Ultrasonic Lise para Western Blotting

• O Western blot é um procedimento analítico para a detecção de proteínas específicas em uma amostra de homogenato de tecido ou um extracto celular.
• Para executar uma transferência de Western ou para medir a actividade da enzima, muitos ensaios requerem acesso aos materiais (por exemplo, proteínas, ADN, fragmentos subcelulares) aprisionadas na célula.
• A sonicação é um método de confiança e fácil de manusear para a desagregação de células e a lise controlada.

Ultrasonic rompimento celular

Extracção de proteínas a partir de tecidos e células em cultura é o primeiro passo para muitas técnicas biológicas, bioquímicas e analíticos (PAGE, transfercia de Western, ELISA, espectrometria de massa, etc), ou purificação de proteínas. Para se obter um rendimento elevado de proteína, o material celular e de tecido deve ser eficientemente interrompido / lisadas. Se célula vegetal ou tecido animal, sonicação é o método para preparar a sua lisado celular fácil e rápido.

Vantagens de sonicação

• Rápido & eficiente
• operação fácil
• rendimento elevado de proteína
• reprodutível / repetível
• precisamente controlado
• escalável

Protocolo Immunoprecipitation Para inmunotransferência

A. Reagentes

Para a preparação das soluções, usar água purificada, tal como água Milli-Q.

• 1X tampão fosfato salino (PBS)
• 1X Tampão de Lise Celular: Tris 20 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, 1% de Triton X-100, 2,5 Pirofosfato de sódio mM, β-glicerofosfato 1, Na3VO4 1 mM, 1 ug / ml de leupeptina
  Importante: Adicionar PMSF 1 mM imediatamente antes da utilização.
• 15 ul de proteína A + 15? L de Proteína G é suficiente para o IP, mas pode depender do seu volume de anticorpo primário e a amostra. Também é possível utilizar pré-mistura de proteína A / G agarose (por exemplo, Protea A IgG de coelho para puxar para baixo e para a Protea G IgG de ratinho puxar para baixo)
• Tampão 3X SDS Amostra: Tris-HCl 187,5 (pH 6,8 a 25 ° C), de 6% w / v de SDS, 30% glicerol, DTT 150 mM, 0,03% w / v de azul de bromofenol

B. Preparação de Lisados ​​Celulares

• Colheita das células. Para colher as células em condições não desnaturantes, retirar o suporte e lave as células uma vez com PBS gelado.
• Remover PBS e adicionar tampão de lise celular 1X 0,5 ml de gelo-frio a cada placa (10 cm) e incuba-se as placas em gelo durante 5 minutos.
• Raspar as células das placas e transferido para tubos de microcentrífuga. Manter em gelo.
• Sonicar duas vezes durante 10 segundos em tampão de imunoprecipitação arrefecido com gelo (tampão IP: Tris-HCl 50 [pH 7,4], NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, 0,1% de NP-40 e a mistura de inibidor de protease). Por ultra-sons, o VialTweeter ou um ultrasonicator sonda tal como a UP100H ou UP200Ht são os mais adequados.
• Centrifugar os lisados ​​a 15000 g durante 10 minutos a 4 ° C.
• Transferir o sobrenadante para um novo tubo. (Se necessário, o lisado pode ser armazenado a -80 ° C).
• Adicionar o anticorpo primário para o sobrenadante. O sobrenadante com o anticorpo primário é incubado durante 1 h a 4 ° C sob agitação luz. O anticorpo primário é tipicamente adicionado numa quantidade de 10x mais concentrada do que é usado para a transferência de western. (Você pode começar com 1 � por 100 �).
• O sobrenadante é, então, incubada novamente com a mistura de quantidades iguais de proteína A-agarose (Invitrogen) e Proteína G agarose durante mais 1 h.
• Lavam-se as peletes de agarose três vezes com tampão IP. Em seguida, extrai-se as proteínas ligadas com o tampão de carga de SDS-PAGE por aquecimento a 95 ° C durante 5 minutos.

C. imunoprecipitação

• Tome 200 ul de ligado de células e adicionar o anticorpo primário. Incubar com agitação suave durante a noite a 4 ° C.
• Adicionar qualquer proteína A ou G esferas de agarose (20 uL de 50% de pasta do grânulo). Incubar com agitação suave durante 1-3 horas a 4 ° C.
• Microcentrifuga durante 30 segundos a 4 ° C. Lave o peletizado de cinco vezes com 500 de tamp de lise celular 1X. Manter em gelo durante a lavagem.
• Ressuspender o sedimento com tampão de amostra 3X 20 ul de SDS. Vortex, então microcentrífuga por 30 segundos.
• Aquece-se a amostra a 95-100 ° C durante 2-5 minutos e microcentrífuga durante 1 minuto a 14.000 x g.
• Carregar a amostra (15-30 ul) em gel de SDS-PAGE (12-15%).
• Analisar amostra por Western blotting.

análise de Western Blot com UP50H ultrasonicator

Seguindo o protocolo foi utilizado no estudo de Kriebisch et al. (2011):
A proteína total foi isolado a partir de células MC3T3-E1 tratadas com 1,25 (OH)₂D₃ (10^-8 M) ou veículo. As células foram lisadas com um tampão contendo 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); NaCl 150 mM (Fisher Scientific); 0,1% de sulfato de dodecilo de sódio (SDS) (Fisher Scientific); 1% de IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) e 0,5% de desoxicolato de sio (Merck). O lisado celular a ultra-sons durante 2 x 10 s no ciclo 1 e 80 com a amplitude UP50H processador ultra-sônico (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Alemanha). Em seguida, o material foi centrifugado durante 10 minutos a 14 000 rpm e o sobrenadante foi utilizado para Western Blot. Vinte e cinco μg de proteína foram fervidos em tampão de amostra e agente redutor (Invitrogen) e subsequentemente separados por SDS-PAGE usando 4-12% de géis de poliacrilamida (Invitrogen) e transferidos para uma membrana de nitrocelulose (cuidados de saúde da GE). A membrana foi bloqueada durante 1 h com TBS (Tris-HCl 10 mM, pH 7,6, NaCl 150 mM) contendo 1% de caseína (Sigma-Aldrich) e 1% de Tris (1 M). Após o bloqueio, a membrana foi incubada com agitação leve durante a noite a 4 ° C com o anticorpo primário (coelho anti-humano CBS 1/500, desenvolvido no laboratório do Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, EUA). A incubação com um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (HPR) (Dako) foi realizada durante 1 h à temperatura ambiente. Todas as transferências foram desenvolvidas por quimioluminiscência avançada (Perkin Elmer).

Literatura / Referências