Lise ultrassónica para Western blot

• O Western blot é um procedimento analítico para a deteção de proteínas específicas numa amostra de homogenato de tecido ou de extrato celular.
• Para realizar um Western blot ou medir a atividade enzimática, muitos ensaios requerem acesso aos materiais (por exemplo, proteínas, DNA, fragmentos subcelulares) retidos no interior da célula.
• A sonicação é um método fiável e fácil de utilizar para a rutura celular e a lise controladas.

Rutura celular ultrassónica

A extração de proteínas de tecidos e de células em cultura é o primeiro passo de muitas técnicas biológicas, bioquímicas e analíticas (PAGE, Western blot, ELISA, espectrometria de massa, etc.) ou da purificação de proteínas. Para obter um elevado rendimento de proteínas, o material celular e o tecido devem ser submetidos a rutura/lise de forma eficiente. Quer se trate de células vegetais ou de tecido animal, a sonicação é o método para preparar o seu lisado celular de forma fácil e rápida.

Vantagens da sonicação

• rápida e eficiente
• utilização fácil
• elevado rendimento de proteínas
• reprodutível/repetível
• controlada com precisão
• escalável

Protocolo de imunoprecipitação para imunoblotting de Western

A. Reagentes

Para preparar as soluções, utilize água purificada, como Milli-Q.

• Solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1X
• Tampão de lise celular 1X: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM pirofosfato de sódio, 1 mM β-glicerofosfato, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml leupeptina
  Importante: adicione 1 mM PMSF imediatamente antes da utilização.
• 15 μl de proteína A+15 μl de proteína G são suficientes para IP, mas isso pode depender do seu anticorpo primário e do volume da amostra. Também pode utilizar agarose com proteína A/G pré-misturada (por exemplo, proteína A para a captura de IgG de coelho e proteína G para a captura de IgG de ratinho)
• Tampão de amostra SDS 3X: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 a 25°C), 6% w/v SDS, 30% glicerol, 150 mM DTT, 0,03% w/v azul de bromofenol

B. Preparação de lisados celulares

• Recolha as células. Para recolher as células em condições não desnaturantes, remova o meio de cultura e lave as células uma vez com PBS arrefecido em gelo.
• Remova o PBS, adicione 0,5 ml de tampão de lise celular 1X arrefecido em gelo a cada placa (10 cm) e incube as placas em gelo durante 5 minutos.
• Raspe as células das placas e transfira-as para tubos de microcentrífuga. Mantenha em gelo.
• Sonique duas vezes durante 10 segundos em tampão de imunoprecipitação arrefecido em gelo (tampão IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 e a mistura de inibidores de proteases). Para a sonicação, o VialTweeter ou um sonicador ultrassónico de sonda, como o UP100H ou UP200Ht , são os mais adequados.
• Centrifugue os lisados a 15 000 g durante 10 minutos a 4°C.
• Transfira o sobrenadante para um novo tubo. (Se necessário, o lisado pode ser armazenado a –80°C.)
• Adicione o anticorpo primário ao sobrenadante. O sobrenadante com o anticorpo primário é incubado durante 1 h a 4°C sob agitação ligeira. Normalmente, o anticorpo primário é adicionado numa quantidade 10x mais concentrada do que a utilizada para Western blot. (Pode começar com 1μg por 100μL.)
• O sobrenadante é depois incubado com a mistura de quantidades iguais de proteína A-agarose (Invitrogen) e agarose com proteína G durante mais 1 h.
• Lave os sedimentos de agarose três vezes com tampão IP. Em seguida, extraia as proteínas ligadas com o tampão de carregamento para SDS-PAGE, aquecendo a 95°C durante 5 minutos.

C. Imunoprecipitação

• Retire 200 μl de lisado celular e adicione o anticorpo primário. Incube com agitação basculante suave durante a noite a 4°C.
• Adicione esferas de agarose com proteína A ou G (20 μl de uma suspensão de esferas a 50%). Incube com agitação basculante suave durante 1–3 horas a 4°C.
• Microcentrifugue durante 30 segundos a 4°C. Lave o sedimento cinco vezes com 500 µl de tampão de lise celular 1X. Mantenha em gelo durante as lavagens.
• Ressuspenda o sedimento com 20 μl de tampão de amostra SDS 3X. Agite no vórtex e depois microcentrifugue durante 30 segundos.
• Aqueça a amostra a 95–100°C durante 2–5 minutos e microcentrifugue durante 1 minuto a 14 000 X g.
• Carregue a amostra (15–30 μl) num gel de SDS-PAGE (12–15%).
• Analise a amostra por Western blot.

Análise por Western blot com o sonicador UP50H

O protocolo seguinte, que utiliza o sonicador de sonda UP50H, foi utilizado no estudo de Kriebisch et al. (2011):
A proteína total foi isolada de células MC3T3-E1 tratadas com 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) ou com o veículo. As células foram lisadas com um tampão contendo 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% dodecil sulfato de sódio (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) e 0,5% desoxicolato de sódio (Merck). O lisado celular foi sonicado durante 2 × 10 s com o ciclo definido para 1 e a amplitude para 80, utilizando o Processador ultrassónico UP50H (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Alemanha). Em seguida, o material foi centrifugado durante 10 min a 14 000 rpm e o sobrenadante foi utilizado para Western blot. Vinte e cinco μg de proteína foram fervidos em tampão de amostra e agente redutor (Invitrogen) e subsequentemente separados por SDS-PAGE utilizando géis de poliacrilamida a 4–12% (Invitrogen) e transferidos para uma membrana de nitrocelulose (GE health care). A membrana foi bloqueada durante 1 h com TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) contendo 1% caseína (Sigma-Aldrich) e 1% Tris (1 M). Após o bloqueio, a membrana foi incubada sob agitação ligeira durante a noite a 4°C com o anticorpo primário (anticorpo de coelho anti-CBS humana 1/500, desenvolvido no laboratório do Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, EUA). A incubação com um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (HPR) (Dako) foi realizada durante 1 h à temperatura ambiente. Todos os blots foram revelados por quimioluminescência intensificada (Perkin Elmer).
 

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A tabela abaixo dá-lhe uma indicação da capacidade aproximada de processamento dos nossos sonicadores ultrassónicos de dimensão laboratorial:

Bibliografia / Referências

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.