Preparação ultra-sónica de amostras de C. Elegans

C. elegans, um verme nemátodo, é um organismo modelo amplamente utilizado em biologia. A preparação de amostras antes da análise requer lise, extração de proteínas e lípidos, bem como fragmentação de ARN, que pode ser realizada de forma fiável através de sonicação. Os disruptores ultrassónicos de células são dispositivos fiáveis, sofisticados e fáceis de utilizar para a preparação rápida de amostras de C. elegans.

Preparação ultra-sónica de amostras de C. Elegans

Os C. elegans são vermes redondos, amplamente utilizados em laboratórios de investigação para investigar a genómica, a biologia do desenvolvimento e as doenças. Muitos genes do genoma de C. elegans têm equivalentes funcionais em humanos. Assim, o verme nemátodo é um modelo extremamente útil para as doenças humanas. Outras vantagens para a ampla utilização de C. elegans são o seu cultivo fácil e barato em placas contendo bactérias (por exemplo, E. coli), a sua transparência, o manuseamento conveniente, bem como a possibilidade de congelar e armazenar os vermes durante um período mais longo.
A análise de proteínas e lípidos é um procedimento regular nos laboratórios e a preparação de amostras por ultra-sons é o método estabelecido para lisar os nemátodos C. elegans em todas as fases de desenvolvimento (ou seja, embriões, larvas L1-L4, adultos). Uma vez que o C. elegans é também utilizado como sistema de expressão proteica para a sobre-expressão de proteínas específicas, é necessário um método fiável e reprodutível de lise e extração de proteínas, que proporcione um elevado rendimento proteico. Os sistemas ultra-sónicos de rompimento e extração de células estão disponíveis como homogeneizadores do tipo sonda e como ultra-sons para várias amostras. Atendendo à preparação conveniente de amostras e a todos os tipos de números de tamanhos de amostras, a Hielscher Ultrasonics tem o disruptor de células ultrassónico ideal para o seu procedimento de laboratório.

Protocolos ultra-sónicos para a disrupção e lise de C. Elegans

A homogeneização ultra-sónica e a lise de C. elegans e a subsequente extração de proteínas e lípidos podem ser realizadas através de procedimentos variados, utilizando diferentes tampões de homogeneização e de lise, etc. Todos os protocolos de lise têm em comum o facto de as amostras terem de ser continuamente mantidas em gelo para evitar a degradação das proteínas. A seguir, apresentamos alguns protocolos fiáveis e rápidos de lise e extração por ultra-sons para a preparação de amostras de C. elegans contendo proteínas ou lípidos de alta qualidade.

Vantagens da lise ultra-sónica de C. elegans

• Fiável
• reproduzível
• com controlo preciso da temperatura
• controlo fiável do processo
• método suave
• fácil de aplicar
• seguro

Extração ultra-sónica de proteínas a partir de amostras de C. elegans

A lise ultra-sónica e a extração de proteínas de vermes C. elegans podem ser realizadas utilizando vários protocolos. Em seguida, apresentamos alguns protocolos de lise fiáveis e rápidos para obter resultados reprodutíveis de extração de proteínas.

Preparação rápida de extrato citosólico de vermes C. elegans por sonicação

Com o seguinte protocolo, é possível preparar lisados de C. elegans em menos de 30 minutos.
Coleção de C. elegans
Colher os vermes C. elegans desejados para um tubo de 1,5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou lavá-los de uma placa com 1,5 ml de PBS. Centrifugar durante 1min a 2000rpm para obter um pellet. Manter as amostras sempre em gelo.
Em seguida, lavar os vermes duas vezes com PBS.
Em seguida, lavar os vermes duas vezes com ddH₂O.
Ressuspender os vermes em pelo menos 500ul de tampão de homogeneização (HB). As amostras de vermes estão agora prontas para lise por ultra-sons.
Para obter uma melhor qualidade do extrato de proteínas, poderá querer reduzir a contaminação bacteriana lavando os vermes durante 5 minutos em PBS e em água ultrapura esterilizada (ddH₂O) ou efetuar a flutuação em sacarose. Manter as amostras de vermes continuamente em gelo.

Protocolo de Lise Ultrassónica de C. elegans

• Certifique-se de que prepara o ultrassom com antecedência para que o homogeneizador ultrassónico esteja pronto a ser utilizado (sonda montada, programa de sonicação pré-definido).

Se o seu aparelho de ultra-sons estiver montado num suporte, coloque o banho de gelo com os tubos de amostra sob a sonda de ultra-sons e insira a sonda de ultra-sons no tubo de 1,5 ml.

• Para a lise de C. elegans com a UP200St ou UP200Ht, a ultra-sons deve ser realizada utilizando uma microponta (por exemplo, sonda de 2 mm S26d2; ver imagem à esquerda) a 40% de amplitude durante 1 segundo com pausas de 30 segundos entre elas. 5 ciclos de sonicação por cada 1 segundo com pausas de 30 segundos são ideais para a lise de C. elegans. Se efetuar a lise pela primeira vez, pode verificar a progressão da lise em pequenas alíquotas da amostra após cada impulso, utilizando um microscópio.
• A lise é concluída com êxito quando os vermes são rompidos. A sobre-sonicação resulta na quebra de núcleos e torna-se visível quando a amostra fica viscosa ou espumosa. Para evitar a degradação da amostra, utilize mais impulsos, se necessário. Não aumente o tempo de cada ciclo de impulsos ultra-sónicos para obter extractos de proteínas de alta qualidade.
• Limpar o lisado celular centrifugando os vermes lisados por ultra-sons a 14 000 rpm durante 10 minutos a 4ºC.
• Em seguida, transferir o sobrenadante para um novo tubo e preparar a imunoprecipitação ou outros ensaios.

Nota para o tampão de homogeneização: Preparar o tampão de homogeneização para o protocolo de lise por ultra-sons acima descrito da seguinte forma:

Lise de alto rendimento de C. elegans em placas de 96 poços utilizando o Sonicador de Placas UIP400MTP

C. elegans Lise (nemátodos adultos)
UIP400MTP Amplitude de 80%, 20 ciclos (cada ciclo de sonicação: 30 seg. ligado, 30 seg. desligado)
Tampão de lise:

• Opção 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Opção 2) para co-imunoprecipitação (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (cocktail completo de inibidores de proteinase)

Fragmentação de DNA de alto rendimento
ADN de C. elegans (nemátodos adultos) 200-300 pb: Sonicador de placas UIP400MTP – definir 80% de amplitude, 30 impulsos – cada 30 seg. ligado, 30 seg. desligado

O Sonicador de Placas UIP400MTP para preparação de amostras de elevado rendimento sonicam uniformemente as amostras em placas de microtitulação e placas de 96 poços

Lise ultra-sónica de C. elegans para ensaios quantitativos de purificação por afinidade

Os embriões de C. elegans (∼2 milhões por réplica) foram recentemente colhidos em triplicado biológico por branqueamento de hermafroditas jovens e gravídicos e sonicados em gelo (ciclo: 0,5 s, amplitude: 40-45%, 5 golpes/sessão, 5 sessões, intervalo entre sessões: 30 s; Processador ultrassónico UP200S com micro-ponta S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) em tampão de lise (volume total: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% glicerol, mistura de inibidores de protease, 0,1% Nonidet P-40 Substitute). Após a sonicação, adicionou-se Nonidet P-40 Substitute até 1% e os lisados foram incubados com rotação cabeça-cauda a 4°C durante 30 minutos, seguida de centrifugação a 20 000 × g durante 20 minutos a 4°C. O lisado desobstruído foi então aspirado sem perturbar a camada lipídica superior e dividido ao meio nas esferas de agarose anti-GFP ou nas esferas de controlo bloqueadas (40-50 μl). Após rotação cabeça-cauda a 4°C durante 60-90 min, as esferas foram lavadas uma vez com tampão de lise contendo 0,1% de substituto Nonidet P-40, seguido de duas lavagens em tampão I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) ou tampão II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) ou ambos. Para os pull-downs de GFP:MBK-2, foram efectuadas duas experiências separadas utilizando condições de lavagem diferentes. As proteínas foram eluídas por agitação orbital em 50 μl de 6 m ureia/2 M tioureia à temperatura ambiente. Para as experiências de pull-down MBK-1::GFP, as proteínas foram eluídas duas vezes por agitação em 50 μl de cloreto de guanidínio 8 m a 90 °C, seguida de precipitação com etanol. As amostras de proteínas eluídas foram depois digeridas em solução.
(cf. Chen et al., 2016)

Homogeneização e lise de vermes por ultra-sons

Para o procedimento de lise e extração de proteínas de C.elegans, foram colhidos 30 000 nemotodos da fase relevante por amostra e lavados em S-basal gelado, concentrados por centrifugação a 1500 rpm durante 2 minutos, lavados seis vezes com S-basal gelado para remover bactérias residuais e depois armazenados em gelo até estarem prontos para utilização. Para a extração de proteínas, deixou-se que os vermes grávido-adultos formassem um pellet compacto após a última lavagem com S-basal. Os pellets de vermes foram então ressuspensos em 1 ml de tampão de extração gelado [fosfato de potássio 20 mM, pH 7,4, EDTA 2 mM, Triton-X-100 a 1%, inibidores de proteases (Sigma P2714)] e processados imediatamente.
∼30.000 vermes gravídicos-adultos (correspondente a ∼100 mg de peso úmido), foram sonicados no gelo usando um ultrasonicador tipo sonda (por exemplo, UP50H com microtip MS2) a 40% de amplitude para 10 ciclos de 3 seg em, 30 seg fora, em 1 ml de tampão de extração gelado. (cf. Baskharan et al. 2012)

Extração ultra-sónica de lípidos de C. elegans

Na lipidómica, um ramo da metabolómica, o complemento lipídico dos sistemas biológicos é caracterizado e analisado. Os C. elegans são amplamente utilizados na lipidómica para investigar a interação dos lípidos metabólicos e os seus efeitos na saúde e no tempo de vida.
A lise e extração ultra-sónicas são utilizadas para libertar lípidos, tais como esfingolípidos de embriões, larvas e vermes adultos de C. elegans. A ultrassonografia é utilizada para preparar homogenatos de vermes e, subsequentemente, para extrair os lípidos da amostra.
Protocolo para extração de lípidos por ultra-sons de C. elegans
Descongelar o sedimento de C. elegans em gelo e ressuspender com 0,5 ml de ultrawater. Sonicar as amostras de C. elegans em tubos de ensaio de 1,5 ml, mantendo as amostras continuamente no gelo.
A sonicação pode ser efectuada com um aparelho de ultra-sons por sonda, como o UP200Hta unidade de preparação de amostras por ultra-sons VialTweeter (sonicação simultânea de 10 amostras) ou a UIP400MTP (para a sonicação de placas com vários poços, tais como placas de 96 poços).Para a lise ultrassónica com o UP200Ht, utilizar a microponta S26d2. Pré-definir o modo de ciclo ultrassónico no menu digital. Definir a amplitude para 10% e o modo de ciclo de sonicação de impulsos de 2 segundos de 20 ciclos com uma pausa de 30 segundos entre cada impulso de pulsação ultra-sónica.
Transferir os sobrenadantes para tubos de vidro com tampa de rosca. Efetuar a extração de Folch, adicionando 1 ml de água ultrapura a cada tubo de vidro, seguido da adição de 6 ml de uma mistura de clorofórmio/metanol (proporção = 2:1) a cada tubo de vidro.
Agitar cada tubo de vidro no vortex durante 30 segundos e 4 vezes. Centrifugar os tubos a 1.258 x g durante 15 minutos (Eppendorf, 5810 R) para aumentar ainda mais a separação das fases. Transferir a fração hidrofóbica inferior para um tubo de vidro limpo com uma pipeta Pasteur de vidro. Secar a fração hidrofóbica inferior sob fluxo de azoto num evaporador de azoto. Armazenar o sedimento seco num congelador a -80 °C até à sua utilização.

Preparação ultra-sónica de lisados de vermes

Lisado de vermes: Os vermes no estádio L4 foram colhidos e lavados três vezes com tampão M9 (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂PO₄85,56 mM NaCl, e 0,87 mM MgSO₄) de modo a remover todas as bactérias. Depois de remover o máximo possível do tampão M9, os vermes foram ressuspendidos em tampão de lise: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM fosfato β-glicerol, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM fluoreto de sódio, 1 mM ortovanadato de sódio, 5 mM pirofosfato de sódio, 0,2 mM fenilmetanosulfonilfluoreto e inibidor de protease. Os vermes foram congelados em azoto líquido e descongelados a 37°C por três vezes, depois os vermes foram sonicados em gelo seco com uma unidade ultra-sónica VialTweeter para a preparação simultânea de 10 tubos de amostra. A sonicação foi efectuada a 50% de amplitude em 10 ciclos de 2 segundos, com uma pausa de 30 segundos entre as explosões de sonicação. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 12000 rpm a 4°C durante 15 min. O sobrenadante foi recolhido e armazenado a -70°C. Uma alíquota foi utilizada para a quantificação de proteínas através do ensaio de Bradford.
Determinação do glutatião total, GSH e GSSG: Para a quantificação do glutatião, os lisados e a determinação foram efectuados no mesmo dia. As larvas L4 alimentadas com glucose e as larvas de controlo foram colhidas e lavadas com tampão M9 três vezes. Depois de remover tanto quanto possível do tampão M9, os vermes foram ressuspendidos em ácido metafosfórico gelado (5% p/v), depois os vermes foram sonicados em gelo com um VialTweeter ultrassónico a 50% de amplitude em dez ciclos de sonicação de 2 segundos com 30 segundos de pausa entre cada ciclo. Em seguida, centrifugado a 12000 rpm a 4 ̊C por 15 min.
(cf. Alcántar-Fernández et al., 2018)

Preparação de amostras de C. elegans antes da Imunoprecipitação e Western Blotting

Em resumo, para os extractos embrionários, as larvas L1 de C. elegans foram cultivadas em culturas de meio S líquido em grande escala até à idade adulta. Os embriões foram colhidos utilizando o método padrão de branqueamento e suspensos em tampão de lise (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% glicerol, 0,05% NP-40, 1􏰅 Protease Inhibitor Cocktail, e 1􏰅 Phosphatase Inhibitor Cocktail I e II), rapidamente congelados em azoto líquido, e lisados por rutura ultra-sónica das células utilizando um ultrassom com microponta como o UP200Ht com S26d2 para 10 impulsos durante 10 s a 30% de amplitude. Se for necessário preparar um maior número de amostras, o aparelho de ultra-sons VialTweeter ou o MultiSample-Ultrasonicator UIP400MTP para placas de poços são recomendados. Após a sonicação, os extractos foram pré-limpados por centrifugação a 30.000 g durante 20 minutos a 4°C. O extrato pré-limpado (300 µg de proteína total) foi incubado com 40µ􏰂g de anticorpo purificado por afinidade anti-CDC-25.1 (este estudo) ligado à proteína A-agarose ou, como controlo, foi utilizada uma quantidade semelhante de imunoglobulina (Ig)G de coelho ligada à proteína A-agarose num volume total de 200 µl de tampão de lise contendo 1% de NP-40, cuja inclusão reduziu a ligação inespecífica das proteínas à matriz. As amostras foram rodadas durante 1 h a 4°C, as esferas foram lavadas três vezes com tampão de lise e eluídas com 30µl de glicina/HCl e 200 mM NaCl, pH 2,2. Após a imunoprecipitação, os eluatos foram diluídos em 30µ􏰂l de tampão de amostra SDS, aquecidos a 95°C durante 4 min e, tipicamente, 3% do total para a entrada e 30% para os eluatos foram aplicados a SDS-PAGE seguido de Western blotting com anticorpos anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubiquitina (1:1000), anti-GSK3􏰁 (1:500) ou anti-􏰁β-actina (1:2000). Nos casos em que os extractos não foram submetidos a imunoprecipitação, a mesma quantidade de proteína total derivada desses extractos foi ressuspensa em tampão de amostra SDS, aquecida a 95°C, e depois aplicada diretamente a SDS-PAGE e analisada por Western blotting. (cf. Segref et al. 2020)

Lise ultra-sónica sob controlo preciso da temperatura

O controlo preciso e fiável da temperatura é crucial no manuseamento de amostras biológicas. As temperaturas elevadas iniciam a degradação de proteínas induzida termicamente nas amostras.
Como todas as técnicas mecânicas de preparação de amostras, a sonicação gera calor. No entanto, a temperatura das amostras pode ser bem controlada quando se utiliza o VialTweeter. Apresentamos-lhe várias opções para monitorizar e controlar a temperatura das suas amostras enquanto as prepara para análise com o VialTweeter e o VialPress.

1. Monitorização da temperatura da amostra: O processador ultrassónico UP200St, que aciona o VialTweeter, está equipado com um software inteligente e um sensor de temperatura conectável. Ligue o sensor de temperatura ao UP200St e insira a ponta do sensor de temperatura num dos tubos de amostra. Através do ecrã tátil digital colorido, pode definir no menu do UP200St um intervalo de temperatura específico para a sonicação da sua amostra. O ultrassom pára automaticamente quando a temperatura máxima é atingida e faz uma pausa até que a temperatura da amostra desça para o valor mais baixo da temperatura definida ∆. Em seguida, a sonicação recomeça automaticamente. Esta funcionalidade inteligente evita a degradação induzida pelo calor.
2. O bloco VialTweeter pode ser pré-arrefecido. Colocar o bloco VialTweeter (apenas o sonotrodo sem transdutor!) no frigorífico ou no congelador para pré-arrefecer o bloco de titânio ajuda a adiar o aumento da temperatura na amostra. Se possível, a própria amostra também pode ser pré-arrefecida.
3. Utilizar gelo seco para arrefecer durante a sonicação. Utilize um tabuleiro pouco profundo cheio de gelo seco e coloque o VialTweeter sobre o gelo seco para que o calor se possa dissipar rapidamente.

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Todos os homogeneizadores ultra-sónicos digitais estão equipados com software inteligente, ecrã tátil a cores e protocolo automático de dados, o que torna o dispositivo ultrassónico numa ferramenta de trabalho conveniente em laboratórios e instalações de produção.
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O quadro seguinte dá-lhe uma indicação da capacidade de processamento aproximada dos nossos sistemas de ultra-sons, desde homogeneizadores portáteis compactos e ultrassons MultiSample até processadores industriais de ultra-sons para aplicações comerciais: