Extracção de Proteína de ultra-sons a partir de tecido e culturas de células
- Extracção de proteínas é um passo de preparação da amostra essencial em proteómica.
- As proteínas podem ser extraídos a partir de tecidos de plantas e animais, leveduras e microrganismos.
- A sonicação é um eficiente método fiável, extraco de protea com rendimentos elevados de proteína dentro de um curto período de tempo de extracção.
Extração de proteínas de tecidos e células
A extração de proteínas de tecidos e células cultivadas é uma etapa essencial de preparação de amostras que é realizada durante muitas técnicas bioquímicas e analíticas, como ELISA, PAGE, Western blotting, espectrometria de massa ou purificação de proteínas. A ruptura, lise e extração de células ultra-sônicas é uma técnica precisamente controlável e não térmica para garantir altos rendimentos de proteínas.
Extração de proteínas de células com o sonda ultra-sônica UP200St
- rápido
- rendimentos elevados
- altamente eficiente
- O controlo preciso sobre os parâmetros
- resultados reprodutíveis
- escalabilidade linear
Instruções gerais para lise ultra-sônica e extração de proteínas
- Controle de temperatura: Para assegurar um rendimento elevado de proteína, sem a desnaturação térmica, a temperatura durante a extracção deve ser controlada. homogeneizadores de ultra-som do estado-da-arte da Hielscher – também chamado de desintegrador ultra-sônico ou ultra-sonifier – são precisamente controlável. Eles estão equipados com um sensor de temperatura plugable. Nas opções de configuração do homogeneizador ultra-som, a temperatura máxima pode ser definido. Quando esta temperatura máxima é atingida, o ultrasonicator pára automaticamente até a amostra ter arrefecido.
- Amortecedor: A escolha de um tampão adequado e o volume correcto de solução tampão varia de tecido para tecido e deve ser figurado-a por meio de testes de tentativa-e-erro.
- Isolamento / purificação: Os lisados de proteína pode conter um excesso de biomoléculas, tais como ADN ou hidratos de carbono, os quais podem ser removidos por precipitação das proteínas (ácido desoxicolato-tricloroacético) ou mudança de tampão.
Chittapalo e Noomhorm (2009) relataram em seu estudo que o rendimento de proteínas aumentou usando sonicação e que o processo de homogeneização e lise do tecido ultra-sônico pode melhorar significativamente os processos de extração existentes – permitindo novas oportunidades de extração comerciais.
cuphorn ultra-sônica para a preparação simultânea e altamente eficaz de amostras múltiplas sob as mesmas condições para isolamento de proteínas e fragmentação de DNA.
Extracção de proteínas a partir de tecidos animais
Para a preparação de tecido de tamanho completo (por exemplo, rim, coração, pulmão, músculo, etc.), o tecido deve ser dissecado em pedaços muito pequenos com ferramentas limpas, em gelo de preferência e o mais rápido possível para evitar a degradação por proteases (por exemplo, tampão de lise tal como RIPA ou tampão de lise hipotônico que contém protease e coquetel inibidor de fosfatase). Após a dissecação, a amostra é imersa em nitrogênio líquido para congelamento instantâneo. A amostra pode ser armazenada a -80 ° C para uso posterior ou manter-se no gelo para homogeneização imediata. Imediatamente antes da extração ultra-sônica, o tampão de lise gelada (com inibidores de protease DTT, leupeptina e aprotinina) é rapidamente adicionado ao tubo de amostra (por ~ 10 mg de tecido, cerca de 600 μL de tampão são recomendados). Aprox. Recomenda-se 20-60mg de tecido por tubo de amostra.
A homogeneização, lise e extração ultra-sônicas é realizada com um homogeneizador ultra-sônico, como o UP100H ou UP200Ht, equipado com um sonotrodo de microponta. A duração da sonicação é de 60-90 seg. em um modo de ciclo ultra-sônico de 15 seg. sonicação e 10 seg. tempo de repouso. A amostra deve ser mantida no gelo o tempo todo.
Após homogeneização de ultra-sons / extracção, o lisado é centrifugado a 27000 g durante aprox. 20 minutos. Em seguida, o sobrenadante é recolhido, de modo que a concentração de proteína pode ser determinada por um ensaio de proteína, tais como Pierce ensaio de proteína BCA.
Extracção de proteínas de soro de sangue
Para uma mistura homogênea do soro e do tampão fosfato, a amostra é vórtice primeiro antes da lise celular ultra-sônica. Para a lise ultra-sônica, a amostra é sonicated com um homogeneizador de laboratório ultra-sônico como o UP100H por 8 ciclos a 20% de amplitude, para ciclos de cada 5 segundos ligado e 15 segundos desligado. A extração de proteínas é realizada por sonicação em ciclos (modo de pulsação) e colocando a amostra no gelo para que um superaquecimento e degradação térmica da amostra seja evitado. Como o soro contém uma grande quantidade de proteínas de alto peso molecular (como albumina, α1-antitripsina, transferrina, haptoglobulina, imunoglobulina G e imunoglobulina A), que interferem na separação de proteínas de baixo peso molecular durante o FEI, recomenda-se esgotá-las do soro usando uma coluna de depleção.
Extracção de proteínas a partir de tecidos de plantas
Fresca, tecido vegetal macio, por exemplo musgo etc., pode ser facilmente interrompido, basta colocar o material da amostra cortada em tampão de lise durante sonicação. Resistente, tecidos vegetais ligenous, tais como sementes, abeto agulhas, etc., deve ser moído seco. Alguns materiais, plantas lenhosas rígido deve ser congelado e triturados em azoto líquido antes de ser extraa por sonicação. Para suspensões de cultura de células de plantas, um tratamento de ultra-sons entre 30 e 150 segundos num tampão de lise é principalmente suficiente. de material mais resistente, tal como sementes de abóbora requerem uma ultra-sons mais intenso, como descrito abaixo.
Protocolo para a extracção de ultra-sons de albumina a partir de sementes de abóbora
Para a extração de proteína ultra-sônica de albumina de pó de semente de abóbora moída fina, 10 g de pó de semente de abóbora desengordurada e 100 mL de água desionizada como solvente são adicionados em um copo de vidro de 250mL. A extração da proteína consiste em duas etapas: Primeiro, a amostra é sonicated com um ultra-sonicator do tipo sonda UP400St (400W, 24kHz) equipado com sonotrodo S24d7. O copo de vidro é colocado em banho de água fria durante a homogeneização ultra-sônica. O sensor de temperatura conectável e as configurações de controle de temperatura do ultrasonicator UP400St garantem que a temperatura da amostra seja sempre mantida abaixo de 30°C. Pelo controle preciso da temperatura durante a sonicação, uma desnaturação da albumina é evitada. Em seguida, a extração foi realizada com misturador a 200 rpm e a 30°C. Em seguida, o copo é transferido para um agitador termostático. A globulina é removida por diálise com água destilada. Após a remoção da globulina, o extrato proteico pode ser amostrado para determinação do perfil de albumina e é posteriormente ajustado para pI=3,0 usando HCl 0,1 M para coagulação com albumina. A fase sólida é separada por centrifugação a 5000g, 20°C e redissolvida em água deionizada. A coagulação da albumina é realizada duas vezes para aumentar a proporção de proteínas no concentrado de albumina.
Ultra-sons extracção proteica alcalina para a preparação de concentrado de proteína do farelo de arroz mostra que o tratamento de ultra-sons resulta na produção de proteína superior em um tempo de extraco significativamente menor – em comparação com métodos de extracção convencionais.
protocolo de preparação da amostra para a enzima iNOS funcional
Para obter a enzima iNOS totalmente funcional (por exemplo, para triagem de drogas), recomenda-se o seguinte protocolo: A suspensão celular deve ser colocada no gelo e é sonicizada com uma UP100H a uma amplitude de 10μm no modo de ciclo de 5 segundos de sonicação e 25 segundos de descanso no gelo. O procedimento deve ser repetido aprox. 3 vezes. O tempo de descanso entre os ciclos de sonicação reduz o aumento da temperatura e, portanto, reduzirá o risco de desnaturação.
Ultrasonic solubilização Protein
A sonicação pode acelerar o processo de solubilização de proteína, o que geralmente requer várias horas. A fim de não aquecer a amostra e impedir a degradação da proteína e modificações em soluções que contenham ureia, as rajadas de ultra-sons não deve durar mais do que alguns segundos.
Ultrasonicator UP200Ht com microponta de 2mm S26d2 para a sonicação de pequenas amostras.
Equipamento ultra-som para extração de proteínas
Hielscher Ultrasonics oferecer uma ampla gama de homogeneizadores de ultra-sons para a desintegração de células, tecidos, bactérias, microorganismos, leveduras e esporos.
Os ultrasonicators de laboratório Hielscher são poderosos e fáceis de operar. Construídos para operação 24 horas por dia, 7 dias por semana, eles são projetados como dispositivos robustos e eficientes de laboratório e bancada. Para todos os dispositivos, a saída de energia e a amplitude podem ser controladas com precisão. A ampla gama de acessórios abre mais opções de configuração. Os ultrasonicators digitais como o VialTweeter, UP200Ht, UP200St, e UP400St têm um controle de temperatura integrado e um cartão SD embutido para gravação automática de dados.
Para a sonicação indireta, livre de contaminação cruzada e simultânea de várias amostras, oferecemos o VialTweeter ou o CupHorn ultra-sônico.
A tabela abaixo fornece uma visão geral sobre nossos ultrasonicators para preparação de amostras, interrupção de células e extração. Clique no tipo de dispositivo para obter mais informações sobre cada homogeneizador ultra-sônico. Nossa equipe técnica bem treinada e de longa data terá prazer em ajudá-lo a escolher o ultra-sonicator mais adequado para a preparação da sua amostra!
| Volume batch | Quociente de vazão | Dispositivos Recomendados |
|---|---|---|
| até 10 frascos para injetáveis ou tubos | n / D. | VialTweeter |
| placas multiwell / microtiter | n / D. | UIP400MTP |
| múltiplos tubos / vasos | n / D. | Cuphorn |
| 1 a 500mL | 10 a 200 mL / min | UP100H |
| 10 a 1000mL | 20 a 200mL/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 a 2000 mL | 20 a 400 mL / min | UP400St |
Dependendo da sua aplicação, material, e volume de amostra, que irá recomendar-lhe a configuração mais adequada para a sua preparação de amostras. Contacte-nos hoje!
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Os ultrasonicators digitais Hielscher apresentam um controle remoto do navegador e protocolo automático de dados em um cartão SD integrado.
VialTweeter por sonicao indirecta.
Fatos, vale a pena conhecer
Proteomics
Proteomics é o campo de pesquisa que investiga proteínas e proteoma. Proteínas fullfil uma vasta gama de funções vitais no interior de organismos. O proteoma é todo o conjunto de proteínas expressas por um genoma, célula, tecido, organismo ou a uma determinada hora. O proteoma varia com o tempo e distintas exigências, ou tensões, que uma célula ou organismo sofre. Mais especificamente, é o conjunto de proteínas expressas num determinado tipo de cula ou organismo, em um determinado momento, sob condições definidas. O termo é uma mistura de proteínas e genoma. Proteomics é o estudo do proteoma.
Proteína
As proteínas são são grandes biomoléculas, os chamados macromoléculas – que são compostos de uma ou mais cadeias longas de resíduos de aminoácidos. As proteínas estão presentes em todos os organismos de origem vegetal e animal e são cruciais para a maioria das funções biológicas. Uma vez que as proteínas contêm muita informação biológica, elas são extraídas para fins analíticos, por exemplo, para pesquisa proteômica. A função mais importante realizada pelas proteínas inclui a catálise de reações metabólicas, replicação de DNA, resposta a estímulos e o transporte de moléculas de um local para outro. As proteínas diferem umas das outras principalmente em sua sequência de aminoácidos, que é ditada pela sequência de nucleotídeos de seus genes, e que geralmente resulta em dobradura de proteína em uma estrutura tridimensional específica que determina sua atividade. As proteínas são – além de peptídeos – um dos principais componentes dos alimentos. Portanto, proteômica é uma ferramenta poderosa na ciência dos alimentos para otimizar os processos, segurança alimentar e avaliação nutricional.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction é um procedimento pré-analítico para separar e pré-conceber analitos. Em combinação com a ultrasonicação, a extração do ponto de nuvem pode ser intensificada, tornando o processo mais eficiente, mais rápido e mais amigável ao ambiente. Com a ultra-sonização, a extração de ponto de nuvem é um método significativamente mais eficiente de preparação de analitos. Leia mais sobre a extração de ponto de nuvem assistida por ultrassom!gel Eletroforese
A electroforese em gel é o principal método para separação e análise de macromoléculas, como ADN, ARN e proteínas assim como os seus fragmentos, com base no seu tamanho e carga. Ele é utilizado em química clínica para separar as proteínas de carga e / ou tamanho (IEF de agarose, essencialmente o tamanho independente) e em bioquímica, biologia molecular e proteómica para separar uma população mista de fragmentos de ADN e ARN por comprimento, para estimar o tamanho do ADN e fragmentos de ARN ou para separar as proteínas por carga.
Culturas de células
cultura celular é o processo de crescimento controlado pelo qual as células são cultivadas sob condições controladas. condições de cultura de células pode variar para cada tipo de célula. Em geral, o ambiente de uma cultura de células é constituída por um recipiente adequado (por exemplo, placa de Petri) com substrato ou meio que fornece os nutrientes essenciais (aminoácidos, hidratos de carbono, vitaminas, minerais), factores de crescimento, hormonas, e os gases (CO2, O2), E regula o meio ambiente físico-química (tampão de pH, pressão osmótica, temperatura). A maioria das células precisa de uma superfície ou substrato artificial, enquanto que outras culturas de células podem ser cultivadas de flutuação livre no meio de cultura (cultura em suspensão, a suspensão de células).
culturas em massa de linhas de células de animais são utilizados na produção industrial de vacinas virais e outros produtos derivados da biotecnologia. As células estaminais humanas são cultivadas para expandir o número de células e diferenciar as células em vários tipos de células somáticas para fins de transplantação.
Amostras de tecido
O termo tecido descreve um intermediário celular, onde o material de células é em um nível organizacional entre as células e um órgão completo. No tecido, células semelhantes, a partir da mesma origem que juntos realizar uma função específica, são montados. O agrupamento funcional de vários tecidos, as estruturas complexas dos órgãos são formados.
Tecido é amostrado para a pesquisa em biologia, histologia / histopatologia, parasitologia, bioquímica, imuno-histoquímica, bem como para cultivar e extrair o ADN. Pode-se distinguir entre animais (subdivisão: tecido de mamífero) e tecido de planta. Os tecidos animais são agrupados em quatro tipos básicos de conjuntivo, músculo, nervoso, e do tecido epitelial. Tecido de planta é subdividida em três dos seguintes sistemas de tecidos: a epiderme, o tecido triturado, e o tecido vascular.
As amostras de tecidos podem ser preparados a partir de partes de animais ou plantas, por exemplo ósseo, muscular, folhas, etc.
Fluidos corporais
Sangue, soro, plasma, líquido cefalorraquidiano, saliva e líquido sinovial são fluidos corporais, que oferecem uma grande fonte de informação de diagnóstico relevante. Portanto, uma preparação sofisticado de amostras de fluidos do corpo para análise é importante. A primeira dificuldade está associada com a ampla gama dinâmica de componentes presentes nos fluidos corporais.
Determinação da concentração de proteína
ensaio de Bradford, Lowry e ácido bicinconínico ensaio (BCA) são ensaios comuns para determinar a concentração de proteínas. albumina de soro bovino (BSA) é um padrão da proteína mais frequentemente utilizado.
Tampão de lise
tampão de lise deve ser escolhido de acordo com o material de células ou de tecidos (de cultura de tecidos, de plantas, bactérias, fungos, etc), e se as células são em uma estrutura e do tipo de estrutura. Uma ampla gama de lise buffers para a extracção de proteínas, membranas, organitos e são formulados com um ou mais detergentes. O detergente é geralmente seleccionado através de ensaios de tentativa-e-erro ou – se disponível – de acordo com um protocolo de extracção de proteína existente. O detergente deve ser compatível com a fonte de tecido e as proteínas. Em geral, o detergente mais suave que trabalha para um tecido / proteína específica, é escolhida a fim de manter a funcionalidade máxima do extracto. Além disso, no caso de uma extracção de membranas e organitos, um detergente suave mantém a membrana intacta. detergentes normalmente utilizados em tampões de lise são na sua maioria não iónico ou zwitteriónico, por exemplo CHAPS, desoxicolato, Triton ™ X-100, NP40, e Tween 20.
Por exemplo, tecidos, tais como cérebro, fígado, intestino, rim, baço, etc., podem ser simplesmente tamponada com RIPA – No entanto os inibidores de protease e DTT (por exemplo, por electroforese em gel) deve ser incluída.
tampão de lise para o tecido do músculo esquelético (gelado): Tris 20 mM (pH 7,8), NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, MgCl2 1 mM, 1% de Triton X-100, 10% (w / v) de glicerol, 1 mM de EDTA , 1 mM de ditiotreitol suplementado com protease e o inibidor de fosfatase cocktail
Tabela de tampões comuns e a sua gama de pH. Em geral, estes tampões são normalmente utilizados em concentrações de 20-50 mM.
| Amortecedor | intervalo de pH |
|---|---|
| Ácido cítrico – Naoh | 2,2 – 6,5 |
| Citrato de sódio – Ácido cítrico | 3,0 – 6,2 |
| acetato de sódio – ácido acético | 3,6 – 5,6 |
| sal de sódio de ácido cacodílico – Hcl | 5 – 7,4 |
| MY – Naoh | 5,6 – 6,8 |
| dihidrogenofosfato de sódio – fosfato de hidrogénio dissódico | 5,8 – 8 |
| imidazol – Hcl | 6,2 – 7,8 |
| Mops – Koh | 6,6 – 7,8 |
| cloridrato de trietanolamina – Naoh | 6,8 – 8,8 |
| Tris – Hcl | 7 – 9 |
| HEPES – Naoh | 7,2 – 8,2 |
| Tricina – Naoh | 7,6 – 8,6 |
| tetraborato de sódio – ácido bórico | 7,6 – 9,2 |
| bicina – Naoh | 7,7 – 8,9 |
| Glicina – Naoh | 8,6 – 10,6 |
A maioria dos buffers de mostrar um pH-dependência com a temperatura. Isto é especialmente verdadeiro para os buffers Tris. O pKa muda de 8,06 a 25 ° C a 8,85 a 0 ° C.
(PH e pKa de um tampão: pH mede a concentração de iões de hidrogénio em uma solução aquosa de pKa (= ácido constante de dissociação) é uma medida relacionado, mas mais específico, na medida em que ajuda a prever como uma molécula irá agir a uma específica. valor do PH.)
TRIzol
TRIzol é uma solução química utilizada para extrair ARN / ADN / proteína durante a extracção tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio. A utilização de ultra-sons assistidas Trizol resultados de extracção em alta ADN, ARN, e os rendimentos de proteínas a partir da mesma amostra e supera assim de outros métodos de extracção.
Literatura / Referências
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.