Lise ultra-sónica de E. Coli
- A bactéria E. coli é a bactéria mais comummente utilizada em microbiologia e biotecnologia.
- Os disruptores de células ultra-sónicos fornecem resultados fiáveis e reprodutíveis para a lise de E. coli.
- Forças de cavitação e de cisalhamento intensas, mas precisamente controláveis, resultam numa rutura completa e em elevados rendimentos de extração (por exemplo, proteínas, ADN).
Porque é que a rutura ultra-sónica de células de E. coli é o método preferido?
Os homogeneizadores ultra-sónicos ou os ultrasonicadores do tipo sonda oferecem várias vantagens para a lise de E. coli, uma vez que os ultra-sons intensos rompem eficazmente as paredes e as membranas celulares. Os ultrassons do tipo sonda são amplamente utilizados para a lise de E. coli pelas seguintes razões
A extração de proteínas de células E.coli é realizada de forma eficiente com o sonda ultra-sónica UP200St
O ultrasonicador do tipo sonda oferece muitas vantagens para a lise de E. coli. O controlo fiável e preciso sobre os parâmetros do processo de ultra-sons permite otimizar os parâmetros de funcionamento, tais como a potência, a duração e o manuseamento da amostra para alcançar os resultados desejados.
Análises electroforéticas do ADN genómico de E. coli EDL933 submetido a ultra-sons de 0 - 15 min. L indica a escada de ADN.
(estudo e imagem: ©Basselet et al. 2008)
Desorganização celular por cavitação ultra-sónica
Os homogeneizadores ultra-sónicos do tipo sonda funcionam com cerca de 20.000 ciclos por segundo (a 20kHz) e provocam cavitação em líquidos ou suspensões. A cavitação acústica provoca áreas microscópicas de pressões semelhantes às do vácuo e temperaturas elevadas que destroem as células. Embora as temperaturas possam atingir vários milhares de graus Celsius, os volumes de cavitação são tão pequenos que não aquecem significativamente o processo. A cavitação acústica gerada por ultra-sons e as forças de cisalhamento perfuram ou rompem a membrana celular de células bacterianas como a E.coli. Os ultrasonicadores Hielscher permitem o controlo preciso dos parâmetros do processo, tais como a intensidade ultrassónica, a amplitude, a entrada de energia e a temperatura. Assim, o processo de lise ultra-sónica pode ser ajustado de forma óptima para o tipo de célula, cultura de células, e objetivo do processo.
- controlo preciso da lise (intensidade, amplitude, temperatura)
- resultados fiáveis e reprodutíveis
- adaptação óptima a amostras específicas
- controlo da temperatura
- para amostras muito pequenas a muito grandes (µL a litros)
- Tratamento puramente mecânico
- operação segura e de fácil utilização
- aumento de escala linear do laboratório para a produção
VialTweeter para lise por ultra-sons
Homogeneizador ultrassónico versus outras técnicas de lise
Embora a lise química e enzimática possa ser problemática – uma vez que a lise química pode alterar as estruturas das proteínas e introduzir problemas de purificação e que a lise enzimática requer longos períodos de incubação e não é reprodutível – A rutura por ultra-sons é um método sofisticado e rápido de rutura de células.
A lise por ultra-sons baseia-se apenas em forças mecânicas. Não são adicionados produtos químicos, a sonicação quebra a parede celular por forças de cisalhamento. A lise química pode alterar a estrutura das proteínas e introduzir problemas de purificação. A rutura enzimática requer tempos de incubação longos e não é reprodutível. A rutura ultra-sónica das células da bactéria E.coli é rápida, simples, fiável e reprodutível. É por isso que os ultrasonicators Hielscher são utilizados em laboratórios biológicos e bioquímicos em todo o mundo para a preparação de amostras, pré-análises, diagnósticos in-vitro e ensaios múltiplos.
Recomendações gerais para a lise por ultra-sons
A sonicação é a técnica mais popular para a lise de quantidades muito pequenas, médias e grandes de suspensões celulares – de pico-litros até 100L/h (utilizando uma célula de fluxo ultra-sónica). As células são lisadas por cisalhamento líquido e cavitação. O ADN também é cortado durante a sonicação, pelo que não é necessário adicionar DNase à suspensão de células.
Controlo da temperatura durante a lise ultra-sónica de E. coli
Ao arrefecer previamente a amostra e ao mantê-la em gelo durante a sonicação, a degradação térmica da amostra pode ser facilmente evitada.
Idealmente, as amostras devem ser mantidas em gelo durante a lise, mas para a maioria das amostras é suficiente que a temperatura não suba acima da temperatura da cultura ou da fonte de tecido. Por conseguinte, recomenda-se manter a suspensão em gelo e proceder à sonicação com vários impulsos ultra-sónicos curtos de 5-10 segundos e pausas de 10-30 segundos. Durante as pausas, o calor pode dissipar-se de modo a restabelecer uma temperatura baixa. Para amostras de células maiores, estão disponíveis vários reactores de células de fluxo com camisas de arrefecimento.
Leia aqui dicas detalhadas e recomendações para uma lise ultra-sónica bem sucedida!
Protocolos para a preparação ultra-sónica de lisados de E. Coli
Os investigadores utilizam os homogeneizadores ultra-sónicos Hielscher para a rutura de células de E. coli. Abaixo pode encontrar vários protocolos testados e comprovados para a lise de E.coli utilizando homogeneizadores ultra-sónicos Hielscher para várias aplicações relacionadas com E. coli.
Crescimento celular, reticulação e preparação de extractos de células de E. coli utilizando ultra-sons
Para SeqA e RNA polimerase ChIP-Chip, E. coli MG1655 ou MG1655 ΔseqA foi cultivada a 37°C até uma DO600 de cerca de 0,15 em 50 ml de LB (+ 0,2% de glucose) antes de serem adicionados 27 μl de formaldeído (37%) por ml de meio (concentração final de 1%). A reticulação foi efectuada com agitação lenta (100 rpm) à temperatura ambiente durante 20 minutos, seguida de extinção com 10 ml de glicina 2,5 M (concentração final 0,5 M). Para as experiências de choque térmico, E. coli MG1655 foi cultivada em 65 ml de meio LB a 30°C até atingir uma DO600 de cerca de 0,3. Subsequentemente, 30 ml de cultura foram transferidos para um balão previamente aquecido a 43°C e o restante foi mantido a 30°C. A reticulação e a extinção foram descritas acima, exceto que as células foram mantidas a 30 ou 43°C durante 5 minutos antes de serem agitadas lentamente à temperatura ambiente. As células foram recolhidas por centrifugação e lavadas duas vezes com TBS frio (pH 7,5). Após ressuspensão em 1 ml de tampão de lise (10 mM Tris (pH 8,0), 20% de sacarose, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml de lisozima) e incubação a 37°C durante 30 min, seguida da adição de 4 ml de tampão IP, as células foram submetidas a ultra-sons em gelo, com pausas de 12 vezes de 30 seg. e 30 seg., utilizando o processador ultrassónico Hielscher UP400St com uma regulação de potência de 100%. Após centrifugação durante 10 min a 9000 g, alíquotas de 800 μl do sobrenadante foram armazenadas a -20 ° C. (Waldminghaus 2010)
Sobreprodução e Purificação de Enzimas com uma Sonda Ultra-sónica
Para a sobreprodução de proteínas marcadas com decahistidina (His10), E. coli BL21(DE3) foi transformada com as construções pET19b. Uma pré-cultura de um dia para o outro foi colhida por centrifugação e 1% foi utilizado para inocular uma cultura de expressão. As células portadoras de pET19mgtB foram cultivadas a 22°C até uma densidade ótica a 600 nm (OD600) de 0,7. A cultura foi transferida para 17°C e induzida por 100 μM de IPTG. Após 16 h, a cultura foi colhida por centrifugação a 7.500 × g a 4°C. As células foram ressuspensas em solução salina tamponada com fosfato 50 mM (PBS) com NaCl 0,3 M a pH 7,4 e interrompidas por ultra-sons com um sonotrodo de microponta S2 no ultrasonicador Hielscher UP200St a um ciclo de 0,5 e uma amplitude de 75%.
A sobreprodução de GtfC marcada com decahistidina foi induzida a 37°C a uma DO600 de 0,6 com 100 μM de IPTG. As células foram então incubadas durante 4 h, colhidas e lisadas como indicado acima para MgtB.
Os extractos celulares brutos foram centrifugados a 15 000 × g e a 4 °C para sedimentar os resíduos celulares. Os extractos clarificados foram carregados em colunas HisTrap FF Crude de 1 ml, utilizando um sistema ÄKTAprime Plus. As enzimas foram purificadas de acordo com o protocolo do fabricante para a eluição em gradiente de proteínas marcadas com His. As soluções de proteínas eluídas foram dialisadas duas vezes contra 1000 volumes de PBS 50 mM, pH 7,4, com NaCl 0,3 M a 4°C. A purificação foi analisada por SDS-PAGE a 12%. A concentração de proteínas foi determinada pelo método de Bradford utilizando Roti-Quant. (Rabausch et al. 2013)
Extração ultra-sónica de proteínas de bactérias E. coli
Uma proteína isco de interesse (neste caso, MTV1 de Arabidopsis thaliana) é fundida com uma etiqueta GST e expressa em células BL21 Escherichia coli (E. coli).
- Retirar um pellet de GST-MTV1 e GST (correspondente a 50 ml de cultura bacteriana) e ressuspender cada um em 2,5 ml de tampão de extração gelado.
- Utilizar um ultrassonicador UP100H (equipado com um sonotrodo de micropontas MS3 para pequenos volumes de aproximadamente 2-5mL) para romper as células bacterianas até estas serem lisadas, o que é indicado pela redução da opacidade e pelo aumento da viscosidade. Este procedimento deve ser efectuado em gelo e recomenda-se a sonicação em intervalos (por exemplo, 10 segundos de sonicação seguidos de 10 segundos de pausa em gelo e assim sucessivamente). Deve ter-se o cuidado de não sonicar com uma intensidade demasiado elevada. Se for detectada a formação de espuma ou de um precipitado branco, a intensidade deve ser reduzida.
- Transferir a solução de bactérias lisadas para tubos de microcentrifugação de 1,5 mL e centrifugar a 4°C, 16.000 x g durante 20 min.
Ultrasonizadores do tipo sonda, como o UP400St utilizam o princípio de funcionamento da cavitação acústica para a lise eficaz da E.coli.
Análise da expressão e purificação da proteína recombinante utilizando a sonicação
O sedimento de E. coli foi sonicado com o ultrassonicador Hielscher UP100H. Para este efeito, o sedimento celular foi ressuspenso em tampão de lise refrigerado (50 mM Tris-HCl pH = 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) e arrefecido em gelo durante 10 min. Em seguida, a suspensão de células foi submetida a uma sonicação com 10 rajadas curtas de 10 s, seguidas de um intervalo de 30 s para arrefecimento. Finalmente, os resíduos celulares foram removidos por ultracentrifugação a 4°C durante 15 minutos a 14000 rpm. Para confirmar a expressão de rPR, o sobrenadante foi colocado num gel de poliacrilamida a 12% e analisado por SDS-PAGE e Western blotting. A purificação da rPR foi efectuada utilizando a resina Ni2+-NTA (Invitrogen, EUA) de acordo com o guia do fabricante. Nesta fase, foi utilizado o método de purificação nativa. A pureza da proteína purificada foi avaliada por eletroforese em gel de poliacrilamida a 12% e subsequente coloração com azul de Coomassie. A concentração de proteínas purificadas foi medida pelo kit de ensaio de proteínas Micro BCA (PIERCE, EUA). (Azarnezhad et al. 2016)
Homogeneizadores ultra-sónicos para lise de E. coli
A Hielscher Ultrasonics concebe, fabrica e fornece homogeneizadores ultra-sónicos de alto desempenho para a lise fiável e eficiente de bactérias E. coli e outros tipos de células, tecidos e culturas celulares.
O vasto portfólio de sondas ultra-sónicas, bem como de sistemas de sonicação indireta, permite-nos oferecer-lhe o homogeneizador de tecidos ultrassónico ideal para a sua aplicação de rutura e extração de células.
Conceção, fabrico e consultoria – Qualidade fabricada na Alemanha
Os ultrassons Hielscher são conhecidos pelos seus elevados padrões de qualidade e design. Software inteligente, menu intuitivo, configurações programáveis e protocolação automática de dados são apenas algumas das caraterísticas dos ultrasonicators Hielscher. Robustez e fácil operação permitem a integração suave dos nossos ultrasonicators em instalações de pesquisa e biotecnologia. Mesmo condições difíceis e ambientes exigentes são facilmente manipulados por ultrasonicators Hielscher.
A Hielscher Ultrasonics é uma empresa certificada pela ISO e dá especial ênfase aos ultrassons de alto desempenho com tecnologia de ponta e facilidade de utilização. Naturalmente, os ultrassons da Hielscher estão em conformidade com a CE e cumprem os requisitos da UL, CSA e RoHs.
O quadro seguinte dá-lhe uma indicação da capacidade de processamento aproximada dos nossos ultra-sons:
| Volume do lote | caudal | Dispositivos recomendados |
|---|---|---|
| placas multipoços / microtitulação | n.d. | UIP400MTP |
| CupHorn para frascos ou copo | n.d. | CupHorn ultrassónico |
| reator de microfluxo ultrassónico | n.d. | GDmini2 |
| até 10 frascos com 0,5 a 1,5mL | n.d. | VialTweeter |
| 0.5 a 1,5mL | n.d. | VialTweeter |
| 1 a 500mL | 10 a 200mL/min | UP100H |
| 10 a 2000mL | 20 a 400mL/min | UP200Ht, UP400ST |
| 0.1 a 20L | 0.2 a 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 a 100L | 2 a 10L/min | UIP4000 |
| n.d. | 10 a 100L/min | UIP16000 |
| n.d. | maior | grupo de UIP16000 |
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Protocolos adicionais para lise ultra-sónica de E. coli
Proteínas modificadas com alicina em E. coli usando um VialTweeter ultra-sônico
Determinação do teor de sulfidrilo através do ensaio com 5,5′-Ditiobis(ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB)
Foi utilizada uma cultura nocturna de E. coli MG1655 para inocular o meio mínimo MOPS (1:100). A cultura foi cultivada aerobicamente até se atingir um A600 de 0,4. A cultura foi dividida em três culturas de 15 ml para tratamento de stress. Uma cultura não tratada serviu como controlo negativo. Adicionou-se 0,79 mM de alicina (128 μg ml-1) ou 1 mM de diamida a cada uma das duas culturas restantes. As culturas foram incubadas durante 15 minutos. 5 ml de cada cultura foram colhidos por centrifugação (8.525 × g, 4°C, 10 min). As células foram lavadas duas vezes com 1 ml de PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, armazenado anaerobicamente antes da utilização) e centrifugadas (13.000 × g, 4°C, 10 min). As células foram ressuspensas em tampão de lise (PBS com HCl de guanidínio 6 mM, pH 7,4) antes de serem rompidas a 4°C por ultra-sons (VialTweeter ultrassons, Hielscher GmbH, Alemanha) (3 × 1 min). Os detritos celulares foram separados por centrifugação (13 000 × g, 4 °C, 15 min). O sobrenadante foi transferido para uma cuvete QS-macro de 3,5 ml (10 mm) com uma barra de agitação magnética e misturado com 1 ml de tampão de lise. A extinção das amostras foi monitorizada a 412 nm com um espetrofotómetro Jasco V-650 equipado com o suporte de célula com temperatura controlada PSC-718 à temperatura ambiente. Foram adicionados 100μl de uma solução 3 mM de ácido ditiobis(2-nitrobenzóico). A extinção foi monitorizada até atingir a saturação. O cálculo da concentração de tiol foi efectuado utilizando o coeficiente de extinção ϵ412 = 13,700 M-1 cm-1 para o ácido tio-2-nitrobenzóico (TNB). As concentrações celulares de tiol foram calculadas com base num volume de células de E. coli de 6,7 × 10-15 litro e uma densidade celular de A600 = 0,5 (equivalente a 1 × 108 células ml-1 cultura). (Müller et al. 2016)
Determinação do glutatião in vivo utilizando um triturador de células por ultra-sons
A E.coli MG1655 foi cultivada em meio mínimo MOPS num volume total de 200 ml até se atingir um A600 de 0,5. A cultura foi dividida em culturas de 50 ml para tratamento de stress. Após 15 minutos de incubação com 0,79 mM de alicina, 1 mM de diamida ou dimetilsulfóxido (controlo), as células foram colhidas a 4.000g a 4°C durante 10 minutos. As células foram lavadas duas vezes com tampão KPE antes da ressuspensão dos pellets em 700 µl de tampão KPE. Para a desproteinização, foram adicionados 300 l de ácido sulfosalicílico a 10% (p/v) antes da rutura das células por ultra-sons (3 x 1 min; VialTweeter ultrassons). Os sobrenadantes foram recolhidos após centrifugação (30 min, 13.000g, 4°C). As concentrações de ácido sulfossalicílico foram reduzidas para 1% através da adição de 3 volumes de tampão KPE. As medições de glutatião total e GSSG foram efectuadas conforme descrito acima. As concentrações de glutatião celular foram calculadas com base num volume de células de E. coli de 6,7×10-15 litro e uma densidade celular de A600 0,5 (equivalente a 1×108 células ml-1 cultura). As concentrações de GSH foram calculadas pela subtração de 2[GSSG] do glutatião total. (Müller et al. 2016)
Expressão de mAspAT humano em E. coli utilizando um homogeneizador ultrassónico
A colónia única de E. coli BL21 (DE3) que abriga o vetor de expressão em 30 mL de meio Luria-Bertani (LB) contendo 100μg/mL de ampicilina, e depois cultivada a 37ºC até a densidade ótica (OD600) atingiu 0,6. As células foram colhidas por centrifugação a 4.000 × g durante 10 min e ressuspendidas em 3L de meio LB fresco contendo 100μg/mL de ampicilina.
Posteriormente, a expressão proteica foi induzida com 1 mM de isopropil β-ᴅ-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG) durante 20 h a 16ºC. As células foram colhidas por centrifugação a 8.000 × g durante 15 min e lavadas com tampão A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Foram obtidas cerca de 45 g (peso húmido) de células a partir de 3 L de cultura. Após a centrifugação, os pellets de células foram ressuspensos em 40 mL (para 1 L de cultura) tampão de extração gelado A, e lisados por ultra-sons a temperatura gelada utilizando o triturador de células ultra-sónicas Hielscher UP400St. A lise celular foi centrifugada a 12.000 rpm durante 15 min para separar as fracções solúveis (sobrenadante) e precipitadas (pellet). (Jiang et al. 2015)
Fatos, vale a pena conhecer
E.coli
A Escherichia coli (E. coli) é uma bactéria coliforme gram-negativa, facultativamente anaeróbia, em forma de bastonete, do género Escherichia, que se encontra habitualmente no intestino inferior de organismos de sangue quente (endotérmicos). Existe um grande número de estirpes (ou subtipos) de E. coli com caraterísticas diversas. A maior parte das estirpes de E. coli são inofensivas para os seres humanos, por exemplo, as estirpes B e K-12, que são normalmente utilizadas para aplicações de investigação em laboratórios. No entanto, algumas estirpes são nocivas e podem causar doenças graves.
A E. coli desempenha um papel importante na engenharia biológica moderna e na microbiologia industrial, uma vez que a bactéria é fácil de manipular. Aplicações laboratoriais comuns que envolvem frequentemente a utilização de E. coli, por exemplo, para criar ácido desoxirribonucleico (ADN) recombinante ou para atuar como organismo modelo.
A E. coli é um hospedeiro muito versátil para a produção de proteínas heterólogas, estando disponíveis vários sistemas de expressão de proteínas para a produção de proteínas recombinantes em E. coli. Utilizando plasmídeos que permitem uma expressão de alto nível de proteínas, os genes podem ser introduzidos nas bactérias, o que permite produzir essas proteínas em grandes quantidades em processos de fermentação industrial.
As E. coli são utilizadas como fábricas de células para produzir insulina. Outras aplicações incluem a utilização de células E. coli modificadas para desenvolver e produzir vacinas e enzimas imobilizadas, para produzir biocombustíveis, bem como para bioremediação.
A estirpe K-12 é uma forma mutante de E. coli que exprime em excesso a enzima Fosfatase Alcalina (ALP). Esta mutação ocorre devido a um defeito no gene que codifica constantemente a enzima. Se um gene produz um produto sem qualquer inibição, isto é conhecido como atividade constitutiva. Esta forma mutante específica é utilizada para o isolamento e purificação da enzima ALP.
As bactérias E. coli são também muito utilizadas como fábricas de células. Os micróbios modificados (por exemplo, bactérias) e as células vegetais podem ser utilizados como as chamadas fábricas de células. Estas células geneticamente modificadas produzem moléculas, produtos químicos, polímeros, proteínas e outras substâncias, que são utilizadas, por exemplo, na indústria farmacêutica, alimentar e química. A fim de libertar as moléculas produzidas no interior de tais células de bioengenharia, a lise ultra-sónica é um método comum para romper as paredes celulares e transferir as substâncias-alvo para o líquido circundante. Leia mais sobre a lise de células de bioengenharia!
Cisalhamento ultrassónico do ADN
As forças de cisalhamento ultra-sónicas são um método comummente utilizado para libertar moléculas, organelos e proteínas do interior das células, bem como para quebrar as cadeias de ADN em pedaços. A cavitação acústica rompe as paredes e as membranas celulares para extrair o ADN das células e gerar fragmentos de cerca de 600 – 800 pb de comprimento, o que é ideal para análise.
Clique aqui para saber mais sobre homogeneizadores de ultra-sons para fragmentação de ADN!
Literatura / Referências
- Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
- Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
- Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
- Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
- Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
- Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.
A Hielscher Ultrasonics fabrica homogeneizadores ultra-sónicos de alto desempenho a partir de laboratório para dimensão industrial.