Hielscher Ultrasonics
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Lise ultra-sónica para Western Blotting

  • O western blot é um procedimento analítico para a deteção de proteínas específicas numa amostra de homogenato de tecido ou extrato de células.
  • Para executar um Western blot ou medir a atividade enzimática, muitos ensaios requerem o acesso aos materiais (por exemplo, proteínas, ADN, fragmentos subcelulares) aprisionados na célula.
  • A sonicação é um método fiável e fácil de manusear para a rutura e lise controlada de células.

Perturbação ultra-sónica de células

A extração de proteínas de tecidos e células em cultura é o primeiro passo para muitas técnicas biológicas, bioquímicas e analíticas (PAGE, Western blotting, ELISA, espetrometria de massa, etc.) ou para a purificação de proteínas. Para obter um elevado rendimento proteico, o material celular e o tecido devem ser eficientemente rompidos/lisados. Quer se trate de células vegetais ou de tecidos animais, a sonicação é o método para preparar o seu lisado celular de forma fácil e rápida.

Vantagens da Sonicação

  • rápido & eficaz
  • Operação fácil
  • elevado rendimento proteico
  • reprodutível/ repetível
  • controlado com precisão
  • escalável

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O VialTweeter da Hielscher é ideal para a lise de várias amostras

Sonicador VialTweeter para preparação de amostras por ultra-sons, como a rutura de células e o isolamento de proteínas

Protocolo de imunoprecipitação para Western Immunoblotting

A. Reagentes

Para a preparação das soluções, utilizar água purificada, como a Milli-Q.

  • Solução salina tamponada com fosfato 1X (PBS)
  • Tampão de lise celular 1X: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM Pirofosfato de sódio, 1 mM β-glicerofosfato, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml Leupeptina
    Importante: Adicionar 1 mM PMSF imediatamente antes da utilização.
  • 15 μl de Proteína A+15 μl de Proteína G é suficiente para IP, mas pode depender do anticorpo primário e do volume da amostra. Também se pode utilizar agarose pré-misturada de proteína A/ G (por exemplo, proteína A para a extração de IgG de coelho e proteína G para a extração de IgG de rato)
  • Tampão de amostra 3X SDS: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 a 25°C), 6% p/v SDS, 30% glicerol, 150 mM DTT, 0,03% p/v azul de bromofenol

B. Preparação de lisados celulares

  • Colher as células. Para colher células em condições de não desnaturação, remover o meio e enxaguar as células uma vez com PBS gelado.
  • Retirar o PBS e adicionar 0,5 ml de tampão de lise celular 1X gelado a cada placa (10 cm) e incubar as placas em gelo durante 5 minutos.
  • Raspar as células das placas e transferir para tubos de microcentrifugação. Manter em gelo.
  • Sonicar duas vezes durante 10 segundos em tampão de imunoprecipitação gelado (tampão IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 e a mistura de inibidores da protease). Para a sonicação, o VialTweeter ou um ultrassonicador de sonda, como o UP100H OU UP200Ht são os mais adequados.
  • Centrifugar os lisados a 15.000 g durante 10 minutos a 4°C.
  • Transferir o sobrenadante para um novo tubo. (Se necessário, o lisado pode ser armazenado a -80°C).
  • Adicionar o anticorpo primário ao sobrenadante. O sobrenadante com o anticorpo primário é incubado durante 1 h a 4°C sob agitação ligeira. Normalmente, o anticorpo primário é adicionado numa quantidade 10x mais concentrada do que a utilizada para western blotting. (Pode começar com 1μg por 100μL).
  • O sobrenadante é então incubado novamente com a mistura de quantidades iguais de agarose de proteína A (Invitrogen) e agarose de proteína G durante mais 1 h.
  • Lavar os pellets de agarose três vezes com tampão IP. Em seguida, extrair as proteínas ligadas com o tampão de carregamento SDS-PAGE, aquecendo a 95°C durante 5 minutos.

C. Imunoprecipitação

  • Colher 200 μl de lisado de células e adicionar o anticorpo primário. Incubar com agitação suave durante a noite a 4°C.
  • Adicionar pérolas de agarose de proteína A ou G (20 μl de 50% de pasta de pérolas). Incubar com agitação suave durante 1-3 horas a 4°C.
  • Microcentrifugar durante 30 segundos a 4°C. Lavar o sedimento cinco vezes com 500 µl de tampão de lise celular 1X. Manter no gelo durante as lavagens.
  • Ressuspender o sedimento com 20 μl de tampão de amostra SDS 3X. Agitar em vórtice e depois microcentrifugar durante 30 segundos.
  • Aquecer a amostra a 95-100°C durante 2-5 minutos e microcentrifugar durante 1 minuto a 14.000 X g.
  • Carregar a amostra (15-30 μl) num gel SDS-PAGE (12-15%).
  • Analisar a amostra por Western blotting.

Análise Western Blot com o Sonicator UP50H

O protocolo seguinte, utilizando o sonicador do tipo sonda UP50H, foi utilizado no estudo de Kriebisch et al. (2011):
O homogeneizador ultrassónico do tipo sonda UP50H é normalmente utilizado para a rutura de células e o isolamento de proteínas como passo de preparação da amostra antes do Western BlottingA proteína total foi isolada de células MC3T3-E1 tratadas com 1,25(OH)2D3 (10-8 M) ou veículo. As células foram lisadas com um tampão contendo 50 mM de Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM de NaCl (Fisher Scientific); 0,1% de dodecil sulfato de sódio (SDS) (Fisher Scientific); 1% de IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) e 0,5% de desoxicolato de sódio (Merck). O lisado celular foi sonicado durante 2 × 10 s no ciclo 1 e amplitude 80 com o Processador ultrassónico UP50H (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Alemanha). Depois disso, o material foi centrifugado durante 10 minutos a 14.000 rpm e o sobrenadante foi utilizado para Western blotting. Vinte e cinco μg de proteína foram fervidos em tampão de amostra e agente redutor (Invitrogen) e subsequentemente separados por SDS-PAGE utilizando géis de poliacrilamida 4-12% (Invitrogen) e transferidos para uma membrana de nitrocelulose (GE health care). A membrana foi bloqueada durante 1 h com TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) contendo 1% de caseína (Sigma-Aldrich) e 1% de Tris (1 M). Após o bloqueio, a membrana foi incubada com uma ligeira agitação durante a noite a 4°C com o anticorpo primário (anti-humano de coelho CBS 1/500, desenvolvido no laboratório do Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, EUA). A incubação com um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (HPR) (Dako) foi efectuada durante 1 h à temperatura ambiente. Todos os blots foram revelados por quimioluminescência melhorada (Perkin Elmer).
 

Este tutorial explica que tipo de sonicador é melhor para as suas tarefas de preparação de amostras, tais como lise, rutura de células, isolamento de proteínas, fragmentação de ADN e ARN em laboratórios, análises e investigação. Escolha o tipo de sonicador ideal para a sua aplicação, volume de amostra, número de amostras e rendimento. A Hielscher Ultrasonics tem o homogeneizador ultrassónico ideal para si!

Como encontrar o Sonicador perfeito para a rutura de células e extração de proteínas em Ciência e Análise

Miniatura de vídeo

 

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A tabela abaixo dá-lhe uma indicação da capacidade de processamento aproximada dos nossos ultrassons de laboratório:

Dispositivos recomendados Volume do lote caudal
Sonicador de placas de 96 poços UIP400MTP placas multipoços / microtitulação n.d.
CupHorn ultrassónico CupHorn para frascos ou copo n.d.
GDmini2 reator de microfluxo ultrassónico n.d.
VialTweeter 0.5 a 1,5mL n.d.
UP100H 1 a 500mL 10 a 200mL/min
UP200Ht, UP200St 10 a 1000mL 20 a 200mL/min
UP400ST 10 a 2000mL 20 a 400mL/min
Agitador de peneiras por ultra-sons n.d. n.d.

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Microplacas, placas com vários poços, placas PCR e placas de 96 poços podem ser confortável e uniformemente sonicadas utilizando o sonicador de placas UIP400MTP

Sonicador de placas UIP400MTP para sonicação de alto rendimento de placas de 96 poços



Sobre Western Blotting

Os blots são procedimentos analíticos em que o ADN, o ARN e as proteínas são transferidos para um suporte para que possam ser separados.
O Southern blot é utilizado para a deteção de ADN, o Northern blot para o ARN e o Western blot para as proteínas.
O Western blotting é também designado por immunoblotting de proteínas, uma vez que é utilizado um anticorpo para detetar especificamente o seu antigénio. O Western Blotting é um dos métodos de análise mais importantes para detetar proteínas específicas na amostra. No Western blot, as proteínas são imobilizadas em membranas para as detetar utilizando anticorpos monoclonais ou policlonais.
Por eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE), as proteínas nativas são separadas pela estrutura 3-D ou as proteínas desnaturadas pelo comprimento do polipéptido. As proteínas são então transferidas para uma membrana (normalmente nitrocelulose ou PVDF), onde são coradas com anticorpos específicos para a proteína alvo. A etapa de eletroforese em gel é incluída na análise western blot para resolver a questão da reatividade cruzada dos anticorpos.
Posteriormente, as proteínas separadas são colocadas numa matriz (geralmente numa membrana de nitrocelulose ou PVDF), onde são coradas com anticorpos. Os anticorpos funcionam como uma sonda e são selecionados especificamente para a proteína alvo. A análise da localização e da intensidade da reação específica revela os detalhes da expressão das proteínas alvo na amostra em questão. O Western blotting pode detetar proteínas-alvo tão baixas como 1 ng devido à elevada resolução da eletroforese em gel e à forte especificidade e elevada sensibilidade do imunoensaio. O método Western blot é utilizado em biologia molecular, bioquímica, imunogenética e outros domínios de investigação molecular.
Outras técnicas relacionadas incluem a análise dot blot, a imunohistoquímica e a imunocitoquímica, em que os anticorpos são utilizados para detetar proteínas em tecidos e células por imunocoloração, e o ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA).


Literatura / Referências

Configuração completa do VialTweeter: Sonotrodo VialTweeter no processador ultrassónico UP200St

Sonicador VialTweeter para a preparação simultânea de amostras de vários frascos

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A sonicação é um passo importante durante a preparação da amostra

UP200St com micro-ponta para sonicação de amostras

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