Lise ultrassónica de E. Coli

As bactérias E. coli são as bactérias mais utilizadas em microbiologia e biotecnologia.
Os dispositivos de rutura celular ultrassónica proporcionam resultados fiáveis e reprodutíveis para a lise de E. coli.
A cavitação e as forças de cisalhamento intensas, mas controláveis com precisão, resultam numa rutura completa e em elevados rendimentos de extração (p. ex., proteínas, DNA).

Porque é a rutura celular ultrassónica de E. coli o método preferido?

Os homogeneizadores ultrassónicos ou sonicadores de sonda oferecem várias vantagens para a lise de E. coli, uma vez que os ultrassons intensos rompem eficazmente as paredes e membranas celulares. Os sonicadores de sonda são amplamente utilizados para a lise de E. coli pelos seguintes motivos:

Rutura eficiente das paredes celulares: E. coli tem uma parede celular semirrígida composta por peptidoglicano, que pode ser difícil de romper com métodos de lise tradicionais. Um sonicador de sonda gera ondas ultrassónicas intensas que criam bolhas de cavitação no líquido que envolve as células. Quando estas bolhas colapsam, geram jatos de líquido a alta velocidade e ondas de choque que provocam a rutura mecânica das paredes celulares, libertando eficazmente conteúdos celulares, como biomoléculas.

Penetração melhorada: As ondas ultrassónicas geradas pela sonda / sonotrodo podem penetrar profundamente na amostra, atingindo um maior número de células de E. coli e tratando-as de forma uniforme. Isto ajuda a garantir uma lise mais uniforme em toda a amostra, resultando numa maior eficiência de rutura celular.

Tempo de processamento reduzido: A energia fornecida pelo sonicador de sonda é altamente concentrada e localizada, conduzindo a uma lise celular rápida e eficiente. Em comparação com outros métodos, como a agitação com esferas ou a lise enzimática, a sonicação pode realizar a lise de E. coli em minutos ou mesmo segundos. Embora muitas técnicas alternativas, como a congelação e descongelação, exijam vários ciclos de tratamento, a lise ultrassónica abre as células numa única etapa do processo.

Controlo da temperatura: Os sonicadores de última geração estão equipados com sensores de temperatura e software inteligente, que permite definir uma temperatura máxima do processo. O sonicador faz uma pausa automaticamente quando o limite de temperatura é atingido e inicia o processo de sonicação quando se atinge um valor de temperatura definido. Arrefecer as amostras num banho de gelo é um método simples para manter a temperatura da amostra baixa e evitar a degradação da amostra induzida pelo calor.

Escalabilidade: Os sonicadores de sonda estão disponíveis em vários tamanhos, desde dispositivos de mão a modelos industriais de grande escala. Isto torna-os adequados para processar pequenos volumes no laboratório ou para aumentar a escala em aplicações de bioprocessamento de maior dimensão, p. ex., a produção de vacinas ou a biossíntese de moléculas.

Versatilidade: Os sonicadores podem ser utilizados em várias aplicações para além da lise celular, como o cisalhamento de DNA, a extração de proteínas, a homogeneização de tecidos, a dispersão de nanopartículas e a emulsificação. Por conseguinte, investir num sonicador de sonda proporciona versatilidade em contextos de investigação ou industriais.

Os sonicadores de sonda, como o UP200St, são homogeneizadores de tecidos e dispositivos de rutura celular fiáveis, pelo que são amplamente utilizados para a preparação de amostras em genética, p. ex., para a lise de E.coli

A extração de proteínas de células de E.coli é realizada de forma eficiente com a sonda ultrassónica UP200St

O sonicador de sonda oferece muitas vantagens para a lise de E. coli. O controlo fiável e preciso dos parâmetros do processo ultrassónico permite otimizar os parâmetros de funcionamento, como a potência, a duração e o manuseamento das amostras, para obter os resultados pretendidos.

Este tutorial explica qual o tipo de sonicador mais adequado às suas tarefas de preparação de amostras, como lise, rutura celular, isolamento de proteínas e fragmentação de ADN e ARN em laboratórios, análise e investigação. Escolha o tipo de sonicador ideal para a sua aplicação, volume e número de amostras e capacidade de processamento. A Hielscher Ultrasonics tem o homogeneizador ultrassónico ideal para si!

A fragmentação ultrassónica de DNA é frequentemente utilizada como etapa de preparação de amostras na sequenciação de nova geração (NGS)

Análises eletroforéticas do DNA genómico de E. coli EDL933 submetido a 0 – 15 min de sonicação. L indica o marcador de tamanhos de DNA.
(estudo e imagem: ©Basselet et al. 2008)

Rutura celular por cavitação ultrassónica

Os homogeneizadores ultrassónicos de sonda funcionam com aprox. 20 000 ciclos por segundo (a 20kHz) e provocam cavitação em líquidos ou suspensões. A cavitação acústica cria áreas microscópicas com pressões semelhantes às do vácuo e temperaturas elevadas que rompem as células. Embora as temperaturas possam atingir vários milhares de graus Celsius, os volumes de cavitação são tão pequenos que não aquecem significativamente o processo. A cavitação acústica e as forças de cisalhamento geradas pelos ultrassons perfuram ou rompem a membrana celular de células bacterianas, como E.coli. Os sonicadores Hielscher permitem o controlo preciso de parâmetros do processo, como a intensidade ultrassónica, a amplitude, a energia fornecida e a temperatura. Assim, o processo de lise ultrassónica pode ser ajustado de forma ideal ao tipo de célula, à cultura celular e ao objetivo do processo.

Vantagens da lise ultrassónica

controlo preciso da lise (intensidade, amplitude, temperatura)
resultados fiáveis e reprodutíveis
adaptação ideal a amostras específicas
controlo da temperatura
para amostras desde muito pequenas a muito grandes (µL a litros)
tratamento puramente mecânico
funcionamento seguro e fácil de utilizar
aumento linear de escala do laboratório à produção

O dispositivo ultrassónico VialTweeter permite a preparação simultânea de amostras em até 10 frascos nas mesmas condições de processo. (Clique para ampliar!)

VialTweeter para lise ultrassónica

Homogeneizador ultrassónico versus outras técnicas de lise

Embora a lise química e enzimática possa ser problemática – uma vez que a lise química pode alterar as estruturas das proteínas e introduzir problemas de purificação, e a lise enzimática exige longos tempos de incubação e não é reprodutível – a rutura ultrassónica é um método sofisticado e rápido de rutura celular.
A lise ultrassónica baseia-se apenas em forças mecânicas. Não são adicionados produtos químicos; a sonicação rompe a parede celular por forças de cisalhamento. A lise química pode alterar a estrutura das proteínas e introduzir problemas de purificação. A rutura enzimática exige longos tempos de incubação e não é reprodutível. A rutura celular ultrassónica de células bacterianas de E.coli é rápida, simples, fiável e reprodutível. É por isso que os sonicadores Hielscher são utilizados em laboratórios de biologia e bioquímica em todo o mundo para preparação de amostras, procedimentos pré-analíticos, diagnóstico in vitro e diversos ensaios.

Recomendações gerais para a lise ultrassónica

A sonicação é a técnica mais popular para a lise de quantidades muito pequenas, médias e grandes de suspensões celulares – desde picolitros até 100L/hr (utilizando uma célula de fluxo ultrassónica). As células são lisadas pelo cisalhamento do líquido e pela cavitação. O DNA também é sujeito a cisalhamento durante a sonicação, pelo que não é necessário adicionar DNase à suspensão celular.

Controlo da temperatura durante a lise ultrassónica de E.coli
Ao arrefecer previamente a amostra e mantê-la sobre gelo durante a sonicação, é possível evitar facilmente a sua degradação térmica.
Idealmente, as amostras devem ser mantidas à temperatura do gelo durante a lise, mas, para a maioria das amostras, é suficiente que a temperatura não ultrapasse a temperatura da cultura ou do tecido de origem. Por conseguinte, recomenda-se manter a suspensão sobre gelo e efetuar a sonicação com vários impulsos ultrassónicos curtos de 5–10 sec e pausas de 10–30 sec. Durante as pausas, o calor pode dissipar-se para restabelecer uma temperatura baixa. Para amostras celulares de maior dimensão, estão disponíveis vários reatores de célula de fluxo com camisas de arrefecimento.
Leia aqui sugestões e recomendações detalhadas para uma lise ultrassónica bem-sucedida!

Protocolos para a preparação ultrassónica de lisados de E. Coli

Os investigadores utilizam homogeneizadores ultrassónicos Hielscher para a rutura celular de E.coli. Abaixo pode encontrar vários protocolos testados e comprovados para a lise de E.coli utilizando homogeneizadores ultrassónicos Hielscher em diversas aplicações relacionadas com E. coli.

Crescimento celular, reticulação e preparação de extratos celulares de E. coli utilizando ultrassons

Para ChIP-Chip de SeqA e RNA polimerase, E. coli MG1655 ou MG1655 ΔseqA foi cultivada a 37°C até uma OD₆₀₀ de cerca de 0,15 em 50 ml de LB (+ 0,2% de glucose), antes de serem adicionados 27 μl de formaldeído (37%) por ml de meio (concentração final de 1%). A reticulação foi realizada com agitação lenta (100 rpm) à temperatura ambiente durante 20 min, seguida da interrupção da reação com 10 ml de glicina 2,5 M (concentração final de 0,5 M). Para as experiências de choque térmico, E. coli MG1655 foi cultivada em 65 ml de meio LB a 30°C até uma OD₆₀₀ de cerca de 0,3. Posteriormente, 30 ml de cultura foram transferidos para um frasco previamente aquecido a 43°C e o restante foi mantido a 30°C. A reticulação e a interrupção da reação foram realizadas como descrito acima, exceto que as células foram mantidas a 30 ou 43°C durante 5 min antes de se prosseguir com a agitação lenta à temperatura ambiente. As células foram recolhidas por centrifugação e lavadas duas vezes com TBS frio (pH7.5). Após ressuspensão em 1 ml de tampão de lise (10 mM de Tris (pH 8,0), 20% de sacarose, 50 mM de NaCl, 10 mM de EDTA, 10 mg/ml de lisozima) e incubação a 37°C durante 30 min, seguida da adição de 4 ml de tampão IP, as células foram sonicadas sobre gelo em 12 períodos de 30 sec, com pausas de 30 sec, utilizando o processador ultrassónico Hielscher UP400St com a potência definida a 100%. Após centrifugação durante 10 min a 9000 g, alíquotas de 800 μl do sobrenadante foram armazenadas a -20°C. (Waldminghaus 2010)

Sobreprodução e purificação de enzimas com uma sonda ultrassónica

Para a sobreprodução de proteínas com etiqueta de deca-histidina (His10), E. coli BL21(DE3) foi transformada com construções pET19b. Uma pré-cultura incubada durante a noite foi recolhida por centrifugação, e 1% foi utilizado para inocular uma cultura de expressão. As células portadoras de pET19mgtB foram cultivadas a 22°C até uma densidade ótica a 600 nm (OD600) de 0,7. A cultura foi transferida para 17°C e induzida com 100 μM de IPTG. Após 16 h, a cultura foi recolhida por centrifugação a 7 500 × g a 4°C. As células foram ressuspensas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) 50 mM com 0,3 M de NaCl a pH 7,4 e rompidas por sonicação com um sonotrodo de microponta S2 no sonicador Hielscher UP200St, com um ciclo de 0,5 e uma amplitude de 75%.
A sobreprodução de GtfC com etiqueta de deca-histidina foi induzida a 37°C a uma OD₆₀₀ de 0,6 com 100 μM de IPTG. As células foram então incubadas durante 4 h, recolhidas e lisadas como indicado acima para MgtB.
Os extratos celulares brutos foram centrifugados a 15 000 × g e 4°C para sedimentar os detritos celulares. Os extratos clarificados foram aplicados em colunas HisTrap FF Crude de 1 ml utilizando um sistema ÄKTAprime Plus. As enzimas foram purificadas de acordo com o protocolo do fabricante para a eluição em gradiente de proteínas com etiqueta His. As soluções de proteínas eluídas foram dialisadas duas vezes contra 1 000 volumes de PBS 50 mM, pH 7,4, com 0,3 M de NaCl a 4°C. A purificação foi analisada por SDS-PAGE a 12%. A concentração de proteína foi determinada pelo método de Bradford utilizando Roti-Quant. (Rabausch et al. 2013)

Extração ultrassónica de proteínas de bactérias E. coli
Uma proteína isco de interesse (neste caso, MTV1 de Arabidopsis thaliana) é fundida com uma etiqueta GST e expressa em células BL21 de Escherichia coli (E. coli).

Recolha um sedimento de GST-MTV1 e um de GST (correspondentes a 50 ml de cultura bacteriana) e ressuspenda cada um em 2,5 mL de tampão de extração arrefecido à temperatura do gelo.
Utilize um sonicador UP100H (equipado com um sonotrodo de microponta MS3 para pequenos volumes de aprox. 2–5mL) para romper as células bacterianas até serem lisadas, o que é indicado pela redução da opacidade e pelo aumento da viscosidade. Este procedimento tem de ser realizado sobre gelo, e recomenda-se efetuar a sonicação em intervalos (p. ex., 10 sec de sonicação seguidos de uma pausa de 10 sec sobre gelo, e assim sucessivamente). É necessário ter cuidado para não efetuar a sonicação com uma intensidade demasiado elevada. Se for detetada a formação de espuma ou de um precipitado branco, a intensidade tem de ser reduzida.
Transfira a solução de bactérias lisadas para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e centrifugue a 4°C, 16 000 x g durante 20 min.

As sondas ultrassónicas utilizam as forças da cavitação acústica para romper células e extrair moléculas e DNA de E.coli.

Os sonicadores de sonda, como o UP400St, utilizam o princípio de funcionamento da cavitação acústica para a lise eficiente de E.coli.

Análise da expressão e purificação de proteína recombinante utilizando sonicação

O sedimento de E. coli foi sonicado com o sonicador Hielscher UP100H. Para este efeito, o sedimento celular foi ressuspenso em tampão de lise refrigerado (50 mM de Tris-HCl pH=7,5, 100 mM de NaCl, 5 mM de DTT, 1 mM de PMSF) e arrefecido sobre gelo durante 10 min. Em seguida, a suspensão celular foi sonicada com 10 impulsos curtos de 10 s, seguidos de intervalos de 30 s para arrefecimento. Por fim, os detritos celulares foram removidos por ultracentrifugação a 4°C durante 15 min a 14 000 rpm. Para confirmar a expressão de rPR, o sobrenadante foi submetido a eletroforese num gel de poliacrilamida a 12% e analisado por SDS-PAGE e Western blotting. A purificação de rPR foi realizada utilizando resina Ni2+-NTA (Invitrogen, USA) de acordo com o guia do fabricante. Nesta etapa, foi utilizado o método de purificação em condições nativas. A pureza da proteína purificada foi avaliada por eletroforese no gel de poliacrilamida a 12% e subsequente coloração com azul de Coomassie. A concentração da proteína purificada foi medida com o kit de ensaio de proteínas Micro BCA (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al. 2016)

Este vídeo mostra o sonotrodo ultrassónico tipo copo de 200 watts para dispersão, homogeneização, extração ou desgaseificação de amostras de laboratório.

Homogeneizadores ultrassónicos para a lise de E. coli

A Hielscher Ultrasonics concebe, fabrica e fornece homogeneizadores ultrassónicos de elevado desempenho para a lise fiável e eficiente de bactérias E. coli e de outros tipos de células, tecidos e culturas celulares.
O vasto portefólio de sondas ultrassónicas, bem como de sistemas de sonicação indireta, permite-nos oferecer-lhe o homogeneizador ultrassónico de tecidos ideal para a sua aplicação de rutura celular e extração.

Conceção, fabrico e consultoria – Qualidade fabricada na Alemanha

Os sonicadores Hielscher são conhecidos pelos seus padrões de qualidade e conceção do mais alto nível. Software inteligente, menu intuitivo, definições programáveis e registo automático de dados são apenas algumas das características dos sonicadores Hielscher. A robustez e a facilidade de utilização permitem a integração harmoniosa dos nossos sonicadores em instalações de investigação e biotecnologia. Os sonicadores Hielscher lidam facilmente até com condições adversas e ambientes exigentes.

A Hielscher Ultrasonics é uma empresa com certificação ISO e dá especial destaque a sonicadores de elevado desempenho com tecnologia de última geração e facilidade de utilização. Naturalmente, os sonicadores Hielscher cumprem os requisitos CE e satisfazem os requisitos de UL, CSA e RoHs.

A tabela abaixo dá-lhe uma indicação da capacidade aproximada de processamento dos nossos sonicadores:

Volume por lote	Caudal	Dispositivos recomendados
placas multipoços / de microtitulação	n.a.	UIP400MTP
CupHorn para frascos ou copo de precipitação	n.a.	CupHorn ultrassónico
microrreator de fluxo ultrassónico	n.a.	GDmini2
até 10 frascos com 0,5 a 1,5mL	n.a.	VialTweeter
0,5 a 1,5mL	n.a.	VialTweeter
1 a 500mL	10 a 200mL/min	UP100H
10 a 2000mL	20 a 400mL/min	UP200Ht, UP400St
0,1 a 20L	0,2 a 4L/min	UIP2000hdT
10 a 100L	2 a 10L/min	UIP4000
n.a.	10 a 100L/min	UIP16000
n.a.	superior	conjunto de UIP16000

Contacte-nos! / Coloque-nos as suas questões!

O vídeo mostra o sistema de preparação ultrassónica de amostras UIP400MTP, que permite preparar amostras de forma fiável em qualquer placa multipoços padrão, utilizando ultrassons de alta intensidade. As aplicações típicas do UIP400MTP incluem a lise celular, a fragmentação de ADN, ARN e cromatina, bem como a extração de proteínas.

Protocolos adicionais para a lise ultrassónica de E. coli

Proteínas modificadas por alicina em E. coli utilizando um VialTweeter ultrassónico

Determinação do teor de grupos sulfidrilo por ensaio com ácido 5,5′-ditiobis(2-nitrobenzoico) (DTNB)
Uma cultura de E. coli MG1655 incubada durante a noite foi utilizada para inocular meio mínimo MOPS (1:100). A cultura foi cultivada em condições aeróbias até atingir uma A600 de 0,4. A cultura foi dividida em três culturas de 15 ml para tratamento de stress. Uma cultura não tratada serviu de controlo negativo. A uma das duas culturas restantes foi adicionada alicina 0,79 mM (128 μg ml-1) e à outra diamida 1 mM. As culturas foram incubadas durante 15 min. Foram recolhidos 5 ml de cada cultura por centrifugação (8 525 × g, 4°C, 10 min). As células foram lavadas duas vezes com 1 ml de PBS (137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na2HPO4, 2 mM de KH2PO4, pH 7,4, armazenado em condições anaeróbias antes da utilização) e centrifugadas (13 000 × g, 4°C, 10 min). As células foram ressuspensas em tampão de lise (PBS com 6 mM de HCl de guanidínio, pH 7,4) antes da rutura a 4°C por sonicação (sonicador VialTweeter , Hielscher GmbH, Alemanha) (3 × 1 min). Os detritos celulares foram sedimentados por centrifugação (13 000 × g, 4 °C, 15 min). O sobrenadante foi transferido para uma cuvete QS-macro de 3,5 ml (10 mm) com uma barra de agitação magnética e misturado com 1 ml de tampão de lise. A absorvância das amostras foi monitorizada a 412 nm com um espectrofotómetro Jasco V-650 equipado com o suporte de cuvetes PSC-718 com controlo de temperatura, à temperatura ambiente. Foram adicionados 100μl de uma solução de ácido ditiobis(2-nitrobenzoico) 3 mM. A absorvância foi monitorizada até atingir a saturação. O cálculo da concentração de tióis foi realizado utilizando o coeficiente de extinção ϵ₄₁₂ = 13 700 M^-1 cm^-1 para o ácido tio-2-nitrobenzoico (TNB). As concentrações celulares de tióis foram calculadas com base num volume das células de E. coli de 6,7 × 10^-15 litro e numa densidade celular de A600 = 0,5 (equivalente a 1 × 10⁸ células ml^-1 de cultura). (Müller et al. 2016)

Determinação de glutationa in vivo utilizando um dispositivo de rutura celular ultrassónica

E.coli MG1655 foi cultivada em meio mínimo MOPS num volume total de 200ml até atingir uma A600 de 0,5. A cultura foi dividida em culturas de 50 ml para tratamento de stress. Após 15 min de incubação com alicina 0,79 mM, diamida 1 mM ou dimetilsulfóxido (controlo), as células foram recolhidas a 4 000g a 4°C durante 10 min. As células foram lavadas duas vezes com tampão KPE antes da ressuspensão dos sedimentos em 700µl de tampão KPE. Para a desproteinização, foram adicionados 300l de ácido sulfossalicílico a 10% (w/v) antes da rutura das células por sonicação (3 x 1 min; sonicador VialTweeter ). Os sobrenadantes foram recolhidos após centrifugação (30 min, 13 000g, 4°C). As concentrações de ácido sulfossalicílico foram reduzidas para 1% pela adição de 3 volumes de tampão KPE. As medições de glutationa total e GSSG foram realizadas como descrito acima. As concentrações celulares de glutationa foram calculadas com base num volume das células de E. coli de 6,7×10^-15 litro e numa densidade celular de A600 0,5 (equivalente a 1×10⁸ células ml^-1 de cultura). As concentrações de GSH foram calculadas subtraindo 2[GSSG] da glutationa total. (Müller et al. 2016)

Expressão de mAspAT humana em E. coli utilizando um homogeneizador ultrassónico

Uma única colónia de E. coli BL21 (DE3) portadora do vetor de expressão foi colocada em 30 mL de meio Luria-Bertani (LB) contendo 100μg/mL de ampicilina e depois cultivada a 37ºC até a densidade ótica (OD₆₀₀) atingir 0,6. As células foram recolhidas por centrifugação a 4 000 × g durante 10 min e ressuspensas em 3L de meio LB fresco contendo 100μg/mL de ampicilina.
Posteriormente, a expressão da proteína foi induzida com 1 mM de isopropil β-ᴅ-1-tiogalactopiranósido (IPTG) durante 20 h a 16ºC. As células foram recolhidas por centrifugação a 8 000 × g durante 15 min e lavadas com tampão A (20 mM de NaH2PO4, 0,5 M de NaCl, pH 7,4). Foram obtidos aproximadamente 45g (peso húmido) de células a partir de 3 L de cultura. Após centrifugação, os sedimentos celulares foram ressuspensos em 40 mL (para 1 L de cultura) de tampão de extração A arrefecido à temperatura do gelo e lisados por sonicação à temperatura do gelo utilizando o dispositivo de rutura celular ultrassónica Hielscher UP400St. O lisado celular foi centrifugado a 12 000 rpm durante 15 min para separar as frações solúvel (sobrenadante) e precipitada (sedimento). (Jiang et al. 2015)

Temas relacionados

Informações úteis

E.coli

Escherichia coli (E. coli) é uma bactéria coliforme gram-negativa, anaeróbia facultativa, em forma de bastonete, do género Escherichia, que se encontra habitualmente na parte inferior do intestino de organismos de sangue quente (endotérmicos). Existe um grande número de estirpes (ou subtipos) de E. coli com características diversas. A maioria das estirpes de E. coli é inofensiva para os seres humanos, p. ex., as estirpes B e K-12, que são habitualmente utilizadas em aplicações de investigação em laboratórios. No entanto, algumas estirpes são nocivas e podem causar doenças graves.
E. coli desempenha um papel importante na engenharia biológica moderna e na microbiologia industrial, uma vez que a bactéria é fácil de manipular. As aplicações laboratoriais comuns que envolvem frequentemente a utilização de E. coli incluem, p. ex., a criação de ácido desoxirribonucleico (DNA) recombinante ou a sua utilização como organismo modelo.
E. coli é um hospedeiro muito versátil para a produção de proteínas heterólogas, e estão disponíveis diversos sistemas de expressão de proteínas para produzir proteínas recombinantes em E. coli. Utilizando plasmídeos que permitem níveis elevados de expressão de proteínas, podem introduzir-se genes nas bactérias, o que permite produzir essas proteínas em grandes quantidades em processos de fermentação industrial.
E.coli são utilizadas como fábricas celulares para produzir insulina. Outras aplicações incluem a utilização de células de E. coli modificadas para desenvolver e produzir vacinas e enzimas imobilizadas, para produzir biocombustíveis, bem como para biorremediação.
A estirpe K-12 é uma forma mutante de E. coli que sobre-expressa a enzima fosfatase alcalina (ALP). Esta mutação ocorre devido a um defeito no gene que codifica constantemente a enzima. Se um gene produz um produto sem qualquer inibição, isto é conhecido como atividade constitutiva. Esta forma mutante específica é utilizada para o isolamento e a purificação da enzima ALP.
As bactérias E. coli são também amplamente utilizadas como fábricas celulares. Os microrganismos modificados por engenharia genética (p. ex., bactérias) e as células vegetais podem ser utilizados como as chamadas fábricas celulares. Estas células geneticamente modificadas produzem moléculas, produtos químicos, polímeros, proteínas e outras substâncias, que são utilizadas, por exemplo, nas indústrias farmacêutica, alimentar e química. Para libertar as moléculas produzidas no interior destas células modificadas por bioengenharia, a lise ultrassónica é um método comum para romper as paredes celulares e transferir as substâncias alvo para o líquido circundante. Leia mais sobre a lise de células modificadas por bioengenharia!

Cisalhamento ultrassónico de DNA

As forças de cisalhamento ultrassónico são um método comum para libertar moléculas, organelos e proteínas do interior das células, bem como para fragmentar as cadeias de DNA. A cavitação acústica rompe as paredes e membranas celulares para extrair DNA das células e gerar fragmentos com cerca de 600 – 800 bp de comprimento, o que é ideal para análise.
Clique aqui para saber mais sobre os homogeneizadores ultrassónicos para a fragmentação de DNA!

Bibliografia / Referências

Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.

Ultrassons de elevado desempenho! A gama de produtos Hielscher abrange todo o espectro, desde o sonicador compacto de laboratório, passando por unidades de bancada, até sistemas ultrassónicos totalmente industriais.

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