase)

Fragmentação de DNA de alto rendimento
C. elegans (nematóides adultos) DNA 200-300bp: sonicador de placa UIP400MTP – Defina 80% de amplitude, 30 pulsos – a cada 30 segundos ligado, 30 segundos desligado

UIP400MTP Plate Sonicator para preparação de amostras de alto rendimento sonica uniformemente as amostras em placas de microtitulação de vários poços e placas de 96 poços

Lise ultrassônica de C. elegans para ensaios quantitativos de purificação de afinidade

Embriões de C. elegans (∼2 milhões por repetição) foram recém-colhidos em triplicata biológico por branqueamento de hermafroditas grávidas jovens e sonicados em gelo (ciclo: 0,5 s, amplitude: 40–45%, 5 golpes/sessão, 5 sessões, intervalo entre as sessões: 30 sessões; Processador ultrassônico UP200S com micro-ponta S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) em tampão de lise (volume total: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% de glicerol, mistura de inibidores de protease, 0,1% de substituto Nonidet P-40). Após a sonicação, o substituto Nonidet P-40 foi adicionado até 1% e os lisados foram incubados com rotação da cabeça sobre a cauda a 4 ° C por 30 min, seguido de centrifugação a 20.000 × g por 20 min a 4 ° C. O lisado limpo foi então aspirado sem perturbar a camada lipídica superior e dividido ao meio nos grânulos de agarose anti-GFP ou nos grânulos de controle bloqueados (40-50 μl). Após a rotação da cabeça sobre a cauda a 4 ° C por 60-90 min, os grânulos foram lavados uma vez com tampão de lise contendo 0,1% de substituto Nonidet P-40, seguido por duas vezes de lavagem em tampão I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) ou tampão II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) ou ambos. Para pull-downs GFP:MBK-2, dois experimentos separados foram realizados usando diferentes condições de lavagem. As proteínas foram eluídas por agitação orbital em 50 μl de ureia 6 m/tioureia 2 M à temperatura ambiente. Para os experimentos de pull-down MBK-1::GFP, as proteínas foram eluídas duas vezes por agitação em 50μl de cloreto de guanidínio 8 m a 90°C, seguido de precipitação de etanol. As amostras de proteína eluída foram então digeridas em solução.
(cf. Chen et al., 2016)

Homogeneização e lise ultrassônica de sem-fim

Para o procedimento de lise de C. elegans e extração de proteínas, 30.000 nemotodes do estágio relevante foram coletados por amostra e lavados em S-basal gelado, concentrados por centrifugação a 1500 rpm por 2 min., lavados seis vezes com S-basal gelado para remover bactérias residuais e depois armazenados em gelo até que estivessem prontos para uso. Para a extração de proteínas, os vermes adultos grávidas foram autorizados a formar um pellet compacto após a última lavagem basal em S. Os pellets de minhoca foram então ressuspensos em 1 ml de tampão de extração gelado [fosfato de potássio 20 mM, pH 7,4, EDTA 2 mM, Triton-X-100 a 1%, inibidores de protease (Sigma P2714)] e processados imediatamente.
∼30.000 vermes adultos grávidas (correspondendo a ∼100 mg de peso úmido) foram sonicados em gelo usando um ultrassônico do tipo sonda (por exemplo, UP50H com microtip MS2) a 40% de amplitude por 10 ciclos de 3 segundos ligados, 30 segundos desligados, em 1 ml de tampão de extração gelado. (cf. Baskharan et al. 2012)

Extração ultrassônica de lipídios de C. elegans

Na lipidômica, um ramo da metabolômica, o complemento lipídico dos sistemas biológicos é caracterizado e analisado. C. elegans são amplamente utilizados em lipidômica para investigar a interação de lipídios metabólicos e seus efeitos na saúde e expectativa de vida.
A lise e extração ultrassônica são usadas para liberar lipídios, como esfingolipídios, de embriões, larvas e vermes adultos de C. elegans. A ultrassonografia é usada para preparar homogeneizados de vermes e, posteriormente, para extrair os lipídios da amostra.
Protocolo para extração ultrassônica de lipídios de C. elegans
Descongelar o pellet de C. elegans no gelo e ressuspender com 0,5 ml de ultrawater. 
Sonicar as amostras de C. elegans em tubos de ensaio de 1,5 ml, mantendo as amostras continuamente em gelo.
A sonicação pode ser realizada usando um sonda-ultrassom, como o UP200Ht, a unidade ultrassônica da preparação da amostra VialTweeter (sonicação simultânea de 10 amostras) ou o UIP400MTP (para a sonicação de placas de vários poços, como placas de 96 poços). Para lise ultrassônica com o UP200Ht, use a microponta S26d2. Pré-defina o modo de ciclo ultrassônico no menu digital. Defina a amplitude para 10% e o modo de ciclo de sonicação de pulsos de 2 segundos de 20 ciclos com uma pausa de 30 segundos.
Transfira os sobrenadantes para tubos de vidro com tampa de rosca. 
Realize a extração de Folch adicionando 1 ml de ultraágua a cada tubo de vidro, seguido pela adição de 6 ml de mistura de clorofórmio? metanol (proporção = 2: 1) a cada tubo de vidro.
Vortex cada tubo de vidro por 30 segundos por 4 vezes. 
Centrifugue os tubos a 1.258 x g por 15 min (Eppendorf, 5810 R) para melhorar ainda mais a separação de fases. 
Transferir a fração hidrofóbica inferior para um tubo de vidro limpo com uma pipeta de vidro Pasteur. 
Secar a fracção hidrofóbica inferior sob fluxo de azoto num evaporador de azoto. 
Conservar o pellet seco num congelador a -80 °C até à utilização.

Preparação ultrassônica de lisados de sem-fim

Lisado de vermes: Vermes de estágio L4 foram colhidos e lavados três vezes com tampão M9 (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM de NaCl e 0,87 mM de MgSO₄) para remover todas as bactérias. Após a remoção o máximo possível do tampão M9, os vermes foram ressuspensos em tampão de lise: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM de fosfato β-glicerol, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM de fluoreto de sódio, 1 mM de ortovanadato de sódio, 5 mM de pirofosfato de sódio, 0,2 mM de fenilmetanossulfonilfluoreto e inibidor de protease. Os vermes foram congelados em nitrogênio líquido e descongelados a 37 ° C por três vezes, depois os vermes foram sonicados em gelo seco com uma unidade VialTweeter ultrassônica para a preparação simultânea de 10 tubos de amostra. A sonicação foi realizada a 50% de amplitude em 10 ciclos de 2 seg. com pausa de 30 segundos entre as rajadas de sonicação. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 12000 rpm a 4°C por 15 min. O sobrenadante foi coletado e armazenado a -70°C. Uma alíquota foi usada para quantificação de proteínas pelo ensaio de Bradford.
Determinação de glutationa total, GSH e GSSG: Para a quantificação da glutationa, os lisados e a determinação foram feitos no mesmo dia. Larvas L4 alimentadas com glicose e controle foram colhidas e lavadas com tampão M9 três vezes. Depois de remover o máximo possível do tampão M9, os vermes foram ressuspensos em ácido metafosfórico gelado (5% p? v), então os vermes foram sonicados em gelo com um VialTweeter ultrassônico a 50% de amplitude em dez ciclos de sonicação de 2 seg. com 30 seg. pausa entre cada ciclo. Em seguida, centrifugado a 12000 rpm a 4 ̊C por 15 min.
(cf. Alcántar-Fernández et al., 2018)

Preparação de amostras de C. elegans antes da imunoprecipitação e Western Blotting

Em resumo, para extratos embrionários, as larvas L1 de C. elegans foram cultivadas em culturas líquidas de S-meio em larga escala até a idade adulta. Os embriões foram coletados usando o método de alvejante padrão e suspensos em tampão de lise (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% de glicerol, 0,05% NP-40, 1 coquetel de inibidores de protease e 1 coquetel de inibidores de fosfatase I e II), rapidamente congelados em nitrogênio líquido e lisados por ruptura celular ultrassônica usando um ultrassônico com microponta como o UP200Ht com S26d2 por 10 pulsos em 10 s a 30% de amplitude. Se um número maior de amostras deve ser preparado, o ultrassônico VialTweeter ou o UIP400MTP MultiSample-Ultrasonicator para placas de poço. Após a sonicação, os extratos foram pré-limpos por centrifugação a 30.000g por 20 min a 4°C. O extrato pré-limpo (300μg de proteína total) foi incubado com 40μ�μg de anticorpo purificado por afinidade anti-CDC-25.1 (este estudo) reticulado à proteína A-agarose, ou como controle, uma quantidade semelhante de imunoglobulina (Ig)G de coelho reticulada à proteína A-agarose foi usada em um volume total de 200μl de tampão de lise contendo 1% de NP-40, cuja inclusão reduziu a ligação inespecífica de proteínas à matriz. As amostras foram rotacionadas por 1 h a 4°C, os grânulos foram lavados três vezes com tampão de lise e eluídos com 30μl de glicina/HCl e 200 mM de NaCl, pH 2,2. Após a imunoprecipitação, os eluatos foram diluídos em 30μμαl de tampão de amostra de SDS, aquecidos a 95°C por 4 min, e tipicamente 3% do total para entrada e 30% para os eluatos foram aplicados a SDS-PAGE seguido de Western blotting com anticorpos anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubiquitina (1:1000), anti-GSK3��� (1:500) ou anti-a β conchego (1:2000). Quando os extratos não foram submetidos à imunoprecipitação, a mesma quantidade de proteína total derivada desses extratos foi ressuspensa em tampão de amostra SDS, aquecida a 95 ° C e, em seguida, aplicada diretamente a SDS-PAGE e analisada por Western blotting. (cf. Segref et al. 2020)

Lise ultrassônica sob controle de temperatura Prescise

O controle preciso e confiável da temperatura é crucial ao manusear amostras biológicas. Altas temperaturas iniciam a degradação de proteínas induzida termicamente nas amostras.
Como todas as técnicas mecânicas de preparação de amostras, a sonicação cria calor. No entanto, a temperatura das amostras pode ser bem controlada ao usar o VialTweeter. Apresentamos-lhe várias opções para monitorizar e controlar a temperatura das suas amostras enquanto as prepara com o VialTweeter e o VialPress para análise.

1. Monitoramento da temperatura da amostra: O processador ultrassônico UP200St, que aciona o VialTweeter, está equipado com um software inteligente e um sensor de temperatura conectável. Conecte o sensor de temperatura no UP200St e insira a ponta do sensor de temperatura em um dos tubos de amostra. Através do ecrã tátil digital colorido, pode definir no menu do UP200St uma gama de temperaturas específica para a sonicação da sua amostra. O ultrassônico irá parar automaticamente quando a temperatura máxima for atingida e pausar até que a temperatura da amostra caia para o valor mais baixo da temperatura definida ∆. Em seguida, a sonicação começa automaticamente novamente. Esse recurso inteligente evita a degradação induzida pelo calor.
2. O bloco VialTweeter pode ser pré-resfriado. Coloque o bloco VialTweeter (apenas o sonotrodo sem transdutor!) na geladeira ou freezer para pré-resfriar o bloco de titânio ajuda a adiar o aumento da temperatura na amostra. Se possível, a própria amostra também pode ser pré-resfriada.
3. Use gelo seco para esfriar durante a sonicação. Use uma bandeja rasa cheia de gelo seco e coloque o VialTweeter no gelo seco para que o calor possa se dissipar rapidamente.

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A Hielscher Ultrasonics é um fabricante experiente de longa data de desreguladores e homogeneizadores de células ultrassônicas de alto desempenho para laboratórios, sistemas de bancada e em escala industrial. O tamanho da cultura de células bacterianas, sua meta de pesquisa ou produção e o volume de células a serem processadas por hora ou dia são fatores essenciais para encontrar o disruptor de células ultrassônico certo para sua aplicação.
A Hielscher Ultrasonics oferece várias soluções para a sonicação simultânea de amostras múltiplas (até 10 frascos), bem como amostras de massa (ou seja, placas de microtitulação? placas de 96 poços), o clássico ultrassônico de laboratório do tipo sonda com diferentes níveis de potência de 50 a 400 watts para processadores ultrassônicos totalmente industriais com até 16.000 watts por unidade para ruptura celular comercial e extração de proteínas em grande produção. Todos os ultrasonicadores Hielscher são construídos para a operação 24/7/365 sob carga total. Robustez e confiabilidade são características centrais de nossos dispositivos ultrassônicos.
Todos os homogeneizadores ultrassônicos digitais são equipados com software inteligente, display sensível ao toque colorido e protocolo automático de dados, o que torna o dispositivo ultrassônico uma ferramenta de trabalho conveniente em laboratórios e instalações de produção.
Deixe-nos saber, que tipo de células, que volume, com que frequência e com que alvo você tem para processar suas amostras biológicas. Recomendaremos o disruptor de célula ultrassônico mais adequado para seus requisitos de processo.

A tabela abaixo fornece uma indicação da capacidade de processamento aproximada de nossos sistemas ultrassônicos, desde homogeneizadores portáteis compactos e ultrassônicos MultiSample até processadores ultrassônicos industriais para aplicações comerciais: