Lise ultra-sónica de células de bioengenharia na produção industrial

As espécies de bactérias de bioengenharia, como a E. coli, bem como os tipos de células geneticamente modificadas de mamíferos e plantas, são amplamente utilizadas na biotecnologia para exprimir moléculas. A fim de liberar essas biomoléculas sintetizadas, é necessária uma técnica de rutura celular confiável. A ultrassonografia de alto desempenho é um método comprovado para a lise celular eficiente e confiável – facilmente escalável para grandes produções. Hielscher Ultrasonics oferece-lhe equipamento de ultra-sons de alto desempenho para lise celular eficaz, a fim de produzir grandes volumes de biomoléculas de alta qualidade.

Extração de moléculas de fábricas de células

Para a produção de uma vasta gama de biomoléculas, podem ser utilizados vários micróbios e células vegetais modificados como fábricas de células microbianas, incluindo Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana e algas, entre muitos outros. Estas fábricas de células podem produzir proteínas, lípidos, bioquímicos, polímeros, biocombustíveis e oleoquímicos, que são utilizados como alimentos ou matérias-primas para aplicações industriais. As células utilizadas como fábricas de células são cultivadas em bioreactores fechados, onde podem atingir uma elevada eficiência, especificidade e baixos requisitos energéticos.
Para isolar as moléculas-alvo das culturas de células obtidas por bioengenharia, as células devem ser desintegradas para que o material intracelular seja libertado. Os disruptores ultra-sónicos de células estão bem estabelecidos como uma técnica altamente fiável e eficiente para a desintegração das células e a libertação de compostos.

As fábricas de células microbianas são células metabolicamente projectadas utilizadas para a síntese de vários compostos valiosos. A rutura ultra-sónica de células é um método eficiente e fiável para libertar os compostos valiosos do interior da célula.
estudo e gráfico: ©Villaverde, 2010.

Vantagens dos disruptores celulares ultra-sónicos

Sendo uma tecnologia não térmica, suave, mas altamente eficiente, os disruptores ultra-sónicos são utilizados em laboratório e na indústria para lisar células e produzir extractos de alta qualidade, por exemplo, utilizados para o isolamento de moléculas de fábricas de células.

Ultra-sons de potência para uma interrupção eficaz das fábricas de células microbianas

Mecanismo e efeitos dos desreguladores celulares ultra-sónicos:
A rutura ultra-sónica de células utiliza o poder das ondas de ultra-sons. O homogeneizador ultrassónico / disruptor de células está equipado com uma sonda (também conhecida como sonotrodo) feita de liga de titânio que oscila a uma frequência elevada de aproximadamente 20 kHz. Isto significa que a sonda ultra-sónica acopla 20.000 vibrações por segundo no líquido sonicado. As ondas de ultra-sons acopladas ao líquido são caracterizadas por ciclos alternados de alta pressão / baixa pressão. Durante um ciclo de baixa pressão, o líquido expande-se e surgem minúsculas bolhas de vácuo. Estas bolhas muito pequenas crescem ao longo de vários ciclos de pressão alternados até não conseguirem absorver mais energia. Nesta altura, as bolhas de cavitação implodem violentamente e criam localmente um ambiente de extraordinária densidade energética. Este fenómeno é conhecido como cavitação acústica e caracteriza-se por temperaturas muito elevadas, pressões muito elevadas e forças de cisalhamento. Estas forças de cisalhamento quebram eficazmente as paredes celulares e aumentam a transferência de massa entre o interior da célula e o solvente circundante. Como técnica puramente mecânica, as forças de cisalhamento geradas por ultra-sons são amplamente utilizadas e o procedimento recomendado para a rutura de células bacterianas, bem como para o isolamento de proteínas. Como método simples e rápido de rompimento de células, a sonicação é ideal para o isolamento de volumes pequenos, médios e grandes. Os ultrasonicadores digitais da Hielscher estão equipados com um menu claro de definições para um controlo preciso da sonicação. Todos os dados de sonicação são automaticamente armazenados num cartão SD incorporado e são simplesmente acessíveis. Opções sofisticadas de dissipação de calor, tais como arrefecimento externo, sonicação em modo pulsado, etc., durante o processo de desintegração ultra-sónica garantem a manutenção da temperatura ideal do processo e, assim, a integridade dos compostos sensíveis ao calor extraídos.

A investigação sublinha os pontos fortes da rutura e extração de células por ultra-sons

Chemat et al. (2017) resume no seu estudo que "a extração assistida por ultra-sons é uma alternativa ecológica e economicamente viável às técnicas convencionais para alimentos e produtos naturais. Os principais benefícios são a diminuição do tempo de extração e processamento, a quantidade de energia e solventes utilizados, operações unitárias, e CO₂ emissões".
Gabig-Ciminska et al. (2014) utilizaram um homogeneizador de alta pressão e um dsintegrador de células ultra-sónicas no seu estudo para a lise de esporos, a fim de libertar ADN. Comparando ambos os métodos de rutura celular, a equipa de investigação conclui que, no que diz respeito à lise celular para o ADN de esporos, "a análise foi feita empregando lisados de células a partir da homogeneização de alta pressão. Posteriormente, apercebemo-nos de que uma rutura de células por ultra-sons tem vantagens notáveis para este fim. É bastante rápido e pode ser processado para pequenos volumes de amostra." (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Biomoléculas de fábricas de células para a produção de alimentos

As fábricas de células microbianas são uma metodologia de produção viável e eficiente que utiliza organismos microbianos para produzir elevados rendimentos de metabolitos nativos e não nativos através da bioengenharia metabólica de microrganismos microbianos, tais como bactérias, leveduras, fungos, etc. As enzimas a granel são, por exemplo, produzidas utilizando microrganismos como o Aspergillus oryzae, fungos e bactérias. Estas enzimas a granel são utilizadas na produção de alimentos e bebidas, bem como na agricultura, bioenergia e cuidados domésticos.
Certas bactérias, como a Acetobacter xylinum e a Gluconacetobacter xylinus, produzem celulose durante o processo de fermentação, onde as nanofibras são sintetizadas num processo de baixo para cima. A celulose bacteriana (também conhecida como celulose microbiana) é quimicamente equivalente à celulose vegetal, mas tem um elevado grau de cristalinidade e elevada pureza (isenta de lenhina, hemicelulose, pectina e outros componentes biogénicos), bem como uma estrutura única de rede reticulada tridimensional (3D) de nanofibras de celulose. (cf. Zhong, 2020) Em comparação com a celulose derivada de plantas, a celulose bacteriana é mais sustentável e a celulose produzida é pura, não exigindo etapas complexas de purificação. Ultrasonication e extração por solvente utilizando NaOH ou SDS (sulfato de dodecilo de sódio) são muito eficazes para o isolamento de celulose bacteriana a partir das células bacterianas.

Biomoléculas de fábricas de células para a produção de produtos farmacêuticos e vacinas

Um dos produtos farmacêuticos mais proeminentes derivados de fábricas de células é a insulina humana. Para a produção de insulina por bioengenharia, são utilizadas predominantemente E. coli e Saccharomyces cerevisiae. Uma vez que as moléculas nanométricas bio-sintetizadas oferecem uma elevada biocompatibilidade, as nanopartículas biológicas, como a ferritina, são vantajosas para numerosas aplicações de fabrico biológico. Além disso, a produção em micróbios metabolicamente modificados é muitas vezes significativamente mais eficaz nos rendimentos obtidos. Por exemplo, a produção de ácido artemisínico, resveratrol e licopeno aumentou dez vezes para várias centenas de vezes e já está estabelecida ou está a ser desenvolvida para produção à escala industrial. (cf. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
Por exemplo, as biomoléculas nanométricas à base de proteínas com propriedades de auto-montagem, como a ferritina e as partículas semelhantes a vírus, são especialmente interessantes para o desenvolvimento de vacinas, uma vez que imitam tanto a dimensão como a estrutura dos agentes patogénicos e são passíveis de conjugação de antigénios à superfície para promover a interação com as células imunitárias. Essas moléculas são expressas nas chamadas fábricas de células (por exemplo, estirpes de E. coli modificadas), que produzem uma determinada molécula alvo.

Protocolo de lise ultra-sónica e de E. coli BL21 para libertação de ferritina

A ferritina é uma proteína cuja função principal é o armazenamento de ferro. A ferritina mostra capacidades promissoras como nanopartículas de auto-montagem em vacinas, onde é utilizada como veículo de entrega de vacinas (por exemplo, proteínas spike SARS-Cov-2). A investigação científica de Sun et. al. (2016) mostra que a ferritina recombinante pode ser libertada como uma forma solúvel da Escherichia coli a baixas concentrações de NaCl (≤50 mmol/L). Para expressar a ferritina em E. coli BL21 e libertar a ferritina, foi aplicado com êxito o seguinte protocolo. O plasmídeo recombinante pET-28a/ferritina foi transformado na estirpe E coli BL21 (DE3). As células de ferritina E coli BL21 (DE3) foram cultivadas em meio de cultura LB com 0,5% de canamicina a 37°C e induzidas a uma OD600 de 0,6 com 0,4% de isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo durante 3 horas a 37°C. A cultura final foi então colhida por centrifugação a 8000g durante 10 minutos a 4°C, e o sedimento foi recolhido. Em seguida, o pellet foi ressuspendido em meio LB (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% extrato de levedura)/tampão de lise (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) e diferentes concentrações de solução de NaCl (0, 50, 100, 170 e 300 mmol/L), respetivamente. Para a lise das células bacterianas, a sonicação foi aplicada em modo pulsado: por exemplo, utilizando o botão ultrassom UP400St a 100% de amplitude com um ciclo de trabalho de 5 segundos ON, 10 segundos OFF, durante 40 ciclos) e depois centrifugado a 10 000g durante 15 minutos a 4°C. O sobrenadante e o precipitado foram analisados por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). Todos os géis corados com dodecil sulfato de sódio foram digitalizados com um scanner de alta resolução. As imagens do gel foram analisadas com o software Magic Chemi 1D. Para uma clareza óptima, as bandas de proteínas foram detectadas através do ajuste dos parâmetros. Os dados relativos às bandas foram gerados a partir de triplicados técnicos. (cf. Sun et al., 2016)

Disruptores celulares ultra-sónicos para lise industrial de fábricas de células

A lise e extração por ultra-sons é um método fiável e confortável para libertar metabolitos das fábricas de células, contribuindo assim para uma produção eficaz de moléculas-alvo. Os disruptores de células ultra-sónicos estão disponíveis desde o laboratório até ao tamanho industrial e os processos podem ser escalados de forma completamente linear.
A Hielscher Ultrasonics é o seu parceiro competente para disruptores ultra-sónicos de alto desempenho e tem uma longa experiência no campo da implantação de sistemas ultra-sónicos em ambientes industriais e de bancada.
Quando se trata de hardware e software sofisticados, os sistemas de rompimento de células da Hielscher Ultrasonics cumprem todos os requisitos para um ótimo controlo do processo, fácil operação e facilidade de utilização. Os clientes e utilizadores dos ultrassons da Hielscher valorizam a vantagem de os disruptores e extractores de células ultrassónicos da Hielscher permitirem a monitorização e o controlo precisos do processo – através do ecrã tátil digital e do controlo remoto do navegador. Todos os dados de sonicação importantes (por exemplo, energia líquida, energia total, amplitude, duração, temperatura, pressão) são automaticamente armazenados como ficheiro CSV num cartão SD integrado. Isto ajuda a obter resultados reprodutíveis e repetíveis e facilita a padronização do processo, bem como o cumprimento das Boas Práticas de Fabrico (cGMP).
Naturalmente, os processadores ultra-sónicos da Hielscher são construídos para funcionar 24 horas por dia, 7 dias por semana, em plena carga e podem, portanto, ser utilizados de forma fiável em ambientes de produção industrial. Devido à elevada robustez e à baixa manutenção, o tempo de inatividade do equipamento ultrassónico é realmente baixo. As caraterísticas CIP (clean-in-place) e SIP (sterilize-in-place) minimizam a limpeza laboriosa, especialmente porque todas as partes húmidas são superfícies metálicas lisas (sem orifícios ou bicos escondidos).

O quadro seguinte dá-lhe uma indicação da capacidade de processamento aproximada dos nossos ultra-sons: