Extração ultrassónica de proteínas de tecidos e culturas celulares
- A extração de proteínas é uma etapa essencial da preparação de amostras em proteómica.
- As proteínas podem ser extraídas de tecidos vegetais e animais, leveduras e microrganismos.
- A sonicação é um método fiável e eficiente de extração de proteínas que proporciona elevados rendimentos de proteínas num curto tempo de extração.
Extração de proteínas de tecidos e células
A extração de proteínas de tecidos e células cultivadas é uma etapa essencial da preparação de amostras, realizada durante muitas técnicas bioquímicas e analíticas, como ELISA, PAGE, Western blotting, espectrometria de massa ou purificação de proteínas. A rutura celular, a lise e a extração por ultrassons constituem uma técnica não térmica, controlável com precisão, para assegurar elevados rendimentos de proteínas.
Extração de proteínas de células com a sonda ultrassónica UP200St
- Rapidez
- Elevados rendimentos
- Elevada eficiência
- Controlo preciso dos parâmetros
- Resultados reprodutíveis
- Escalabilidade linear
Instruções gerais para a lise ultrassónica e a extração de proteínas
- Controlo da temperatura: Para assegurar um elevado rendimento de proteínas sem desnaturação térmica, a temperatura durante a extração deve ser controlada. Os homogeneizadores ultrassónicos de última geração da Hielscher – também denominados desintegradores ultrassónicos ou sonicadores – são controláveis com precisão. São fornecidos com um sensor de temperatura conectável. Nas opções de configuração do homogeneizador ultrassónico, pode definir-se uma temperatura máxima. Quando esta temperatura máxima é atingida, o sonicador para automaticamente até a amostra arrefecer.
- Tampão: A escolha de um tampão adequado e do volume correto de tampão varia de tecido para tecido e deve ser determinada através de ensaios por tentativa e erro.
- Isolamento / purificação: Os lisados proteicos podem conter um excesso de biomoléculas, como DNA ou hidratos de carbono, que podem ser removidas por precipitação de proteínas (desoxicolato–ácido tricloroacético) ou por troca de tampão.
Chittapalo e Noomhorm (2009) relataram no seu estudo que o rendimento de proteínas aumentou com a utilização de sonicação e que o processo de homogeneização e lise ultrassónica de tecidos pode melhorar significativamente os processos de extração existentes – abrindo novas oportunidades de extração comercial.
CupHorn ultrassónico para a preparação simultânea e altamente eficaz de várias amostras nas mesmas condições, para isolamento de proteínas e fragmentação de DNA.
Extração de proteínas de tecido animal
Para a preparação de tecidos inteiros (por exemplo, rim, coração, pulmão, músculo, etc.), o tecido deve ser dissecado em pedaços muito pequenos com instrumentos limpos, de preferência sobre gelo, e o mais rapidamente possível para evitar a degradação por proteases (por exemplo, tampão de lise como RIPA ou tampão de lise hipotónico contendo uma mistura de inibidores de proteases e fosfatases). Após a dissecação, a amostra é imersa em azoto líquido para congelação rápida. A amostra pode ser armazenada a -80°C para utilização posterior ou mantida sobre gelo para homogeneização imediata. Imediatamente antes da extração ultrassónica, adiciona-se rapidamente ao tubo da amostra tampão de lise gelado (com os inibidores de proteases DTT, leupeptina e aprotinina) (recomendam-se aproximadamente ~600 μL de tampão por ~10 mg de tecido). Recomendam-se aproximadamente 20–60mg de tecido por tubo de amostra.
A homogeneização, a lise e a extração ultrassónicas são realizadas com um homogeneizador ultrassónico como o UP100H ou o UP200Ht, equipado com um sonotrodo de microponta. A duração da sonicação é de 60–90 s, num modo de ciclos ultrassónicos de 15 s de sonicação e 10 s de repouso. A amostra deve ser mantida em gelo durante todo o processo.
Após a homogeneização / extração ultrassónica, o lisado é centrifugado a 27 000g durante aproximadamente 20 min. Em seguida, recolhe-se o sobrenadante para que a concentração de proteínas possa ser determinada por um ensaio de proteínas, como o ensaio BCA de proteínas Pierce.
Extração de proteínas de soro sanguíneo
Para obter uma mistura homogénea do soro e do tampão fosfato, a amostra é primeiro agitada num vórtex antes da lise celular ultrassónica. Para a lise ultrassónica, a amostra é sonicada com um homogeneizador ultrassónico de laboratório, como o UP100H, durante 8 ciclos a 20% de amplitude, sendo cada ciclo constituído por 5 segundos de funcionamento e 15 segundos de pausa. A extração de proteínas é realizada por sonicação em ciclos (modo de pulsação) e colocando a amostra sobre gelo, para evitar o sobreaquecimento e a degradação térmica da amostra. Como o soro contém uma grande quantidade de proteínas de elevado peso molecular (como albumina, α1-antitripsina, transferrina, haptoglobulina, imunoglobulina G e imunoglobulina A), que interferem com a separação de proteínas de baixo peso molecular durante a IEF, recomenda-se removê-las do soro utilizando uma coluna de depleção.
Extração de proteínas de tecido vegetal
O tecido vegetal fresco e macio, por exemplo, musgo, etc., pode ser facilmente desintegrado colocando simplesmente o material da amostra cortado em tampão de lise para sonicação. Os tecidos vegetais resistentes e lenhosos, como sementes, agulhas de abeto, etc., devem ser moídos a seco. Alguns materiais vegetais duros e lenhosos devem ser congelados e moídos em azoto líquido antes da extração por sonicação. Para suspensões de culturas de células vegetais, um tratamento ultrassónico entre 30 e 150 segundos num tampão de lise é geralmente suficiente. Materiais mais resistentes, como sementes de abóbora, requerem uma sonicação mais intensa, conforme descrito abaixo.
Protocolo para a extração ultrassónica de albumina de sementes de abóbora
Para a extração ultrassónica da proteína albumina a partir de pó de sementes de abóbora finamente moídas, adicionam-se 10 g de pó de sementes de abóbora desengordurado e 100 mL de água desionizada, como solvente, a um copo de vidro de 250mL. A extração de proteínas consiste em duas etapas: primeiro, a amostra é sonicada com um sonicador de sonda UP400St (400W, 24kHz) equipado com o sonotrodo S24d7. O copo de vidro é colocado num banho de água fria durante a homogeneização ultrassónica. O sensor de temperatura conectável e as definições de controlo da temperatura do sonicador UP400St asseguram que a temperatura da amostra se mantém sempre abaixo de 30°C. O controlo preciso da temperatura durante a sonicação evita a desnaturação da albumina. Na segunda etapa, a extração foi realizada com um misturador a uma velocidade de 200 rpm e a 30°C. Em seguida, o copo é transferido para um agitador termostatizado. A globulina é removida por diálise com água destilada. Após a remoção da globulina, podem recolher-se amostras do extrato proteico para determinar o perfil da albumina, sendo o extrato subsequentemente ajustado a pI=3,0 utilizando 0,1 M HCl para coagulação da albumina. A fase sólida é separada por centrifugação a 5000g, 20°C, e redissolvida em água desionizada. A coagulação da albumina é realizada duas vezes para aumentar a proporção de proteínas no concentrado de albumina.
A extração alcalina ultrassónica de proteínas para a preparação de concentrado proteico a partir de farelo de arroz mostra que o tratamento ultrassónico resulta num rendimento de proteínas superior num tempo de extração significativamente mais curto – em comparação com os métodos de extração convencionais.
Protocolo de preparação de amostras para a enzima iNOS funcional
Para obter a enzima iNOS plenamente funcional (por exemplo, para rastreio de fármacos), recomenda-se o seguinte protocolo: a suspensão celular deve ser colocada sobre gelo e sonicada com um UP100H a uma amplitude de 10µm, num modo de ciclos de 5 s de sonicação e 25 s de repouso sobre gelo. O procedimento deve ser repetido aproximadamente 3 vezes. O tempo de repouso entre os ciclos de sonicação reduz o aumento da temperatura e, por conseguinte, reduzirá o risco de desnaturação.
Solubilização ultrassónica de proteínas
A sonicação pode acelerar o processo de solubilização de proteínas, que normalmente requer várias horas. Para não sobreaquecer a amostra e evitar a degradação e as modificações das proteínas em soluções contendo ureia, os impulsos ultrassónicos não devem durar mais do que alguns segundos.
Sonicador UP200Ht com microponta S26d2 de 2mm para a sonicação de pequenas amostras.
Equipamento ultrassónico para extração de proteínas
A Hielscher Ultrasonics oferece uma vasta gama de homogeneizadores ultrassónicos para a desintegração de células, tecidos, bactérias, microrganismos, leveduras e esporos.
Os sonicadores de laboratório da Hielscher são potentes e fáceis de operar. Construídos para funcionamento 24/7, foram concebidos como dispositivos robustos e eficientes para laboratório e bancada. Em todos os dispositivos, a energia de saída e a amplitude podem ser controladas com precisão. A vasta gama de acessórios proporciona opções adicionais de configuração. Os sonicadores digitais, como o VialTweeter, o UP200Ht, o UP200St e o UP400St, têm controlo de temperatura integrado e um cartão SD incorporado para registo automático de dados.
Para a sonicação indireta, simultânea e sem contaminação cruzada de várias amostras, disponibilizamos o VialTweeter ou o CupHorn ultrassónico.
A tabela abaixo apresenta uma visão geral dos nossos sonicadores para preparação de amostras, rutura celular e extração. Clique no tipo de dispositivo para obter mais informações sobre cada homogeneizador ultrassónico. A nossa equipa técnica, com formação sólida e muitos anos de experiência, terá todo o gosto em ajudá-lo a escolher o sonicador mais adequado para a sua preparação de amostras!
| Volume por lote | Caudal | Dispositivos recomendados |
|---|---|---|
| até 10 frascos ou tubos | não aplicável | VialTweeter |
| placas multipoços / de microtitulação | não aplicável | UIP400MTP |
| vários tubos / recipientes | não aplicável | CupHorn |
| 1 a 500mL | 10 a 200mL/min | UP100H |
| 10 a 1000mL | 20 a 200mL/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 a 2000mL | 20 a 400mL/min | UP400St |
Consoante a sua aplicação, o material e o volume da amostra, recomendar-lhe-emos a configuração mais adequada para a sua preparação de amostras. Contacte-nos hoje!
Contacte-nos! / Pergunte-nos!
Os sonicadores digitais da Hielscher dispõem de controlo remoto através de um navegador e de registo automático de dados num cartão SD integrado.
VialTweeter para sonicação indireta.
Informações úteis
Proteómica
A proteómica é o campo de investigação que estuda as proteínas e o proteoma. As proteínas desempenham uma vasta gama de funções vitais nos organismos. O proteoma é o conjunto completo de proteínas expressas por um genoma, uma célula, um tecido ou um organismo num determinado momento. O proteoma varia ao longo do tempo e com as diferentes necessidades ou situações de stress a que uma célula ou um organismo está sujeito. Mais especificamente, é o conjunto de proteínas expressas num determinado tipo de célula ou organismo, num dado momento, em condições definidas. O termo resulta da combinação de proteínas e genoma. A proteómica é o estudo do proteoma.
Proteína
As proteínas são grandes biomoléculas, designadas macromoléculas – compostas por uma ou mais cadeias longas de resíduos de aminoácidos. As proteínas estão presentes em todos os organismos, tanto de origem vegetal como animal, e são cruciais para a maioria das funções biológicas. Como as proteínas contêm muita informação biológica, são extraídas para fins analíticos, por exemplo, para investigação em proteómica. As funções mais importantes desempenhadas pelas proteínas incluem a catálise de reações metabólicas, a replicação do DNA, a resposta a estímulos e o transporte de moléculas de um local para outro. As proteínas diferem umas das outras principalmente na sua sequência de aminoácidos, que é determinada pela sequência de nucleótidos dos seus genes e que geralmente resulta no dobramento da proteína numa estrutura tridimensional específica que determina a sua atividade. As proteínas são – além dos péptidos – um dos componentes fundamentais dos alimentos. Por conseguinte, a proteómica é uma ferramenta poderosa nas ciências alimentares para otimizar os processos, a segurança alimentar e a avaliação nutricional.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction é um procedimento pré-analítico para separar e pré-concentrar analitos. Em combinação com a sonicação, a extração no ponto de turvação pode ser intensificada, tornando o processo mais eficiente, mais rápido e mais respeitador do ambiente. Com a sonicação, a extração no ponto de turvação é um método significativamente mais eficiente de preparação de analitos. Saiba mais sobre a extração no ponto de turvação assistida por ultrassons!
Eletroforese em gel
A eletroforese em gel é o principal método de separação e análise de macromoléculas, como DNA, RNA e proteínas, bem como dos seus fragmentos, com base no seu tamanho e carga. É utilizada em química clínica para separar proteínas por carga e/ou tamanho (IEF em agarose, essencialmente independente do tamanho) e em bioquímica, biologia molecular e proteómica para separar uma população mista de fragmentos de DNA e RNA por comprimento, estimar o tamanho de fragmentos de DNA e RNA ou separar proteínas por carga.
Culturas celulares
A cultura celular é o processo de crescimento controlado pelo qual as células são cultivadas em condições controladas. As condições de cultura celular variam para cada tipo de célula. Em geral, o ambiente de uma cultura celular consiste num recipiente adequado (por exemplo, uma placa de Petri) com substrato ou meio que fornece os nutrientes essenciais (aminoácidos, hidratos de carbono, vitaminas, minerais), fatores de crescimento, hormonas e gases (CO2, O2) e regula o ambiente físico-químico (tampão de pH, pressão osmótica, temperatura). A maioria das células necessita de uma superfície ou de um substrato artificial, enquanto outras culturas celulares podem ser cultivadas livremente em suspensão no meio de cultura (cultura em suspensão, suspensão celular).
As culturas em massa de linhas celulares animais são utilizadas na produção industrial de vacinas virais e de outros produtos obtidos por biotecnologia. As células estaminais humanas são cultivadas para aumentar o número de células e diferenciá-las em vários tipos de células somáticas para fins de transplantação.
Amostras de tecido
O termo tecido descreve um nível celular intermédio, em que o material celular se encontra num nível de organização entre as células e um órgão completo. Num tecido, estão reunidas células semelhantes, com a mesma origem, que desempenham em conjunto uma função específica. O agrupamento funcional de vários tecidos forma as estruturas complexas dos órgãos.
Recolhem-se amostras de tecido para investigação em biologia, histologia/histopatologia, parasitologia, bioquímica e imuno-histoquímica, bem como para cultura de tecidos e extração de DNA. Pode distinguir-se entre tecido animal (subdivisão: tecido de mamíferos) e tecido vegetal. Os tecidos animais são agrupados nos quatro tipos básicos: conjuntivo, muscular, nervoso e epitelial. O tecido vegetal subdivide-se nos seguintes três sistemas de tecidos: a epiderme, o tecido fundamental e o tecido vascular.
As amostras de tecido podem ser preparadas a partir de partes de animais ou plantas, por exemplo, osso, músculo, folhas, etc.
Fluidos corporais
O sangue, o soro, o plasma, o líquido cefalorraquidiano, a saliva e o líquido sinovial são fluidos corporais que constituem uma excelente fonte de informação relevante para o diagnóstico. Por conseguinte, é importante uma preparação sofisticada das amostras de fluidos corporais para análise. A primeira dificuldade está associada à ampla gama dinâmica dos componentes presentes nos fluidos corporais.
Determinação da concentração de proteínas
O ensaio de Bradford, o ensaio de Lowry e o ensaio de ácido bicinconínico (BCA) são ensaios comuns para determinar a concentração de proteínas. A albumina sérica bovina (BSA) é um dos padrões proteicos mais frequentemente utilizados.
Tampão de lise
O tampão de lise deve ser escolhido de acordo com o material celular ou o tecido (cultura de tecidos, plantas, bactérias, fungos, etc.), tendo também em conta se as células estão organizadas numa estrutura e qual o tipo de estrutura. Uma vasta gama de tampões de lise para extração de proteínas, membranas e organelos é formulada com um ou mais detergentes. O detergente é normalmente selecionado através de ensaios por tentativa e erro ou – se disponível – de acordo com um protocolo de extração de proteínas existente. O detergente deve ser compatível com o tecido de origem e com as proteínas. Em geral, escolhe-se o detergente mais suave que funciona para um determinado tecido / proteína, para manter a funcionalidade máxima do extrato. Além disso, no caso da extração de membranas e organelos, um detergente suave mantém a membrana intacta. Os detergentes normalmente utilizados nos tampões de lise são, na sua maioria, não iónicos ou zwitteriónicos, por exemplo, CHAPS, desoxicolato, Triton™ X-100, NP40 e Tween 20.
Por exemplo, tecidos como cérebro, fígado, intestino, rim, baço, etc., podem ser simplesmente colocados em tampão RIPA – no entanto, devem ser incluídos inibidores de proteases e DTT (por exemplo, para eletroforese em gel).
Tampão de lise para tecido muscular esquelético (gelado): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) glicerol, 1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitol, suplementado com uma mistura de inibidores de proteases e fosfatases
Tabela de tampões comuns e respetivos intervalos de pH. Em geral, estes tampões são normalmente utilizados em concentrações de 20–50 mM.
| Tampão | Intervalo de pH |
|---|---|
| Ácido cítrico – NaOH | 2,2 – 6,5 |
| Citrato de sódio – ácido cítrico | 3,0 – 6,2 |
| Acetato de sódio – ácido acético | 3,6 – 5,6 |
| Sal de sódio do ácido cacodílico – HCl | 5,0 – 7,4 |
| MES – NaOH | 5,6 – 6,8 |
| Di-hidrogenofosfato de sódio – hidrogenofosfato dissódico | 5,8 – 8,0 |
| Imidazol – HCl | 6,2 – 7,8 |
| MOPS – KOH | 6,6 – 7,8 |
| Cloridrato de trietanolamina – NaOH | 6,8 – 8,8 |
| Tris – HCl | 7,0 – 9,0 |
| HEPES – NaOH | 7,2 – 8,2 |
| Tricina – NaOH | 7,6 – 8,6 |
| Tetraborato de sódio – ácido bórico | 7,6 – 9,2 |
| Bicina – NaOH | 7,7 – 8,9 |
| Glicina – NaOH | 8,6 – 10,6 |
Na maioria dos tampões, o pH depende da temperatura. Isto é especialmente verdade para os tampões Tris. O pKa passa de 8,06 a 25°C para 8,85 a 0°C.
(pH e pKa de um tampão: o pH mede a concentração de iões de hidrogénio numa solução aquosa. O pKa (= constante de dissociação ácida) é uma medida relacionada, mas mais específica, na medida em que ajuda a prever como uma molécula se comportará a um determinado valor de pH.)
TRIzol
O TRIzol é uma solução química utilizada para extrair RNA/DNA/proteínas durante a extração com tiocianato de guanidínio–fenol–clorofórmio. A utilização de extração com TRIzol assistida por ultrassons resulta em elevados rendimentos de DNA, RNA e proteínas a partir da mesma amostra, superando assim outros métodos de extração.
Bibliografia/Referências
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.