Hielscher tecnologia de ultra-som

Ultra-sons de lise de E. Coli

  • bactérias E. coli encontram-se as bactérias mais comumente utilizadas em microbiologia e biotecnologia.
  • disruptores de células ultrassónico fornecer resultados fiáveis ​​e reprodutíveis para a lise de E. coli.
  • cavitação e corte intensas forças ainda precisamente controláveis ​​resultar em interrupção completa e rendimentos de extracção elevadas (por exemplo, proteínas, DNA).

O rompimento celular por cavitação

bactéria Escherichia coli, a fiabilidade da lisadas utilizando homogeneizadores de ultra-sons do tecido.Ultra-sons do tipo sonda homogeneizadores operar com aprox. 20.000 ciclos por segundo (em 20kHz) e provocar a cavitação em líquidos ou supsensions. áreas microscópicas cavitação acústica de pressões de vácuo do tipo e as temperaturas elevadas que rasgam células separados. Embora as temperaturas podem atingir vários milhares de graus Celsius, os volumes de cavitação são tão pequenas que não aquecem significativamente o processo. O ultra-som gerado cavitação acústico e forças de cisalhamento, perfurar ou romper a membrana celular de E. coli – dependendo da configuração do homogeneizador de ultra-som dispositivo.

Vantagens de ultra-som de lise

  • controlo preciso de lise (intensidade, amplitude, temperatura)
  • adaptação óptima para amostras específicas
  • controle de temperatura
  • para amostras muito pequenas para muito grandes (pL-se a litros)
  • tratamento mecânico puro
  • scale-up linear de laboratório para produção
O dispositivo de ultra-sons VialTweeter permite a preparação de amostras simultânea de até 10 frascos sob as mesmas condições de processo. (Clique para ampliar!)

VialTweeter para a lise de ultra-sons

Pedido de informação





Embora a lise química e enzymtic pode ser problemático – uma vez que a lise química pode alterar as estruturas de proteínas e introduzir problemas de purificação e de lise enzimática requer longos tempos de incubação e não é reproduzível – disrupção ultra-sônica é um método sofisticado rompimento celular rápido.
A lise ultrassônica é baseada apenas em forças mecânicas. Não são adicionados produtos químicos, a sônica quebra a parede da cela por forças de cisalhamento. A lise química pode alterar a estrutura proteica e introduzir problemas de purificação. A interrupção enzimática requer longos tempos de incubação e não é reprodutível. A interrupção celular ultrassônica das células bacterianas de E.coli é rápida, simples, confiável e reprodutível. É por isso que os ultrassonicadores hielscher são usados em laboratórios biológicos e bioquímicos em todo o mundo para preparação de amostras, pré-ananlíticos, diagonstics in vitro e ensaios múltiplos.

Recomendações gerais

ultrasonicator UP400St com reactor de escoamentoA sonicação é a técnica mais popular para lisar pequenas, médias e grandes quantidades de suspensões de células – de pico-litros até 100L / h (utilizando uma célula de fluxo de ultra-sons). As células são submetidas a lise por cisalhamento líquido e cavitação. DNA também é cisalhado durante a sonicação, por isso, não é necessário adicionar DNase à suspensão celular.
Controle de temperatura:
Ao pré-arrefecimento da amostra e manter a amostra durante a sonicação em gelo, a amostra a degradação térmica da amostra pode ser facilmente prevenido.
Idealmente, as amostras devem ser mantidas geladas durante a Lise, mas para a maioria das amostras é suficiente se a temperatura não sobe acima da temperatura da cultura ou fonte de tecido. Portanto, recomenda-se, para manter a suspensão no gelo e para proceda com vários pulsos ultrasônicos curtos de 5-10 seg e pausas de 10-30 seg. Durante as pausas, o calor pode dissipar-se a fim restabelecer uma baixa temperatura. Para amostras maiores da pilha, os vários reatores da pilha de fluxo com revestimentos refrigerando estão disponíveis.

Protocolos para a Preparação de E. Coli Lisados

A análise da expressão e purificação de proteína recombinante

O sedimento de E. coli foi sonicada com um sistema de ultra-sons UP100H (Hielscher). Para este fim, o sedimento celular foi ressuspenso em tampão de lise refrigerado (Tris-HCl 50 mM pH = 7,5, NaCl 100 mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM) e arrefecido em gelo durante 10 min. Em seguida, a suspensão celular foi sonicada com 10 rajadas curtas de 10 s seguidas por um intervalo de 30 s para o resfriamento. Finalmente, os resíduos de células foram removidos por ultracentrifugação a 4 ° C durante 15 min a 14000 rpm. Para confirmação da expressão de RPR, o sobrenadante foi executado em gel de poliacrilamida a 12% e analisado por SDS-PAGE e Western Blot. A purificação do RPR foi feita usando Nimais de 2resina -NTA (Invitrogen, EUA) de acordo com o manual do fabricante. Nesta etapa, foi utilizado o método de purificação nativa. A pureza da proteína purificada foi avaliada utilizando electroforese em gel de poliacrilamida a 12% e subsequente coloração com azul de Coomassie. concentração da proteína purificada foi medida por Micro BCA kit de ensaio de proteínas (Pierce, EUA). (Azarnezhad et al. 2016)

Ultra-sons UP100H disruptor celular (100W) para a lise, ruptura celular e cisalhamento do ADN.

Ultrasonic homogeneizador UP100H 100W

Crescimento celular, reticulação e Preparação de Extractos Celulares E. coli

Para SEQA e ARN polimerase ChIP-Chip E. coli MG1655 ou MG1655 ΔseqA foi cultivada a 37 ° C até um OD600 de cerca de 0,15 em 50 ml de LB (+ 0,2% de glicose) antes de adicionar 27 μl de formaldeído (37%) por ml de meio (concentração final de 1%). A reticulação foi realizada a agitação lenta (100 rpm) à temperatura ambiente durante 20 minutos, seguida de extinção com 10 ml de glicina 2,5 M (concentração final 0,5 M). Para experiências de choque térmico, E. coli MG1655 foi cultivada em 65 ml de meio LB a 30 ° C até uma OD600 de cerca de 0,3. Posteriormente, 30 ml de cultura foram transferidos para um balão pré aquecido a 43 ° C e o restante mantido a 30 ° C. A reticulação e a extinção foram como descrito acima, exceto que as células foram mantidas a 30 ou 43 ° C durante 5 minutos antes de agitação mais lenta à temperatura ambiente. As células foram recolhidas por centrifugação e lavadas duas vezes com TBS frio (pH 7,5). Após a ressuspensão em 1 ml de tampão de lise (Tris 10 mM (pH 8,0), 20% de sacarose, 50 mM de NaCl, 10 mM de EDTA, 10 mg / ml de lisozima) e incubação a 37 ° C durante 30 min seguido por adição de 4 ml de IP buffer, as células foram sonicadas em gelo com 12 vezes 30 segundos e 30 segundos de intervalo em um UP400St processador de ultra-sons (Ultrasonics Hielscher GmbH) com 100% de potência. Após centrifugação durante 10 min a 9000 g, a 800 ul de aliquotas do sobrenadante foram armazenadas a -20 ° C. (Waldminghaus 2010)

Excesso de produção e purificação de enzimas.

Para superprodução de decahistidine (His10) proteínas tagged, E. coli BL21 (DE3) foi transformada com pET19b constrói. Uma pré-cultura durante a noite foi colhido por centrifugação, e 1% foi usada para inocular uma cultura de expressão. As células que transportam pET19mgtB foram cultivadas a 22 ° C até uma densidade óptica a 600 nm (OD600) De 0,7. A cultura foi transferida para 17 ° C e induzida por 100 uM de IPTG. Após 16 h, a cultura foi colhida por centrifugação a 7500 x g a 4 ° C. As células foram ressuspensas em solução salina tamponada com 50 mM de fosfato (PBS) com NaCl 0,3 M a pH 7,4, e rompidas por ultra-sons com um sonotrodo S2 micro-ponta na UP200St ultrasonicator (Hielscher, Teltow, Alemanha) a um ciclo de 0,5 e uma amplitude de 75%.
A superprodução de gtfC decahistidine-etiquetado foi induzida a 37 ° C a uma OD600 de 0,6 com 100? M de IPTG. As células foram então incubadas durante 4 horas, colhidas e lisadas conforme indicado anteriormente para MgtB.
extractos celulares em bruto foram centrifugadas a 15000 x g e 4 ° C para sedimentar os detritos celulares. Os extractos clarificados foram carregados em colunas em bruto de 1 ml HisTrap FF utilizando um sistema ÄKTAprime Plus (GE Healthcare). As enzimas foram purificadas de acordo com o protocolo do fabricante para a eluio de gradiente de proteínas marcadas com His. soluções de proteínas eluídas foram dialisadas duas vezes contra 1000 volumes de PBS 50 mM, pH 7,4, com NaCl 0,3 M a 4 ° C. A purificação foi analisada por 12% SDS-PAGE. A concentração de proteína foi determinada pelo método de Bradford usando Roti-Quant (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemanha). (Rabausch et al. 2013)

Extracção de Proteína de bactérias E. coli
A proteína isco de interesse (neste caso, MTV1 de Arabidopsis thaliana) é fundido a um tag de GST e expressos em células BL21 de Escherichia coli (E. coli).
1. Tomar uma pelota de GST-MTV1 e GST (correspondente a 50 ml de cultura bacteriana) e ressuspender em tampão de cada extracção a frio de 2,5 mL de gelo.
2. Use um ultrasonicator UP100H (Equipado com microponta MS3-sonotrodo para pequenos volumes (2-5ml)) para romper as células bacterianas até que eles são lisadas, o que é indicado pela redução da opacidade e aumento da viscosidade. Isto tem de ser levada a cabo em gelo, e recomenda-se a sonicar em intervalos (por exemplo, 10 seg seguido de sonicação de 10 segundos sobre gelo e assim por diante). Cuidado deve ser tomado para não sonicate com muito alta intensidade. Se a formação de espuma ou a formação de um precipitado branco é detectada, a intensidade tem de ser reduzido.
3. Transferir a solução bactérias lisadas para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e centrifuga-se a 4 ° C, 16000 x g durante 20 min.

Proteínas modificadas-alicina em E. coli

O VialTweeter é um ultrasonicator confortável para pequenas homogeneização da amostraDeterminação do Conteúdo por sulfidrilo (DTNB) Ensaio de 5,5'-Ditiobis (ácido 2-nitrobenzóico)
Uma cultura de um dia para o outro de E. coli MG1655 foi usada para inocular meio mínimo de MOPS (1: 100). A cultura foi cultivada aerobicamente até uma A600 de 0,4 foi atingido. A cultura foi dividida em três culturas de 15 ml para o tratamento de stress. Uma cultura não tratada serviu como controle negativo. alicina 0,79 mM (128 ug ml-1 dediamida) ou 1 mM foi adicionado a uma das restantes duas culturas de cada. As culturas foram incubadas durante 15 min. 5 ml de cada cultura foram colhidas por centrifugação (8525 x g, 4 ° C, 10 min). As células foram lavadas duas vezes com 1 ml de PBS (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na a 10 mM2HPO4, KH 2 mM2Po4, pH 7,4, armazenados anaerobicamente antes da utilização) e centrifugados (13 000 × g, 4 ° C, 10 min). As células foram ressuspensas em tampão de lise (PBS com guanidínio HCl 6 mM, pH 7,4) antes da interrupção a 4 ° C por ultra-sonografia (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Alemanha) (3 x 1 min). Os detritos celulares foram sedimentados por centrifugação (13,000 x g, 4 ° C, 15 min). O sobrenadante foi transferido para um 3,5-ml QS-macro cuvete (10 mm) com uma barra de agitação magnética e misturado com 1 ml de tampão de lise. A extinção das amostras foi monitorizada a 412 nm com um espectrofotómetro Jasco V-650 equipado com suporte com temperatura controlada, o PSC-718 de células (Jasco) à temperatura ambiente. 100 ul de uma solução 3 mM de ditiobis (ácido 2-nitrobenzóico) foram adicionados. Extinção foi monitorada até atingir a saturação. Cálculo da concentração de tiol foi realizada utilizando o coeficiente de extinção ε412 = 13700 M-1 de Cm-1 de por tio-2-nitrobenzóico (TNB). tiol concentrações celulares foram calculados com base num volume de células de E. coli de 6,7 × 10-15 litro e uma densidade de células de A600 = 0,5 (equivalente a 1 x 108 células ml-1 de cultura). (Muller et al. 2016)

In Vivo Glutationa Determinação

E. coli MG1655 foi crescido em meio mínimo de MOPS, num volume total de 200 ml até um A600 de 0,5 foi atingido. A cultura foi dividida em culturas de 50 ml para tratamento de estresse. Após 15 min de incubação com alicina 0,79 mM, diamida 1 mM ou sulfóxido de dimetilo (controlo), as células foram colhidas a 4 000 g a 4 ° C durante 10 min. As células foram lavadas duas vezes com tampão KPE antes da ressuspensão de grânulos em 700 μl de tampão KPE. Para a desproteção, foram adicionados 300 1 de ácido sulfosalicílico 10% (p / v) antes da interrupção das células por ultra-sonografia (3 x 1 min; VialTweeter ultrasonicator). Os sobrenadantes foram recolhidos após centrifugação (30 min, 13,000g, 4 ° C). As concentrações de ácido sulf ossalicílico foram diminuiu para 1% através da adição de 3 volumes de tampão de KPE. Medições de glutationa e GSSG totais foram realizadas como descrito acima. As concentrações de glutationa celular foram calculados com base num volume de E. células de 6,7 coli×10-15 litro e uma densidade de células de A600 00,5 (equivalente a 1×108 células ml-1 de cultura). as concentrações de GSH foram calculados por subtracção do 2 [GSSG] a partir de glutationa total. (Muller et al. 2016)

disruptor ultra-som para a lise celular e extração de material biológico (Clique para ampliar!)

Sonda de tipo ultra-som UP400St

Expressão de mAspAT Humana em E. coli

Ultra-sons disruptor celular UP400St (400W) para a extracção de matéria intracelular (por exemplo, proteínas, organelos, ADN, ARN, etc.)A única colónia da estirpe BL21 de E. coli (DE3) que alberga o vector de expressão em 30 mL de meio de Luria-Bertani (LB) contendo 100? G / mL de ampicilina, e em seguida cultivou-se a 37 ° C até a densidade óptica (OD600) Atingiu 0,6. As células foram colhidas por centrifugação a 4000 × g durante 10 minutos, e ressuspensas em meio LB fresco contendo 3L 100 / mL de ampicilina.
Subsequentemente, a expressão da proteína foi induzida com isopropil 1 mM β-ᴅ-1-tiogalactopiranósido (IPTG) durante 20 h a 16ºC. As células foram colhidas por centrifugação a 8000 × g durante 15 min e lavado com tamp A (NaH2PO4 20 mM, NaCl 0,5 M, pH 7,4). (peso húmido) células de 45g aproximadas foram obtidos a partir de 3 L de cultura. Após centrifugação, os sedimentos celulares foi ressuspenso em 40 mL (para 1 L de cultura) arrefecido com gelo tampão A de extracção, e lisadas por ultra-sons à temperatura gelado utilizando um UP400St instrumento (Dr. Hielscher GmbH, Alemanha). A lise celular foi centrifugado a 12000 rpm durante 15 min para separar solúvel (sobrenadante) e fracções de precipitado (pellet). (Jiang et al. 2015)

A tabela abaixo dá-lhe uma indicação da capacidade de processamento aproximado de nossos ultrasonicators:

Volume batch Quociente de vazão Dispositivos Recomendados
00,5 a 1,5 mL n / D. VialTweeter
1 a 500mL 10 a 200 mL / min UP100H
10 a 2000 mL 20 a 400 mL / min UP200Ht, UP400St
0.1 a 20L 00,2 a 4 L / min UIP2000hdT
10 a 100L 2 de 10L / min UIP4000
n / D. 10 a 100L / min UIP16000
n / D. maior aglomerado de UIP16000

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Literatura / Referências



Fatos, vale a pena conhecer

E. coli

Escherichia coli (E. coli) é uma bactéria coliforme gram-negativa, facultativamente anaeróbia, em forma de bastoneira, do gênero Escherichia, comumente encontrada no intestino inferior de organismos de sangue quente (endotérmicos). Há um grande número de cepas de E. coli (ou subtipos) com características diversas. A maioria das cepas de E. coli são inofensivas para os seres humanos, por exemplo, cepas B e K-12 que são usadas comumente para aplicações de pesquisa em laboratórios. No entanto, algumas cepas são prejudiciais e podem causar doenças graves.
E. coli tem um papel importante na engenharia biológica moderna e microbiologia industrial desde a bactéria é fácil de manipular. aplicações de laboratório comuns que envolvem muitas vezes a utilização de E. coli, v.g. para criar o ácido desoxirribonucleico (ADN) recombinante ou para actuar como um organismo modelo.
E. coli é um hospedeiro muito versátil para a produção de proteínas heterólogas, e sistemas de expressão de proteínas múltiplas estão disponíveis para a produção de proteínas recombinantes em E. coli. Utilizando os plasmídeos que permitem a expressão de nível elevado de proteína, os genes podem ser introduzidos nas bactérias, o que permite produzir tais proteínas em quantidades elevadas em processos de fermentação industrial.
E. coli são utilizados como um fábricas celulares para produzir insulina. Outras aplicações incluem a utilização de células de E. coli modificado para desenvolver e produzir vacinas e enzimas imobilizadas, para a produção de biocombustíveis, bem como para a biorremediação.
A estirpe K-12 é uma forma mutante de E. coli que sobre-expressa a enzima fosfatase alcalina (ALP). Esta mutação ocorre devido a um defeito no gene que codifica para constantemente a enzima. Se um gene que produz um produto sem qualquer inibição isto é conhecido como actividade constitutiva. Esta forma mutante específico é utilizado para o isolamento e purificação da enzima ALP.

Ultra-sons ADN Shearing

Ultra-sons forças de cisalhamento são um método normalmente utilizado para separar a partir da célula e quebrar as cadeias de ADN em pedaços. cavitação acústica quebra as paredes celulares e membranas para extrair DNA de células e gerar fragmentos de cerca de 600 – 800 pb de comprimento, o que é ideal para análise.
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