Ultrasonic Lise para Western Blotting

  • O Western blot é um procedimento analítico para a detecção de proteínas específicas em uma amostra de homogenato de tecido ou um extracto celular.
  • Para executar uma transferência de Western ou para medir a actividade da enzima, muitos ensaios requerem acesso aos materiais (por exemplo, proteínas, ADN, fragmentos subcelulares) aprisionadas na célula.
  • A sonicação é um método de confiança e fácil de manusear para a desagregação de células e a lise controlada.

Ultrasonic rompimento celular

Extracção de proteínas a partir de tecidos e células em cultura é o primeiro passo para muitas técnicas biológicas, bioquímicas e analíticos (PAGE, transfercia de Western, ELISA, espectrometria de massa, etc), ou purificação de proteínas. Para se obter um rendimento elevado de proteína, o material celular e de tecido deve ser eficientemente interrompido / lisadas. Se célula vegetal ou tecido animal, sonicação é o método para preparar a sua lisado celular fácil e rápido.

Vantagens de sonicação

  • Rápido & eficiente
  • operação fácil
  • rendimento elevado de proteína
  • reprodutível / repetível
  • precisamente controlado
  • escalável

Protocolo Immunoprecipitation Para inmunotransferência

A. Reagentes

Para a preparação das soluções, usar água purificada, tal como água Milli-Q.

  • 1X tampão fosfato salino (PBS)
  • 1X Tampão de Lise Celular: Tris 20 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, 1% de Triton X-100, 2,5 Pirofosfato de sódio mM, β-glicerofosfato 1, Na3VO4 1 mM, 1 ug / ml de leupeptina
    Importante: Adicionar PMSF 1 mM imediatamente antes da utilização.
  • 15 ul de proteína A + 15? L de Proteína G é suficiente para o IP, mas pode depender do seu volume de anticorpo primário e a amostra. Também é possível utilizar pré-mistura de proteína A / G agarose (por exemplo, Protea A IgG de coelho para puxar para baixo e para a Protea G IgG de ratinho puxar para baixo)
  • Tampão 3X SDS Amostra: Tris-HCl 187,5 (pH 6,8 a 25 ° C), de 6% w / v de SDS, 30% glicerol, DTT 150 mM, 0,03% w / v de azul de bromofenol

B. Preparação de Lisados ​​Celulares

  • Colheita das células. Para colher as células em condições não desnaturantes, retirar o suporte e lave as células uma vez com PBS gelado.
  • Remover PBS e adicionar tampão de lise celular 1X 0,5 ml de gelo-frio a cada placa (10 cm) e incuba-se as placas em gelo durante 5 minutos.
  • Raspar as células das placas e transferido para tubos de microcentrífuga. Manter em gelo.
  • Sonicar duas vezes durante 10 segundos em tampão de imunoprecipitação arrefecido com gelo (tampão IP: Tris-HCl 50 [pH 7,4], NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, 0,1% de NP-40 e a mistura de inibidor de protease). Por ultra-sons, o VialTweeter ou um ultrasonicator sonda tal como a UP100H ou UP200Ht são os mais adequados.
  • Centrifugar os lisados ​​a 15000 g durante 10 minutos a 4 ° C.
  • Transferir o sobrenadante para um novo tubo. (Se necessário, o lisado pode ser armazenado a -80 ° C).
  • Adicionar o anticorpo primário para o sobrenadante. O sobrenadante com o anticorpo primário é incubado durante 1 h a 4 ° C sob agitação luz. O anticorpo primário é tipicamente adicionado numa quantidade de 10x mais concentrada do que é usado para a transferência de western. (Você pode começar com 1 � por 100 �).
  • O sobrenadante é, então, incubada novamente com a mistura de quantidades iguais de proteína A-agarose (Invitrogen) e Proteína G agarose durante mais 1 h.
  • Lavam-se as peletes de agarose três vezes com tampão IP. Em seguida, extrai-se as proteínas ligadas com o tampão de carga de SDS-PAGE por aquecimento a 95 ° C durante 5 minutos.

C. imunoprecipitação

  • Tome 200 ul de ligado de células e adicionar o anticorpo primário. Incubar com agitação suave durante a noite a 4 ° C.
  • Adicionar qualquer proteína A ou G esferas de agarose (20 uL de 50% de pasta do grânulo). Incubar com agitação suave durante 1-3 horas a 4 ° C.
  • Microcentrifuga durante 30 segundos a 4 ° C. Lave o peletizado de cinco vezes com 500 de tamp de lise celular 1X. Manter em gelo durante a lavagem.
  • Ressuspender o sedimento com tampão de amostra 3X 20 ul de SDS. Vortex, então microcentrífuga por 30 segundos.
  • Aquece-se a amostra a 95-100 ° C durante 2-5 minutos e microcentrífuga durante 1 minuto a 14.000 x g.
  • Carregar a amostra (15-30 ul) em gel de SDS-PAGE (12-15%).
  • Analisar amostra por Western blotting.

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Mais Protocolos sonicação

análise de Western Blot com UP50H ultrasonicator

Seguindo o protocolo foi utilizado no estudo de Kriebisch et al. (2011):
A proteína total foi isolado a partir de células MC3T3-E1 tratadas com 1,25 (OH)2D3 (10-8 M) ou veículo. As células foram lisadas com um tampão contendo 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); NaCl 150 mM (Fisher Scientific); 0,1% de sulfato de dodecilo de sódio (SDS) (Fisher Scientific); 1% de IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) e 0,5% de desoxicolato de sio (Merck). O lisado celular a ultra-sons durante 2 x 10 s no ciclo 1 e 80 com a amplitude UP50H processador ultra-sônico (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Alemanha). Em seguida, o material foi centrifugado durante 10 minutos a 14 000 rpm e o sobrenadante foi utilizado para Western Blot. Vinte e cinco μg de proteína foram fervidos em tampão de amostra e agente redutor (Invitrogen) e subsequentemente separados por SDS-PAGE usando 4-12% de géis de poliacrilamida (Invitrogen) e transferidos para uma membrana de nitrocelulose (cuidados de saúde da GE). A membrana foi bloqueada durante 1 h com TBS (Tris-HCl 10 mM, pH 7,6, NaCl 150 mM) contendo 1% de caseína (Sigma-Aldrich) e 1% de Tris (1 M). Após o bloqueio, a membrana foi incubada com agitação leve durante a noite a 4 ° C com o anticorpo primário (coelho anti-humano CBS 1/500, desenvolvido no laboratório do Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, EUA). A incubação com um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (HPR) (Dako) foi realizada durante 1 h à temperatura ambiente. Todas as transferências foram desenvolvidas por quimioluminiscência avançada (Perkin Elmer).

Literatura / Referências

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Sobre Western Blotting

Os blots são procedimentos analíticos em que o ADN, ARN e proteínas são transferidos para um suporte de modo que eles podem ser separados.
A transferência de Southern é utilizado para a detecção de ADN, a transfercia de Northern de ARN e transferência de Western para as proteínas.
Western blotting é também chamado de imunotransferência de proteínas porque um anticorpo é usado para detectar especificamente o seu antigénio. O Western Blotting é um dos métodos de análise mais importantes para detectar proteínas específicas na amostra. Na transfercia de Western, as proteínas são imobilizados em membranas de detectá-los utilizando anticorpos monoclonais ou policlonais.
Por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE), as proteínas nativas são separadas por estrutura 3-D ou proteínas desnaturadas pelo comprimento do polipéptido. As proteínas são então transferidas para uma membrana (tipicamente nitrocelulose ou PVDF), onde são coradas com anticorpos específicos da proteína alvo. O passo de eletroforese em gel está incluído na análise Western Blot para resolver a questão da reatividade cruzada dos anticorpos.
Posteriormente, as proteínas separadas são transferidas para uma matriz (principalmente na membrana de nitrocelulose ou PVDF), onde são coradas com anticorpos. Os anticorpos funcionam como uma sonda e são selecionados especificamente para a proteína alvo. A análise da localização e intensidade da reação específica revela detalhes de expressão das proteínas alvo na amostra dada. O Western blot pode detectar proteína alvo que é tão baixa como 1 ng devido à alta resolução da eletroforese em gel e especificidade forte e alta sensibilidade do imunoensaio. O método Western blot é utilizado em biologia molecular, bioquímica, imunogenetics e outros campos de pesquisa molecular.
Outras técnicas relacionadas incluem análise dot blot, imuno-histoquímica e imunocitoquímica, onde os anticorpos são usados ​​para detectar proteínas em tecidos e células por imunocoloração, e ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA).

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