Extração de proteínas por ultra-sons a partir de tecidos e culturas de células
- A extração de proteínas é uma etapa essencial da preparação de amostras em proteómica.
- As proteínas podem ser extraídas de tecidos vegetais e animais, leveduras e microorganismos.
- A sonicação é um método de extração de proteínas fiável e eficiente que permite obter elevados rendimentos proteicos num curto período de extração.
Extração de proteínas de tecidos e células
A extração de proteínas a partir de tecidos e células em cultura é uma etapa essencial da preparação de amostras que é realizada durante muitas técnicas bioquímicas e analíticas, tais como ELISA, PAGE, Western blotting, espetrometria de massa ou purificação de proteínas. A rutura, lise e extração de células por ultra-sons é uma técnica não térmica, controlável com precisão, que assegura um elevado rendimento de proteínas.
Extração de proteínas de células com o sonda ultra-sónica UP200St
- rápido
- rendimentos elevados
- Altamente eficiente
- Controlo preciso dos parâmetros
- Resultados reprodutíveis
- escalabilidade linear
Instruções gerais para lise ultra-sónica e extração de proteínas
- Controlo da temperatura: Para garantir um elevado rendimento proteico sem desnaturação térmica, a temperatura durante a extração deve ser controlada. Os homogeneizadores ultra-sónicos de última geração da Hielscher – também designado por desintegrador ultrassónico ou ultrassom – são controláveis com precisão. São fornecidos com um sensor de temperatura conectável. Nas opções de configuração do homogeneizador de ultra-sons, pode ser definida uma temperatura máxima. Quando esta temperatura máxima é atingida, o ultrassom pára automaticamente até que a amostra tenha arrefecido.
- Tampão: A escolha de um tampão adequado e do volume correto de tampão varia de tecido para tecido e tem de ser determinada por testes de tentativa e erro.
- Isolamento / purificação: Os lisados de proteínas podem conter um excesso de biomoléculas, como o ADN ou os hidratos de carbono, que podem ser removidos por precipitação de proteínas (ácido desoxicolato-tricloroacético) ou por troca de tampões.
Chittapalo e Noomhorm (2009) relataram em seu estudo que o rendimento de proteína aumentou usando sonicação e que o processo de homogeneização e lise de tecido ultra-sônico pode melhorar significativamente os processos de extração existentes – permitindo novas oportunidades de extração comercial.
CupHorn ultrassónico para a preparação simultânea e altamente eficaz de amostras múltiplas nas mesmas condições para isolamento de proteínas e fragmentação de ADN.
Extração de proteínas de tecidos animais
Para a preparação de tecido de tamanho normal (por exemplo, rim, coração, pulmão, músculo, etc.), o tecido deve ser dissecado em pedaços muito pequenos com instrumentos limpos, de preferência em gelo, e o mais rapidamente possível para evitar a degradação por proteases (por exemplo, tampão de lise como RIPA ou tampão de lise hipotónico contendo um cocktail de inibidores de proteases e fosfatases). Após a dissecação, a amostra é imersa em azoto líquido para congelação instantânea. A amostra pode ser armazenada a -80°C para utilização posterior ou ser mantida em gelo para homogeneização imediata. Imediatamente antes da extração por ultra-sons, adiciona-se rapidamente ao tubo de amostra um tampão de lise gelado (com inibidores da protease DTT, leupeptina e aprotinina) (por ~10 mg de tecido, recomenda-se cerca de ~600 μL de tampão). Recomenda-se cerca de 20-60 mg de tecido por tubo de amostra.
A homogeneização, lise e extração por ultra-sons são efectuadas com um homogeneizador de ultra-sons, como o UP100H ou o UP200Ht, equipado com um sonotrodo de micro-pontas. A duração da sonicação é de 60-90 segundos num modo de ciclo ultrassónico de 15 segundos de sonicação e 10 segundos de tempo de repouso. A amostra deve ser mantida em gelo durante todo o tempo.
Após homogeneização/extração por ultra-sons, o lisado é centrifugado a 27.000 g durante cerca de 20 min. Em seguida, o sobrenadante é recolhido, para que a concentração de proteínas possa ser determinada por um ensaio de proteínas, como o ensaio de proteínas de Pierce BCA.
Extração de proteínas do soro sanguíneo
Para obter uma mistura homogénea do soro e do tampão fosfato, a amostra é agitada em vórtice antes da lise celular por ultra-sons. Para a lise por ultra-sons, a amostra é submetida a ultra-sons com um homogeneizador ultrassónico de laboratório, como o UP100H, durante 8 ciclos a 20% de amplitude, com ciclos de 5 segundos de ativação e 15 segundos de desativação. A extração de proteínas é efectuada por sonicação em ciclos (modo de pulsação) e colocando a amostra em gelo, de modo a evitar o sobreaquecimento e a degradação térmica da amostra. Uma vez que o soro contém uma grande quantidade de proteínas de elevada massa molecular (como a albumina, a α1-antitripsina, a transferrina, a haptoglobulina, a imunoglobulina G e a imunoglobulina A), que interferem com a separação das proteínas de baixa massa molecular durante a FEI, recomenda-se a sua depleção do soro utilizando uma coluna de depleção.
Extração de proteínas de tecidos vegetais
Os tecidos vegetais frescos e moles, por exemplo musgo, etc., podem ser facilmente rompidos colocando simplesmente o material de amostra cortado em tampão de lise para sonicação. Os tecidos vegetais duros e ligeiros, como sementes, agulhas de abeto, etc., devem ser triturados a seco. Alguns materiais vegetais duros e lenhosos devem ser congelados e triturados em azoto líquido antes de serem extraídos por sonicação. Para as suspensões de culturas de células vegetais, um tratamento ultrassónico entre 30 e 150 segundos num tampão de lise é geralmente suficiente. Os materiais mais duros, como as sementes de abóbora, requerem uma sonicação mais intensa, como se descreve a seguir.
Protocolo para extração ultra-sónica de albumina a partir de sementes de abóbora
Para a extração de proteínas de ultra-sons de albumina a partir de pó de semente de abóbora moída fina, 10 g de pó de semente de abóbora desengordurada e 100 mL de água desionizada como solvente são adicionados num copo de vidro de 250 mL. A extração de proteínas consiste em duas etapas: Primeiro, a amostra é submetida a ultra-sons com um ultrassonicador do tipo sonda UP400St (400W, 24kHz) equipado com um sonotrodo S24d7. O copo de vidro é colocado num banho de água fria durante a homogeneização ultra-sónica. O sensor de temperatura conectável e as configurações de controlo de temperatura do ultrasonicator UP400St garantem que a temperatura da amostra é sempre mantida abaixo de 30 ° C. Através do controlo preciso da temperatura durante a sonicação, evita-se a desnaturação da albumina. Em segundo lugar, a extração foi realizada com um misturador a uma velocidade de 200 rpm e a 30°C. Em seguida, o copo é transferido para um agitador termostático. A globulina é removida por diálise com água destilada. Após a remoção da globulina, o extrato proteico pode ser amostrado para a determinação do perfil da albumina e é subsequentemente ajustado para pI=3,0 utilizando HCl 0,1 M para a coagulação da albumina. A fase sólida é separada por centrifugação a 5000g, 20°C e redissolvida em água desionizada. A coagulação da albumina é efectuada duas vezes para aumentar a proporção de proteínas no concentrado de albumina.
A extração de proteínas alcalinas ultra-sónicas para a preparação de concentrado de proteínas a partir de farelo de arroz mostra que o tratamento ultrassónico resulta num maior rendimento proteico num tempo de extração significativamente mais curto – em comparação com os métodos de extração convencionais.
Protocolo de preparação de amostras para a enzima iNOS funcional
Para obter a enzima iNOS totalmente funcional (por exemplo, para o rastreio de medicamentos), recomenda-se o seguinte protocolo: A suspensão de células deve ser colocada em gelo e é submetida a ultra-sons com um UP100H a uma amplitude de 10 µm no modo de ciclo de 5 segundos de ultra-sons e 25 segundos de repouso em gelo. O procedimento deve ser repetido cerca de 3 vezes. O tempo de repouso entre os ciclos de sonicação reduz o aumento da temperatura e, por conseguinte, reduz o risco de desnaturação.
solubilização de proteínas por ultra-sons
A sonicação pode acelerar o processo de solubilização das proteínas, que normalmente requer várias horas. Para não sobreaquecer a amostra e evitar a degradação e as modificações das proteínas em soluções que contenham ureia, as rajadas de ultra-sons não devem durar mais do que alguns segundos.
Ultrassom UP200Ht com microponta de 2 mm S26d2 para a sonicação de pequenas amostras.
Equipamento de ultra-sons para extração de proteínas
A Hielscher Ultrasonics oferece uma vasta gama de homogeneizadores ultra-sónicos para a desintegração de células, tecidos, bactérias, microorganismos, leveduras e esporos.
Os ultrassons de laboratório Hielscher são potentes e fáceis de operar. Construídos para funcionar 24 horas por dia, 7 dias por semana, são concebidos como dispositivos de laboratório e de bancada robustos e eficientes. Para todos os dispositivos, a saída de energia e a amplitude podem ser controladas com precisão. A vasta gama de acessórios abre outras opções de configuração. Os ultrasonicators digitais, tais como o VialTweeter, UP200Ht, UP200St, e UP400St têm um controle de temperatura integrado e um cartão SD embutido para gravação automática de dados.
Para a sonicação indireta, sem contaminação cruzada e simultânea de várias amostras, oferecemos o VialTweeter ou o CupHorn ultrassónico.
A tabela abaixo dá-lhe uma visão geral dos nossos ultrassons para preparação de amostras, rutura e extração de células. Clique no tipo de dispositivo para obter mais informações sobre cada homogeneizador de ultra-sons. A nossa equipa técnica, bem treinada e com longa experiência, terá todo o prazer em ajudá-lo a escolher o ultrassom mais adequado para a sua preparação de amostras!
| Volume do lote | caudal | Dispositivos recomendados |
|---|---|---|
| até 10 frascos ou tubos | n.d. | VialTweeter |
| placas multipoços / microtitulação | n.d. | UIP400MTP |
| vários tubos / recipientes | n.d. | CupHorn |
| 1 a 500mL | 10 a 200mL/min | UP100H |
| 10 a 1000mL | 20 a 200mL/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 a 2000mL | 20 a 400mL/min | UP400ST |
Dependendo da sua aplicação, material e volume de amostra, recomendaremos a configuração mais adequada para a preparação da sua amostra. Contacte-nos hoje mesmo!
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Os ultrassons digitais Hielscher dispõem de um controlo remoto via browser e de um protocolo automático de dados num cartão SD integrado.
VialTweeter para a sonicação indireta.
Fatos, vale a pena conhecer
proteómica
A proteómica é o campo de investigação que estuda as proteínas e o proteoma. As proteínas desempenham um vasto conjunto de funções vitais nos organismos. O proteoma é o conjunto completo de proteínas expressas por um genoma, célula, tecido ou organismo num determinado momento. O proteoma varia com o tempo e com as diferentes exigências, ou stresses, a que uma célula ou organismo é submetido. Mais especificamente, é o conjunto de proteínas expressas num determinado tipo de célula ou organismo, num determinado momento, em condições definidas. O termo é uma mistura de proteínas e genoma. A proteómica é o estudo do proteoma.
proteína
As proteínas são biomoléculas de grandes dimensões, as chamadas macromoléculas – que são compostas por uma ou mais cadeias longas de resíduos de aminoácidos. As proteínas estão presentes em todos os organismos, tanto de origem vegetal como animal, e são cruciais para a maioria das funções biológicas. Uma vez que as proteínas contêm muita informação biológica, são extraídas para fins analíticos, por exemplo, para investigação proteómica. As funções mais importantes desempenhadas pelas proteínas incluem a catálise de reacções metabólicas, a replicação do ADN, a resposta a estímulos e o transporte de moléculas de um local para outro. As proteínas diferem umas das outras principalmente na sua sequência de aminoácidos, que é ditada pela sequência de nucleótidos dos seus genes, e que normalmente resulta na dobragem da proteína numa estrutura tridimensional específica que determina a sua atividade. As proteínas são – para além dos péptidos – um dos principais componentes dos alimentos. Por conseguinte, a proteómica é uma ferramenta poderosa na ciência alimentar para otimizar os processos, a segurança alimentar e a avaliação nutricional.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction é um procedimento pré-analítico para separar e pré-concentrar analitos. Em combinação com a ultrassonografia, a extração por ponto nuvem pode ser intensificada, tornando o processo mais eficiente, mais rápido e mais amigo do ambiente. Com a ultrassonografia, a extração por ponto nuvem é um método significativamente mais eficiente de preparação de analitos. Leia mais sobre a extração de pontos de nuvem assistida por ultra-sons!Eletroforese em gel
A eletroforese em gel é o principal método de separação e análise de macromoléculas como o ADN, o ARN e as proteínas, bem como os seus fragmentos, com base no seu tamanho e carga. É utilizada em química clínica para separar proteínas por carga e/ou tamanho (IEF agarose, essencialmente independente do tamanho) e em bioquímica, biologia molecular e proteómica para separar uma população mista de fragmentos de ADN e ARN por comprimento, para estimar o tamanho dos fragmentos de ADN e ARN ou para separar proteínas por carga.
culturas celulares
A cultura de células é o processo de crescimento controlado através do qual as células são cultivadas em condições controladas. As condições de cultura celular variam consoante o tipo de célula. Em geral, o ambiente de uma cultura de células consiste num recipiente adequado (por exemplo, placa de Petri) com substrato ou meio que fornece os nutrientes essenciais (aminoácidos, hidratos de carbono, vitaminas, minerais), factores de crescimento, hormonas e gases (CO2, O2), e regula o ambiente físico-químico (tampão de pH, pressão osmótica, temperatura). A maioria das células necessita de uma superfície ou de um substrato artificial, enquanto outras culturas celulares podem ser cultivadas em flutuação livre num meio de cultura (cultura em suspensão, suspensão celular).
As culturas em massa de linhas celulares animais são utilizadas na produção industrial de vacinas virais e de outros produtos derivados da biotecnologia. As células estaminais humanas são cultivadas para aumentar o número de células e diferenciá-las em vários tipos de células somáticas para fins de transplante.
Amostras de tecido
O termo tecido descreve um intermediário celular, onde o material celular se encontra num nível organizacional entre as células e um órgão completo. Nos tecidos, estão reunidas células semelhantes, da mesma origem, que, em conjunto, desempenham uma função específica. Através do agrupamento funcional de múltiplos tecidos, formam-se as estruturas complexas dos órgãos.
Os tecidos são recolhidos para investigação em biologia, histologia/histopatologia, parasitologia, bioquímica, imunohistoquímica, bem como para cultivar e extrair ADN. Pode distinguir-se entre tecido animal (subdivisão: tecido de mamífero) e tecido vegetal. Os tecidos animais são agrupados em quatro tipos básicos: tecido conjuntivo, muscular, nervoso e epitelial. O tecido vegetal subdivide-se nos três sistemas de tecidos seguintes: a epiderme, o tecido do solo e o tecido vascular.
As amostras de tecidos podem ser preparadas a partir de partes de animais ou plantas, por exemplo, ossos, músculos, folhas, etc.
Fluidos corporais
O sangue, o soro, o plasma, o líquido cefalorraquidiano, a saliva e o líquido sinovial são fluidos corporais que oferecem uma grande fonte de informações relevantes para o diagnóstico. Por conseguinte, é importante uma preparação sofisticada das amostras de fluidos corporais para análise. A primeira dificuldade está associada à vasta gama dinâmica de componentes presentes nos fluidos corporais.
Determinação da concentração de proteínas
O ensaio de Bradford, o ensaio de Lowry e o ensaio do ácido bicinconínico (BCA) são ensaios comuns para determinar a concentração de proteínas. A albumina de soro bovino (BSA) é um dos padrões proteicos mais frequentemente utilizados.
tampão de lise
O tampão de lise deve ser escolhido de acordo com o material ou tecido celular (cultura de tecidos, plantas, bactérias, fungos, etc.), e se as células estão numa estrutura e o tipo de estrutura. Uma vasta gama de tampões de lise para extração de proteínas, membranas e organelos é formulada com um ou mais detergentes. O detergente é normalmente selecionado através de testes de tentativa e erro ou – se disponível – de acordo com um protocolo de extração de proteínas existente. O detergente deve ser compatível com a fonte de tecido e as proteínas. Em geral, é escolhido o detergente mais suave que funcione para um tecido/proteína específico, de modo a manter a funcionalidade máxima do extrato. Além disso, no caso de uma extração de membranas e organelos, um detergente suave mantém a membrana intacta. Os detergentes habitualmente utilizados nos tampões de lise são, na sua maioria, não-iónicos ou zwitteriónicos, por exemplo, CHAPS, desoxicolato, Triton™ X-100, NP40 e Tween 20.
Por exemplo, tecidos como o cérebro, o fígado, o intestino, o rim, o baço, etc. podem ser simplesmente tamponados com RIPA – No entanto, devem ser incluídos inibidores de proteases e DTT (por exemplo, para eletroforese em gel).
Tampão de lise para tecido muscular esquelético (frio): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) glicerol, 1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitol suplementado com cocktail de inibidores de proteases e fosfatases
Tabela de tampões comuns e respetiva gama de pH. Em geral, estes tampões são normalmente utilizados em concentrações de 20-50 mM.
| tampão | Gama de pH |
|---|---|
| Ácido cítrico – NaOH | 2.2 – 6.5 |
| Citrato de sódio – Ácido cítrico | 3.0 – 6.2 |
| Acetato de sódio – ácido acético | 3.6 – 5.6 |
| Sal de sódio do ácido cacodílico – HCl | 5.0 – 7.4 |
| EEM – NaOH | 5.6 – 6.8 |
| Di-hidrogenofosfato de sódio – hidrogenofosfato dissódico | 5.8 – 8.0 |
| imidazol – HCl | 6.2 – 7.8 |
| MOPS – KOH | 6.6 – 7.8 |
| Cloridrato de trietanolamina – NaOH | 6.8 – 8.8 |
| Tris – HCl | 7.0 – 9.0 |
| HEPES – NaOH | 7.2 – 8.2 |
| Tricina – NaOH | 7.6 – 8.6 |
| Tetraborato de sódio – ácido bórico | 7.6 – 9.2 |
| Bicina – NaOH | 7.7 – 8.9 |
| glicina – NaOH | 8.6 – 10.6 |
A maioria dos tampões apresenta uma dependência do pH com a temperatura. Isto é especialmente verdadeiro para os tampões Tris. O pKa muda de 8,06 a 25°C para 8,85 a 0°C.
(pH e pKa de um tampão: o pH mede a concentração de iões de hidrogénio numa solução aquosa. O pKa (= constante de dissociação dos ácidos) é uma medida relacionada, mas mais específica, na medida em que ajuda a prever o comportamento de uma molécula a um determinado valor de pH).
TRIzol
O TRIzol é uma solução química utilizada para extrair ARN/ADN/proteínas durante a extração com tiocianato de guanidínio-fenol-clorofórmio. A utilização da extração de TRIzol assistida por ultra-sons resulta em rendimentos elevados de ADN, ARN e proteínas a partir da mesma amostra e é superior a outros métodos de extração.
Literatura/Referências
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.