Extração ultrassônica de proteínas de culturas de tecidos e células
- A extração de proteínas é uma etapa essencial da preparação de amostras em proteômica.
- As proteínas podem ser extraídas de tecidos vegetais e animais, leveduras e microrganismos.
- A sonicação é um método de extração de proteínas confiável e eficiente que oferece altos rendimentos de proteínas em um curto tempo de extração.
Extração de proteínas de tecidos e células
A extração de proteínas de tecidos e células cultivadas é uma etapa essencial de preparação de amostras que é realizada durante muitas técnicas bioquímicas e analíticas, como ELISA, PAGE, Western blotting, espectrometria de massa ou purificação de proteínas. A ruptura, lise e extração celular ultrassônica é uma técnica não térmica e controlável com precisão para garantir altos rendimentos de proteínas.

A extração de proteínas de células com o sonda ultrassônica UP200St
- Rápido
- Altos rendimentos
- Altamente eficiente
- Controle preciso sobre os parâmetros
- Resultados reprodutíveis
- escalabilidade linear
Instruções gerais para lise ultrassônica e extração de proteínas
- Controle de temperatura: Para garantir um alto rendimento de proteína sem desnaturação térmica, a temperatura durante a extração deve ser controlada. Homogeneizadores ultrassônicos de última geração da Hielscher – também chamado de desintegrador ultrassônico ou ultrassonificador – são precisamente controláveis. Eles vêm com um sensor de temperatura conectável. Nas opções de configuração do homogeneizador ultrassônico, uma temperatura máxima pode ser definida. Quando essa temperatura máxima é atingida, o ultrassônico para automaticamente até que a amostra esfrie.
- Buffer: A escolha de um tampão adequado e o volume certo de tampão varia de tecido para tecido e deve ser descoberto por teste de tentativa e erro.
- Isolamento / purificação: Os lisados de proteínas podem conter um excesso de biomoléculas, como DNA ou carboidratos, que podem ser removidos por precipitação de proteínas (desoxicolato-ácido tricloroacético) ou troca de tampão.
Chittapalo e Noomhorm (2009) relataram em seu estudo que o rendimento de proteínas aumentou usando sonicação e que o processo ultrassônico de homogeneização e lise de tecidos pode melhorar significativamente os processos de extração existentes – permitindo novas oportunidades de extração comercial.

CupHorn ultrassônico para a preparação simultânea e altamente eficaz de amostras múltiplas sob as mesmas condições para isolamento de proteínas e fragmentação de DNA.
Extração de proteínas de tecidos animais
Para a preparação de tecido de tamanho total (por exemplo, rim, coração, pulmão, músculo, etc.), o tecido deve ser dissecado em pedaços muito pequenos com ferramentas limpas, de preferência em gelo, e o mais rápido possível para evitar a degradação por proteases (por exemplo, tampão de lise como RIPA ou tampão de lise hipotônico contendo protease e coquetel de inibidores de fosfatase). Após a dissecação, a amostra é imersa em nitrogênio líquido para congelamento instantâneo. A amostra pode ser armazenada a -80°C para uso posterior ou mantida em gelo para homogeneização imediata. Imediatamente antes da extração ultrassônica, o tampão de lise gelada (com inibidores de protease DTT, leupeptina e aprotinina) é rapidamente adicionado ao tubo de amostra (por ~ 10 mg de tecido aprox. ~ 600 μL de tampão são recomendados). Recomenda-se aprox. 20-60mg de tecido por tubo de amostra.
A homogeneização, lise e extração ultrassônicas são realizadas com um homogeneizador ultrassônico, como o UP100H ou UP200Ht, equipado com um sonotrodo de microponta. A duração da sonicação é de 60-90 segundos em um modo de ciclo ultrassônico de 15 segundos de sonicação e 10 segundos de tempo de repouso. A amostra deve ser mantida no gelo o tempo todo.
Após homogeneização / extração ultrassônica, o lisado é centrifugado a 27.000g por aprox. 20 min. Em seguida, o sobrenadante é coletado, para que a concentração de proteína possa ser determinada por um ensaio de proteína, como o ensaio de proteína de Pierce BCA.
Extração de proteínas do soro sanguíneo
Para uma mistura homogênea do soro e do tampão fosfato, a amostra é submetida a vórtice antes da lise celular ultrassônica. Para a lise ultrassônica, a amostra é sonicada com um homogeneizador de laboratório ultrassônico, como o UP100H, por 8 ciclos a 20% de amplitude, para ciclos de 5 segundos ligados e 15 segundos desligados. A extração de proteínas é realizada por sonicação em ciclos (modo de pulsação) e colocando a amostra em gelo para evitar o superaquecimento e a degradação térmica da amostra. Como o soro contém uma grande quantidade de proteínas de alto peso molecular (como albumina, α1-antitripsina, transferrina, haptoglobulina, imunoglobulina G e imunoglobulina A), que interferem na separação de proteínas de baixo peso molecular durante o IEF, recomenda-se esgotá-las do soro usando uma coluna de depleção.
Extração de proteínas do tecido vegetal
Tecidos vegetais frescos e moles, por exemplo, musgo, etc., podem ser facilmente interrompidos simplesmente colocando o material de amostra picado em tampão de lise para sonicação. Tecidos vegetais duros e ligenosos, como sementes, agulhas de abeto, etc., devem ser moídos a seco. Alguns materiais vegetais duros e lenhosos devem ser congelados e moídos em nitrogênio líquido antes de serem extraídos por sonicação. Para suspensões de cultura de células vegetais, um tratamento ultrassônico entre 30 e 150 segundos em um tampão de lise é suficiente. Material mais resistente, como sementes de abóbora, requer uma sonicação mais intensa, conforme descrito abaixo.
Protocolo para Extração Ultrassônica de Albumina de Sementes de Abóbora
Para a extração ultrassônica de proteínas de albumina de pó de semente de abóbora moída finamente, 10 g de pó de semente de abóbora desengordurada e 100 mL de água desionizada como solvente são adicionados em um copo de vidro de 250mL. A extração de proteínas consiste em duas etapas: Primeiro, a amostra é sonicada com um ultrassônico tipo sonda UP400St (400W, 24kHz) equipado com sonotrodo S24d7. O copo de vidro é colocado em banho de água fria durante a homogeneização ultrassônica. O sensor de temperatura conectável e as configurações de controle de temperatura do ultrasonicator UP400St garantem que a temperatura da amostra seja sempre mantida abaixo de 30°C. Pelo controle preciso da temperatura durante a sonicação, evita-se a desnaturação da albumina. Em segundo lugar, a extração foi realizada com um misturador na velocidade de 200 rpm e a 30°C. Em seguida, o copo é transferido para um agitador termostático. A globulina é removida por diálise com água destilada. Após a remoção da globulina, o extrato proteico pode ser amostrado para determinação do perfil de albumina e é subsequentemente ajustado para pI = 3,0 usando HCl 0,1 M para coagulação da albumina. A fase sólida é separada por centrifugação a 5000g, 20°C e dissolvida novamente em água desionizada. A coagulação da albumina é realizada duas vezes para aumentar a proporção de proteínas no concentrado de albumina.
A extração ultrassônica de proteínas alcalinas para a preparação de concentrado de proteína a partir de farelo de arroz mostra que o tratamento ultrassônico resulta em maior rendimento de proteína em um tempo de extração significativamente menor – em comparação com os métodos convencionais de extração.
Protocolo de preparação de amostras para enzima iNOS funcional
Para obter a enzima iNOS totalmente funcional (por exemplo, para triagem de drogas), recomenda-se o seguinte protocolo: A suspensão celular deve ser colocada em gelo e sonicada com um UP100H a 10μm de amplitude no modo de ciclo de 5 segundos de sonicação e 25 segundos de repouso no gelo. O procedimento deve ser repetido aprox. 3 vezes. O tempo de repouso entre os ciclos de sonicação reduz o aumento da temperatura e, portanto, reduz o risco de desnaturação.
solubilização ultrassônica de proteínas
A sonicação pode acelerar o processo de solubilização de proteínas, que geralmente requer várias horas. Para não superaquecer a amostra e evitar a degradação de proteínas e modificações em soluções contendo uréia, as rajadas ultrassônicas não devem durar mais do que alguns segundos.

Ultrassonicador UP200Ht microtip S26d2 de 2mm para a sonicação de pequenas amostras.
Equipamento ultrassônico para extração de proteínas
A Hielscher Ultrasonics oferece uma ampla gama de homogeneizadores ultrassônicos para a desintegração de células, tecidos, bactérias, microorganismos, leveduras e esporos.
Os ultrassônicos de laboratório Hielscher são poderosos e fáceis de operar. Construídos para operação 24 horas por dia, 7 dias por semana, eles são projetados como dispositivos robustos e eficientes de laboratório e de bancada. Para todos os dispositivos, a saída de energia e a amplitude podem ser controladas com precisão. A ampla gama de acessórios abre outras opções de configuração. Os ultrassônicos digitais, como o VialTweeter, UP200Ht, UP200St e UP400St, possuem um controle de temperatura integrado e um cartão SD integrado para gravação automática de dados.
Para a sonicação indireta, livre de contaminação cruzada e simultânea de várias amostras, oferecemos o VialTweeter ou o CupHorn ultrassônico.
A tabela abaixo fornece uma visão geral sobre nossos ultrassônicos para preparação de amostras, ruptura celular e extração. Clique no tipo de dispositivo para obter mais informações sobre cada homogeneizador ultrassônico. Nossa equipe técnica bem treinada e experiente terá prazer em ajudá-lo a escolher o ultrassônico mais adequado para a preparação de sua amostra!
Volume do lote | Vazão | Dispositivos recomendados |
---|---|---|
até 10 frascos ou tubos | n.a. | VialTweeter |
placas multipoços / microtitulação | n.a. | UIP400MTP |
vários tubos / vasos | n.a. | cuphorn |
1 a 500mL | 10 a 200mL/min | UP100H |
10 a 1000mL | 20 a 200mL/min | UP200Ht, UP200St |
10 a 2000mL | 20 a 400mL/min | UP400St |
Dependendo da sua aplicação, material e volume de amostra, recomendamos a configuração mais adequada para a preparação da amostra. Entre em contato conosco hoje!
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Os ultrassônicos digitais Hielscher apresentam um controle remoto do navegador e protocolo automático de dados em um cartão SD integrado.

VialTweeter para sonicação indireta.
Fatos, vale a pena conhecer
proteômica
A proteômica é o campo de pesquisa que investiga as proteínas e o proteoma. As proteínas preenchem uma vasta gama de funções vitais dentro dos organismos. O proteoma é todo o conjunto de proteínas expressas por um genoma, célula, tecido ou organismo em um determinado momento. O proteoma varia com o tempo e requisitos distintos, ou estresses, que uma célula ou organismo sofre. Mais especificamente, é o conjunto de proteínas expressas em um determinado tipo de célula ou organismo, em um determinado momento, sob condições definidas. O termo é uma mistura de proteínas e genoma. Proteômica é o estudo do proteoma.
proteína
As proteínas são grandes biomoléculas, as chamadas macromoléculas – que são compostas por uma ou mais cadeias longas de resíduos de aminoácidos. As proteínas estão presentes em todos os organismos de origem vegetal e animal e são cruciais para a maioria das funções biológicas. Como as proteínas contêm muitas informações biológicas, elas são extraídas para fins analíticos, por exemplo, para pesquisa proteômica. As funções mais importantes desempenhadas pelas proteínas incluem a catálise de reações metabólicas, replicação do DNA, resposta a estímulos e transporte de moléculas de um local para outro. As proteínas diferem umas das outras principalmente em sua sequência de aminoácidos, que é ditada pela sequência de nucleotídeos de seus genes, e que geralmente resulta no dobramento da proteína em uma estrutura tridimensional específica que determina sua atividade. As proteínas são – além de peptídeos – um dos principais componentes dos alimentos. Portanto, a proteômica é uma ferramenta poderosa na ciência de alimentos para otimizar processos, segurança alimentar e avaliação nutricional.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction é um procedimento pré-analítico para separar e pré-concentrar analitos. Em combinação com a ultrassonografia, a extração do ponto de turvação pode ser intensificada, tornando o processo mais eficiente, rápido e ecológico. Com a ultrassonografia, a extração de ponto de turvação é um método significativamente mais eficiente de preparação de analitos. Leia mais sobre extração de ponto de turvação assistida por ultrassom!Eletroforese em gel
A eletroforese em gel é o principal método para separação e análise de macromoléculas como DNA, RNA e proteínas, bem como seus fragmentos, com base em seu tamanho e carga. É usado em química clínica para separar proteínas por carga e/ou tamanho (IEF agarose, essencialmente independente de tamanho) e em bioquímica, biologia molecular e proteômica para separar uma população mista de fragmentos de DNA e RNA por comprimento, para estimar o tamanho de fragmentos de DNA e RNA ou para separar proteínas por carga.
culturas de células
A cultura de células é o processo de crescimento controlado pelo qual as células são cultivadas sob condições controladas. As condições de cultura celular variam para cada tipo de célula. Em geral, o ambiente de uma cultura de células consiste em um recipiente adequado (por exemplo, placa de Petri) com substrato ou meio que fornece os nutrientes essenciais (aminoácidos, carboidratos, vitaminas, minerais), fatores de crescimento, hormônios e gases (CO2, O2) e regula o ambiente físico-químico (tampão de pH, pressão osmótica, temperatura). A maioria das células precisa de uma superfície ou substrato artificial, enquanto outras culturas de células podem ser cultivadas livremente flutuando em meio de cultura (cultura em suspensão, suspensão celular).
As culturas em massa de linhagens de células animais são usadas na produção industrial de vacinas virais e outros produtos derivados da biotecnologia. As células-tronco humanas são cultivadas para expandir o número de células e diferenciar as células em vários tipos de células somáticas para fins de transplante.
Amostras de tecido
O termo tecido descreve um intermediário celular, onde o material celular está em um nível organizacional entre as células e um órgão completo. No tecido, células semelhantes, da mesma origem que juntas desempenham uma função específica, são montadas. Pelo agrupamento funcional de múltiplos tecidos, as estruturas complexas dos órgãos são formadas.
O tecido é amostrado para pesquisa em biologia, histologia/histopatologia, parasitologia, bioquímica, imuno-histoquímica, bem como para cultivar e extrair DNA. Pode ser distinguido entre tecido animal (subdivisão: tecido de mamífero) e tecido vegetal. Os tecidos animais são agrupados nos quatro tipos básicos de tecido conjuntivo, muscular, nervoso e epitelial. O tecido vegetal é subdividido nos três sistemas de tecidos a seguir: a epiderme, o tecido fundamental e o tecido vascular.
As amostras de tecido podem ser preparadas a partir de partes de animais ou plantas, por exemplo, ossos, músculos, folhas, etc.
Fluidos Corporais
Sangue, soro, plasma, líquido cefalorraquidiano, saliva e líquido sinovial são fluidos corporais, que oferecem uma grande fonte de informações relevantes para o diagnóstico. Portanto, uma preparação sofisticada de amostras de fluidos corporais para análise é importante. A primeira dificuldade está associada à ampla gama dinâmica de componentes presentes nos fluidos corporais.
Determinação da concentração de proteínas
O ensaio de Bradford, o ensaio de Lowry e o ensaio de ácido bicinconínico (BCA) são ensaios comuns para determinar a concentração de proteínas. A albumina sérica bovina (BSA) é um dos padrões proteicos mais utilizados.
tampão de lise
O tampão de lise deve ser escolhido de acordo com o material celular ou tecido (cultura de tecidos, plantas, bactérias, fungos, etc.) e se as células estão em uma estrutura e o tipo de estrutura. Uma ampla gama de tampões de lise para extração de proteínas, membranas e organelas é formulada com um ou mais detergentes. O detergente é geralmente selecionado por meio de testes de tentativa e erro ou – se disponível – de acordo com um protocolo de extração de proteínas existente. O detergente deve ser compatível com a fonte de tecido e as proteínas. Em geral, o detergente mais suave que funciona para um tecido / proteína específico é escolhido para manter a funcionalidade máxima do extrato. Além disso, no caso de extração de membranas e organelas, um detergente neutro mantém a membrana intacta. Os detergentes comumente usados em tampões de lise são principalmente não iônicos ou zwitteriônicos, por exemplo, CHAPS, desoxicolato, Triton™ X-100, NP40 e Tween 20.
Por exemplo, tecidos como cérebro, fígado, intestino, rim, baço, etc. podem ser simplesmente tamponados com RIPA – no entanto, inibidores de protease e TDT (por exemplo, para eletroforese em gel) devem ser incluídos.
Tampão de lise para tecido muscular esquelético (gelado): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (p/v) glicerol, 1 mM de EDTA, 1 mM de ditiotreitol suplementado com coquetel de protease e inibidor de fosfatase
Tabela de tampões comuns e sua faixa de pH. Em geral, esses tampões são normalmente usados em concentrações de 20-50 mM.
buffer | Faixa de pH |
---|---|
Ácido cítrico – NaOH | 2.2 – 6.5 |
Citrato de sódio – Ácido cítrico | 3.0 – 6.2 |
Acetato de sódio – ácido acético | 3.6 – 5.6 |
Sal de sódio de ácido cacodílico – Hcl | 5.0 – 7.4 |
Economia de mercado – NaOH | 5.6 – 6.8 |
Di-hidrogenofosfato de sódio – hidrogenofosfato dissódico | 5.8 – 8.0 |
Imidazol – Hcl | 6.2 – 7.8 |
MOPS – KOH | 6.6 – 7.8 |
Cloridrato de trietanolamina – NaOH | 6.8 – 8.8 |
Tris – Hcl | 7.0 – 9.0 |
HEPES – NaOH | 7.2 – 8.2 |
Tricina – NaOH | 7.6 – 8.6 |
Tetraborato de sódio – ácido bórico | 7.6 – 9.2 |
Bicine – NaOH | 7.7 – 8.9 |
glicina – NaOH | 8.6 – 10.6 |
A maioria dos tampões mostra uma dependência do pH com a temperatura. Isso é especialmente verdadeiro para buffers Tris. O pKa muda de 8,06 a 25 ° C para 8,85 a 0 ° C.
(pH e pKa de um tampão: o pH mede a concentração de íons de hidrogênio em uma solução aquosa. pKa (= constante de dissociação ácida) é uma medida relacionada, mas mais específica, na medida em que ajuda a prever como uma molécula agirá em um valor de pH específico.)
TRIzol
O TRIzol é uma solução química usada para extrair RNA/DNA/proteína durante a extração de tiocianato-fenol-clorofórmio de guanidínio. O uso de extração de TRIzol assistida por ultrassom resulta em altos rendimentos de DNA, RNA e proteína da mesma amostra e, portanto, supera outros métodos de extração.
Literatura/Referências
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.