Lise ultra-sónica para Western Blotting

• O western blot é um procedimento analítico para a deteção de proteínas específicas numa amostra de homogenato de tecido ou extrato de células.
• Para executar um Western blot ou medir a atividade enzimática, muitos ensaios requerem o acesso aos materiais (por exemplo, proteínas, ADN, fragmentos subcelulares) aprisionados na célula.
• A sonicação é um método fiável e fácil de manusear para a rutura e lise controlada de células.

Perturbação ultra-sónica de células

A extração de proteínas de tecidos e células em cultura é o primeiro passo para muitas técnicas biológicas, bioquímicas e analíticas (PAGE, Western blotting, ELISA, espetrometria de massa, etc.) ou para a purificação de proteínas. Para obter um elevado rendimento proteico, o material celular e o tecido devem ser eficientemente rompidos/lisados. Quer se trate de células vegetais ou de tecidos animais, a sonicação é o método para preparar o seu lisado celular de forma fácil e rápida.

Vantagens da Sonicação

• rápido & eficaz
• Operação fácil
• elevado rendimento proteico
• reprodutível/ repetível
• controlado com precisão
• escalável

Protocolo de imunoprecipitação para Western Immunoblotting

A. Reagentes

Para a preparação das soluções, utilizar água purificada, como a Milli-Q.

• Solução salina tamponada com fosfato 1X (PBS)
• Tampão de lise celular 1X: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM Pirofosfato de sódio, 1 mM β-glicerofosfato, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml Leupeptina
  Importante: Adicionar 1 mM PMSF imediatamente antes da utilização.
• 15 μl de Proteína A+15 μl de Proteína G é suficiente para IP, mas pode depender do anticorpo primário e do volume da amostra. Também se pode utilizar agarose pré-misturada de proteína A/ G (por exemplo, proteína A para a extração de IgG de coelho e proteína G para a extração de IgG de rato)
• Tampão de amostra 3X SDS: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 a 25°C), 6% p/v SDS, 30% glicerol, 150 mM DTT, 0,03% p/v azul de bromofenol

B. Preparação de lisados celulares

• Colher as células. Para colher células em condições de não desnaturação, remover o meio e enxaguar as células uma vez com PBS gelado.
• Retirar o PBS e adicionar 0,5 ml de tampão de lise celular 1X gelado a cada placa (10 cm) e incubar as placas em gelo durante 5 minutos.
• Raspar as células das placas e transferir para tubos de microcentrifugação. Manter em gelo.
• Sonicar duas vezes durante 10 segundos em tampão de imunoprecipitação gelado (tampão IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 e a mistura de inibidores da protease). Para a sonicação, o VialTweeter ou um ultrassonicador de sonda, como o UP100H OU UP200Ht são os mais adequados.
• Centrifugar os lisados a 15.000 g durante 10 minutos a 4°C.
• Transferir o sobrenadante para um novo tubo. (Se necessário, o lisado pode ser armazenado a -80°C).
• Adicionar o anticorpo primário ao sobrenadante. O sobrenadante com o anticorpo primário é incubado durante 1 h a 4°C sob agitação ligeira. Normalmente, o anticorpo primário é adicionado numa quantidade 10x mais concentrada do que a utilizada para western blotting. (Pode começar com 1μg por 100μL).
• O sobrenadante é então incubado novamente com a mistura de quantidades iguais de agarose de proteína A (Invitrogen) e agarose de proteína G durante mais 1 h.
• Lavar os pellets de agarose três vezes com tampão IP. Em seguida, extrair as proteínas ligadas com o tampão de carregamento SDS-PAGE, aquecendo a 95°C durante 5 minutos.

C. Imunoprecipitação

• Colher 200 μl de lisado de células e adicionar o anticorpo primário. Incubar com agitação suave durante a noite a 4°C.
• Adicionar pérolas de agarose de proteína A ou G (20 μl de 50% de pasta de pérolas). Incubar com agitação suave durante 1-3 horas a 4°C.
• Microcentrifugar durante 30 segundos a 4°C. Lavar o sedimento cinco vezes com 500 µl de tampão de lise celular 1X. Manter no gelo durante as lavagens.
• Ressuspender o sedimento com 20 μl de tampão de amostra SDS 3X. Agitar em vórtice e depois microcentrifugar durante 30 segundos.
• Aquecer a amostra a 95-100°C durante 2-5 minutos e microcentrifugar durante 1 minuto a 14.000 X g.
• Carregar a amostra (15-30 μl) num gel SDS-PAGE (12-15%).
• Analisar a amostra por Western blotting.

Análise Western Blot com o Sonicator UP50H

O protocolo seguinte, utilizando o sonicador do tipo sonda UP50H, foi utilizado no estudo de Kriebisch et al. (2011):
A proteína total foi isolada de células MC3T3-E1 tratadas com 1,25(OH)₂D₃ (10^-8 M) ou veículo. As células foram lisadas com um tampão contendo 50 mM de Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM de NaCl (Fisher Scientific); 0,1% de dodecil sulfato de sódio (SDS) (Fisher Scientific); 1% de IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) e 0,5% de desoxicolato de sódio (Merck). O lisado celular foi sonicado durante 2 × 10 s no ciclo 1 e amplitude 80 com o Processador ultrassónico UP50H (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Alemanha). Depois disso, o material foi centrifugado durante 10 minutos a 14.000 rpm e o sobrenadante foi utilizado para Western blotting. Vinte e cinco μg de proteína foram fervidos em tampão de amostra e agente redutor (Invitrogen) e subsequentemente separados por SDS-PAGE utilizando géis de poliacrilamida 4-12% (Invitrogen) e transferidos para uma membrana de nitrocelulose (GE health care). A membrana foi bloqueada durante 1 h com TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) contendo 1% de caseína (Sigma-Aldrich) e 1% de Tris (1 M). Após o bloqueio, a membrana foi incubada com uma ligeira agitação durante a noite a 4°C com o anticorpo primário (anti-humano de coelho CBS 1/500, desenvolvido no laboratório do Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, EUA). A incubação com um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (HPR) (Dako) foi efectuada durante 1 h à temperatura ambiente. Todos os blots foram revelados por quimioluminescência melhorada (Perkin Elmer).
 

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A tabela abaixo dá-lhe uma indicação da capacidade de processamento aproximada dos nossos ultrassons de laboratório:

Literatura / Referências