Hielscher tecnologia de ultra-som

Extracção de Proteína de ultra-sons a partir de tecido e culturas de células

  • Extracção de proteínas é um passo de preparação da amostra essencial em proteómica.
  • As proteínas podem ser extraídos a partir de tecidos de plantas e animais, leveduras e microrganismos.
  • A sonicação é um eficiente método fiável, extraco de protea com rendimentos elevados de proteína dentro de um curto período de tempo de extracção.

 

Extração de proteínas de tecidos e células

Extracção de proteínas a partir de tecidos e células em cultura é um passo de preparação da amostra essencial, que é realizada durante muitas técnicas bioquímicas e analíticos, tais como ELISA, PAGE, western blot, Espectrometria de massa, ou a purificação de proteínas. Ultrasonic rompimento celular, lise e extracção é uma técnica com precisão controlável para assegurar rendimentos elevados de proteínas.

Extracção de proteínas a partir de tecidos animais

Para a preparação de tecido de tamanho completo (por exemplo, rim, coração, pulmão, músculo, etc.), o tecido deve ser dissecado em pedaços muito pequenos com ferramentas limpas, em gelo de preferência e o mais rápido possível para evitar a degradação por proteases (por exemplo, tampão de lise tal como RIPA ou tampão de lise hipotônico que contém protease e coquetel inibidor de fosfatase). Após a dissecação, a amostra é imersa em nitrogênio líquido para congelamento instantâneo. A amostra pode ser armazenada a -80 ° C para uso posterior ou manter-se no gelo para homogeneização imediata. Imediatamente antes da extração ultra-sônica, o tampão de lise gelada (com inibidores de protease DTT, leupeptina e aprotinina) é rapidamente adicionado ao tubo de amostra (por ~ 10 mg de tecido, cerca de 600 μL de tampão são recomendados). Aprox. Recomenda-se 20-60mg de tecido por tubo de amostra.
Ultra-sons homogeneização, a lise e a extracção é realizada com um homogeneizador de ultra-sons, tal como o UP200Ht ou UP200St, Equipado com um sonotrodo micro-ponta. duração sonicação é de 60-90 seg. a um modo de ciclo de ultra-sons de 15 seg. de sonicação e 10 seg. tempo de descanso. A amostra deve ser mantido em gelo o tempo todo.
Após homogeneização de ultra-sons / extracção, o lisado é centrifugado a 27000 g durante aprox. 20 minutos. Em seguida, o sobrenadante é recolhido, de modo que a concentração de proteína pode ser determinada por um ensaio de proteína, tais como Pierce ensaio de proteína BCA.

O sonication da proteína é um método importante da preparação da amostra

Extração de proteínas Ultrassônicas de células com UP200St

Pedido de informação





Extracção de proteínas de soro de sangue

Para uma mistura homogénea do soro e do tampão de fosfato, a amostra é submetida a vórtice primeiro antes da lise das células ultra-sônicas. Para a lise ultra-sônica, a amostra é sonicada com um homogeneizador de laboratório ultra-sônico, como o UP100H para 8 ciclos a 20% de amplitude, para ciclos de cada 5 segundos ligado e 15 segundos desligado. Sonocation é levada a cabo por sonicationg em ciclos e colocando a amostra em gelo de modo a que um sobreaquecimento e degradação térmica da amostra é evitada. Uma vez que o soro contém uma grande quantidade de proteínas de elevado peso molecular (tais como a albumina, α1-antitripsina, transferrina, haptoglobulina, imunoglobulina G e imunoglobulina A), que interferem com a separação de proteínas de baixo peso molecular durante o IEF, recomenda-se a esgotar-los a partir do soro utilizando uma coluna de esgotamento.

Extracção de proteínas a partir de tecidos de plantas

Fresca, tecido vegetal macio, por exemplo musgo etc., pode ser facilmente interrompido, basta colocar o material da amostra cortada em tampão de lise durante sonicação. Resistente, tecidos vegetais ligenous, tais como sementes, abeto agulhas, etc., deve ser moído seco. Alguns materiais, plantas lenhosas rígido deve ser congelado e triturados em azoto líquido antes de ser extraa por sonicação. Para suspensões de cultura de células de plantas, um tratamento de ultra-sons entre 30 e 150 segundos num tampão de lise é principalmente suficiente. de material mais resistente, tal como sementes de abóbora requerem uma ultra-sons mais intenso, como descrito abaixo.

Protocolo para a extracção de ultra-sons de albumina a partir de sementes de abóbora

Ultrasonic homogeneizador de tecido UP400St com S24d40 - para extração de proteínas de plantas e tecidos animais (Clique para ampliar!)Para a extracção de proteínas de ultra-sons de albumina a partir de pó de sementes de abóbora-moído fino, 10 g de pó de sementes de abóbora desengordurada e 100 mL de água desionizada como solvente são adicionados em um copo de vidro de 250 mL. A extraco de protea consiste em dois passos: primeiro, a amostra é sonicada com uma sonda de tipo ultrasonicator UP400St (400W, 24 kHz) com sonotrodo montado S24d7. A taça de vidro é colocado num banho de água fria durante a homogeneização de ultra-sons. A configuração do ultrasonicator UP400St com o sensor de temperatura plugável assegurou que a temperatura da amostra seja sempre mantida abaixo de 30 ° C. Pelo controle preciso da temperatura durante a sonicação, evita-se uma desnaturação de albumina. Em segundo lugar, a extração foi realizada com um misturador a 200 rpm de velocidade e a 30 ° C. Depois, o copo é transferido para um agitador termostático. A globulina é removida via diálise com água destilada. Após a remoção da globulina, o extracto de proteína pode ser amostrado para determinação do perfil de albumina e é posteriormente ajustado para pI = 3,0 usando HCl 0,1 M para coagulação de albumina. A fase sólida é separada por centrifugação a 5000 g, 20 ° C e redissolvida em água desionizada. A coagulação de albumina é realizada duas vezes para aumentar a proporção de proteína no concentrado de albumina.

Ultra-sons extracção proteica alcalina para a preparação de concentrado de proteína do farelo de arroz mostra que o tratamento de ultra-sons resulta na produção de proteína superior em um tempo de extraco significativamente menor – em comparação com métodos de extracção convencionais.

Ultrasonic VialTweeter dispositivo para extração de proteínas de amostras de tecido (Clique para ampliar!)

VialTweeter por sonicao indirecta.

vantagens

  • rápido
  • rendimentos elevados
  • altamente eficiente
  • O controlo preciso sobre os parâmetros
  • resultados reprodutíveis
  • escalabilidade linear

protocolo de preparação da amostra para a enzima iNOS funcional

Para obter a enzima totalmente funcional iNOS (por exemplo, para o rastreio de drogas), recomenda-se o seguinte protocolo: A suspensão de células deve ser colocado em gelo e sonicado com um UP100H na amplitude de 10 ^ m em modo de ciclo de 5 seg. de sonicação e 25 seg. descansar no gelo. O procedimento deve ser repetido aprox. Três vezes. O tempo de descanso entre os ciclos de sonicação reduz o aumento de temperatura e, portanto, reduzir o risco de desnaturação.

Ultrasonic solubilização Protein

A sonicação pode acelerar o processo de solubilização de proteína, o que geralmente requer várias horas. A fim de não aquecer a amostra e impedir a degradação da proteína e modificações em soluções que contenham ureia, as rajadas de ultra-sons não deve durar mais do que alguns segundos.

Instruções gerais

Controle de temperatura: Para assegurar um rendimento elevado de proteína, sem a desnaturação térmica, a temperatura durante a extracção deve ser controlada. homogeneizadores de ultra-som do estado-da-arte da Hielscher – também chamado desintegrador ultra-sons ou sonificator – são precisamente controlável. Eles estão equipados com um sensor de temperatura plugable. Nas opções de configuração do homogeneizador ultra-som, a temperatura máxima pode ser definido. Quando esta temperatura máxima é atingida, o ultrasonicator pára automaticamente até a amostra ter arrefecido.
Amortecedor: A escolha de um tampão adequado e o volume correcto de solução tampão varia de tecido para tecido e deve ser figurado-a por meio de testes de tentativa-e-erro.
Isolamento / purificação: Os lisados ​​de proteína pode conter um excesso de biomoléculas, tais como ADN ou hidratos de carbono, os quais podem ser removidos por precipitação das proteínas (ácido desoxicolato-tricloroacético) ou mudança de tampão.

Chittapalo e Noomhorm (2009) relataram que o rendimento de proteína aumentada, utilizando ultra-sons e que o processo de homogeneização de tecidos e lise de ultra-sons pode melhorar os processos existentes de extracção de forma significativa – permitindo novas oportunidades de extração comerciais.

Soe protecção com invólucro de som Hielscher SPB-L e dispositivo de ultra-sons UP200St. (Clique para ampliar!)

Ultra-sons homogeneizador de tecidos UP200St para a extracção de proteínas eficiente

controle preciso do tratamento de ultra-som (Clique para ampliar!)

controle de navegador para uma operação mais precisa e controlo do processo de sonicação

Equipamento ultra-som para extração de proteínas

Hielscher Ultrasonics oferecer uma ampla gama de homogeneizadores de ultra-sons para a desintegração de células, tecidos, bactérias, microorganismos, leveduras e esporos.
ultrasonicators laboratório Hielscher são poderosos e fáceis de operar. Construído para operação 24/7, eles são concebidos como dispositivos de laboratório e de bancada robustos e eficientes. Para todos os dispositivos, a produção de energia e a amplitude pode ser controlada com precisão. A ampla gama de Acessórios abre novas opções de configuração. Os dispositivos digitais, tais como VialTweeter, UP200Ht, UP200Ste UP400St ter um controle de temperatura integrado e um built-in do cartão SD para gravação automática de dados.
Para o indirecta, transversal a contaminação livre e sonicação simultânea de várias amostras, que oferecem a VialTweeter ou o cuphorn ultra-sônica.
Dependendo da sua aplicação, material, e volume de amostra, que irá recomendar-lhe a configuração mais adequada para a sua preparação de amostras. Contacte-nos hoje!

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Literatura / Referências

  • Chittapalo t, Noomhorm A (2009): ultra-som assistido extracção alcalina de proteína a partir de farelo de arroz desengordurado e propriedades dos concentrados de proteínas. Int J Food Sci Technol 44: 1843-1849.
  • Simões, André E.S :; Pereira, Diane M .; Amaral, Joana D .; Nunes, Ana F .; Gomes, Sofia E .; Rodrigues, Pedro M .; Lo, Adrian C .; D'Hooge, Rudi; Steer, Clifford J .; Thibodeau, Stephen N .; Borralho, Pedro M .; Rodrigues, Cecília M. P. (2013): A recuperação eficiente de proteínas a partir de várias amostras de origem após armazenamento Trizol ou LS Trizol extracção de ARN e a longo prazo. BMC Genomics 2013, 14: 181.


Fatos, vale a pena conhecer

Proteomics

Proteomics é o campo de pesquisa que investiga proteínas e proteoma. Proteínas fullfil uma vasta gama de funções vitais no interior de organismos. O proteoma é todo o conjunto de proteínas expressas por um genoma, célula, tecido, organismo ou a uma determinada hora. O proteoma varia com o tempo e distintas exigências, ou tensões, que uma célula ou organismo sofre. Mais especificamente, é o conjunto de proteínas expressas num determinado tipo de cula ou organismo, em um determinado momento, sob condições definidas. O termo é uma mistura de proteínas e genoma. Proteomics é o estudo do proteoma.

Proteína

As proteínas são são grandes biomoléculas, os chamados macromoléculas – que são compostos de uma ou mais cadeias longas de resíduos de aminoácidos. As proteínas estão presentes em todos os organismos de origem vegetal e animal e são cruciais para a maioria das funções biológicas. Uma vez que as proteínas contêm muita informação biológica, elas são extraídas para fins analíticos, por exemplo, para pesquisa proteômica. A função mais importante realizada pelas proteínas inclui a catálise de reações metabólicas, replicação de DNA, resposta a estímulos e o transporte de moléculas de um local para outro. As proteínas diferem umas das outras principalmente em sua sequência de aminoácidos, que é ditada pela sequência de nucleotídeos de seus genes, e que geralmente resulta em dobradura de proteína em uma estrutura tridimensional específica que determina sua atividade. As proteínas são – além de peptídeos – um dos principais componentes dos alimentos. Portanto, proteômica é uma ferramenta poderosa na ciência dos alimentos para otimizar os processos, segurança alimentar e avaliação nutricional.

gel Eletroforese

A electroforese em gel é o principal método para separação e análise de macromoléculas, como ADN, ARN e proteínas assim como os seus fragmentos, com base no seu tamanho e carga. Ele é utilizado em química clínica para separar as proteínas de carga e / ou tamanho (IEF de agarose, essencialmente o tamanho independente) e em bioquímica, biologia molecular e proteómica para separar uma população mista de fragmentos de ADN e ARN por comprimento, para estimar o tamanho do ADN e fragmentos de ARN ou para separar as proteínas por carga.

Culturas de células

cultura celular é o processo de crescimento controlado pelo qual as células são cultivadas sob condições controladas. condições de cultura de células pode variar para cada tipo de célula. Em geral, o ambiente de uma cultura de células é constituída por um recipiente adequado (por exemplo, placa de Petri) com substrato ou meio que fornece os nutrientes essenciais (aminoácidos, hidratos de carbono, vitaminas, minerais), factores de crescimento, hormonas, e os gases (CO2, O2), E regula o meio ambiente físico-química (tampão de pH, pressão osmótica, temperatura). A maioria das células precisa de uma superfície ou substrato artificial, enquanto que outras culturas de células podem ser cultivadas de flutuação livre no meio de cultura (cultura em suspensão, a suspensão de células).
culturas em massa de linhas de células de animais são utilizados na produção industrial de vacinas virais e outros produtos derivados da biotecnologia. As células estaminais humanas são cultivadas para expandir o número de células e diferenciar as células em vários tipos de células somáticas para fins de transplantação.

Amostras de tecido

O termo tecido descreve um intermediário celular, onde o material de células é em um nível organizacional entre as células e um órgão completo. No tecido, células semelhantes, a partir da mesma origem que juntos realizar uma função específica, são montados. O agrupamento funcional de vários tecidos, as estruturas complexas dos órgãos são formados.
Tecido é amostrado para a pesquisa em biologia, histologia / histopatologia, parasitologia, bioquímica, imuno-histoquímica, bem como para cultivar e extrair o ADN. Pode-se distinguir entre animais (subdivisão: tecido de mamífero) e tecido de planta. Os tecidos animais são agrupados em quatro tipos básicos de conjuntivo, músculo, nervoso, e do tecido epitelial. Tecido de planta é subdividida em três dos seguintes sistemas de tecidos: a epiderme, o tecido triturado, e o tecido vascular.
As amostras de tecidos podem ser preparados a partir de partes de animais ou plantas, por exemplo ósseo, muscular, folhas, etc.

Fluidos corporais

Sangue, soro, plasma, líquido cefalorraquidiano, saliva e líquido sinovial são fluidos corporais, que oferecem uma grande fonte de informação de diagnóstico relevante. Portanto, uma preparação sofisticado de amostras de fluidos do corpo para análise é importante. A primeira dificuldade está associada com a ampla gama dinâmica de componentes presentes nos fluidos corporais.

Determinação da concentração de proteína

ensaio de Bradford, Lowry e ácido bicinconínico ensaio (BCA) são ensaios comuns para determinar a concentração de proteínas. albumina de soro bovino (BSA) é um padrão da proteína mais frequentemente utilizado.

Tampão de lise

tampão de lise deve ser escolhido de acordo com o material de células ou de tecidos (de cultura de tecidos, de plantas, bactérias, fungos, etc), e se as células são em uma estrutura e do tipo de estrutura. Uma ampla gama de lise buffers para a extracção de proteínas, membranas, organitos e são formulados com um ou mais detergentes. O detergente é geralmente seleccionado através de ensaios de tentativa-e-erro ou – se disponível – de acordo com um protocolo de extracção de proteína existente. O detergente deve ser compatível com a fonte de tecido e as proteínas. Em geral, o detergente mais suave que trabalha para um tecido / proteína específica, é escolhida a fim de manter a funcionalidade máxima do extracto. Além disso, no caso de uma extracção de membranas e organitos, um detergente suave mantém a membrana intacta. detergentes normalmente utilizados em tampões de lise são na sua maioria não iónico ou zwitteriónico, por exemplo CHAPS, desoxicolato, Triton ™ X-100, NP40, e Tween 20.
Por exemplo, tecidos, tais como cérebro, fígado, intestino, rim, baço, etc., podem ser simplesmente tamponada com RIPA – No entanto os inibidores de protease e DTT (por exemplo, por electroforese em gel) deve ser incluída.
tampão de lise para o tecido do músculo esquelético (gelado): Tris 20 mM (pH 7,8), NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, MgCl2 1 mM, 1% de Triton X-100, 10% (w / v) de glicerol, 1 mM de EDTA , 1 mM de ditiotreitol suplementado com protease e o inibidor de fosfatase cocktail
Tabela de tampões comuns e a sua gama de pH. Em geral, estes tampões são normalmente utilizados em concentrações de 20-50 mM.

Amortecedor intervalo de pH
Ácido cítrico – Naoh 2,2 – 6,5
Citrato de sódio – Ácido cítrico 3,0 – 6,2
acetato de sódio – ácido acético 3,6 – 5,6
sal de sódio de ácido cacodílico – Hcl 5 – 7,4
MY – Naoh 5,6 – 6,8
dihidrogenofosfato de sódio – fosfato de hidrogénio dissódico 5,8 – 8
imidazol – Hcl 6,2 – 7,8
Mops – Koh 6,6 – 7,8
cloridrato de trietanolamina – Naoh 6,8 – 8,8
Tris – Hcl 7 – 9
HEPES – Naoh 7,2 – 8,2
Tricina – Naoh 7,6 – 8,6
tetraborato de sódio – ácido bórico 7,6 – 9,2
bicina – Naoh 7,7 – 8,9
Glicina – Naoh 8,6 – 10,6

A maioria dos buffers de mostrar um pH-dependência com a temperatura. Isto é especialmente verdadeiro para os buffers Tris. O pKa muda de 8,06 a 25 ° C a 8,85 a 0 ° C.
(PH e pKa de um tampão: pH mede a concentração de iões de hidrogénio em uma solução aquosa de pKa (= ácido constante de dissociação) é uma medida relacionado, mas mais específico, na medida em que ajuda a prever como uma molécula irá agir a uma específica. valor do PH.)

TRIzol

TRIzol é uma solução química utilizada para extrair ARN / ADN / proteína durante a extracção tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio. A utilização de ultra-sons assistidas Trizol resultados de extracção em alta ADN, ARN, e os rendimentos de proteínas a partir da mesma amostra e supera assim de outros métodos de extracção.