Espécies de bactérias bioengenharias como E. coli, bem como tipos de mamíferos geneticamente modificados e células vegetais são amplamente utilizadas em biotecnologia para expressar moléculas. Para liberar essas bio moléculas sintetizadas, é necessária uma técnica confiável de disrupção celular. A ultrassonização de alto desempenho é um método comprovado para a lise celular eficiente e confiável – facilmente escalável para grandes rendimentos. A Hielscher Ultrasonics oferece equipamentos ultrassônicos de alto desempenho para lise celular eficaz, a fim de produzir grandes volumes de biomotelocerias de alta qualidade.

Extração de moléculas de fábricas celulares

Para a produção de uma ampla gama de biomoléculas, vários micróbios projetados e células vegetais podem ser usados como fábricas de células microbianas, incluindo Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana e algas, entre muitos outros. Essas fábricas de células podem produzir proteínas, lipídios, bioquímicos, polímeros, biocombustíveis e oleoquímicos, que são usados como alimentos ou matéria-prima para aplicações industriais. As células utilizadas como fábricas de células são cultivadas em bioreatores fechados, onde podem alcançar altas eficiências, especificidades e baixos requisitos energéticos.
Para isolar as moléculas-alvo das culturas celulares bioengenharia, as células devem ser interrompidas para que o material intracelular seja liberado. Os disruptores de células ultrassônicas são bem estabelecidos como uma técnica altamente confiável e eficiente para desintegração celular e liberação de compostos.

As fábricas de células microbianas são células metabolicamente projetadas usadas para a síntese de vários compostos valiosos. A interrupção das células ultrassônicas é um método eficiente e confiável para liberar os compostos valiosos do interior da célula.
estudo e gráfico: ©Villaverde, 2010.

Vantagens dos Disruptores celulares ultrassônicos

Como uma tecnologia não térmica, leve, mas altamente eficiente, os disruptores ultrassônicos são usados em laboratório e na indústria para lise de células e para produzir extratos de alta qualidade, por exemplo, usados para o isolamento de moléculas de fábricas de células.

Ultrassom de energia para interrupção eficiente de fábricas de células microbianas

Mecanismo e Efeitos dos Disruptores celulares ultrassônicos:
A interrupção das células ultrassônicas usou o poder das ondas de ultrassom. O homogeneizador/disruptor ultrassônico é equipado com uma sonda (também conhecida como sonotrode) feita de liga de titânio que oscila a uma alta frequência de aproximadamente 20 kHz. Isso significa que a sonda ultrassônica soma 20.000 vibrações por segundo no líquido sônico. As ondas de ultrassom acopladas ao líquido são caracterizadas por ciclos alternados de alta pressão / baixa pressão. Durante um ciclo de baixa pressão, o líquido se expande e surgem bolhas de vácuo minúsculas. Essas bolhas muito pequenas crescem ao longo de vários ciclos de pressão alternadas até que não possam absorver mais energia. Neste ponto, as bolhas de cavitação implodem violentamente e criam localmente um ambiente extraordinário denso energético. Este fenômeno é conhecido como cavitação acústica e é caracterizado por temperaturas localmente muito altas, pressões muito altas e forças de corte. Estes estresses de tesoura quebram eficientemente paredes celulares e aumentam a transferência de massa entre o interior da célula e o solvente circundante. Como técnica puramente mecânica, as forças de tesoura geradas ultrasonicamente são amplamente utilizadas e o procedimento recomendado para interrupção celular bacteriana, bem como para o isolamento de proteínas. Como um método simples e rápido de interrupção celular, a sônica é ideal para o isolamento de volumes pequenos, médios e grandes. Os ultrassonicadores digitais da Hielscher são equipados com um menu claro de configurações para controle preciso de sonicação. Todos os dados de sônica são armazenados automaticamente em um cartão SD embutido e são simplesmente acessíveis. Opções sofisticadas de dissipação de calor, como resfriamento externo, sônica no modo puls etc. durante o processo de desintegração ultrassônica garantem a manutenção da temperatura ideal do processo e, assim, a intactidade de compostos sensíveis ao calor extraídos.

Pesquisa destaca os pontos fortes da interrupção e extração celular ultrassônica

O Prof. Chemat et al. (2017) retoma em seu estudo que "a extração assistida por ultrassom é uma alternativa verde e economicamente viável às técnicas convencionais para alimentos e produtos naturais. Os principais benefícios são a diminuição do tempo de extração e processamento, a quantidade de energia e solventes utilizados, operações unitárias e CO₂ emissões.
Gabig-Ciminska et al. (2014) utilizaram um homogeneizador de alta pressão e um dsintegrator de células ultrassônicas em seu estudo para a lise dos esporos a fim de liberar o DNA. Comparando ambos os métodos de interrupção celular, a equipe de pesquisa conclui que em relação à lise celular para DNA esporo, "a análise tem sido feita utilizando lises celulares a partir da homogeneização de alta pressão. Depois, percebemos que uma ruptura celular ultrassônica tem excelentes vantagens para este fim. É bastante rápido e pode ser processado para pequenos volumes de amostra." (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Biomoléculas de Fábricas de Células para Produção de Alimentos

As fábricas de células microbianas são uma metodologia de produção viável e eficiente usando organismos microbianos para produzir altos rendimentos de metabólitos nativos e não nativos por bioengenharia metabólica de microrganismos microbianos como bactérias, leveduras, fungos etc. Enzimas a granel são, por exemplo, produzidas usando microrganismos como aspergillus oryzae, fungos e bactérias. Essas enzimas a granel são utilizadas para a produção de alimentos e bebidas, bem como para a agricultura, bioenergia e cuidados domésticos.
Certas bactérias como Acetobacter xylinum e Gluconacetobacter xylinus produzem celulose durante o processo de fermentação, onde nanofibras são sintetizadas em um processo de baixo para cima. A celulose bacteriana (também conhecida como celulose microbiana) é quimicamente equivalente à celulose vegetal, mas tem alto grau de cristalidade e alta pureza (livre de lignina, hemicellulose, pectina e outros componentes biogênicos), bem como uma estrutura única de rede tridimensional (3D) reticulada de nanofibra de celulose (3D). (cf. Zhong, 2020) Em comparação com a celulose derivada da planta, a celulose bacteriana é mais sustentável e a celulose produzida é pura não requer passos complexos de purificação. A ultrassônica e a extração de solventes usando NaOH ou SDS (sulfato de dodecim de sódio) são muito eficazes para o isolamento da celulose bacteriana das células bacterianas.

Biomoléculas de Fábricas de Células para Produção Farmacêutica e de Vacinas

Um dos produtos farmacêuticos mais proeminentes derivados de fábricas de células é a insulina humana. Para a produção de insulina bioengenharia, são utilizadas predominantemente E. coli e Saccharomyces cerevisiae. Uma vez que moléculas nano-dimensionadas bio-sintetizadas oferecem uma alta biocompatibilidade, nanopartículas biológicas como a ferritina são vantajosas para inúmeras aplicações biomanufadoras. Além disso, a produção em micróbios metabolicamente modificados é muitas vezes significativamente mais eficaz nos rendimentos obtidos. Por exemplo, a produção de ácido artemisinico, resveratrol e licopeno aumentou dez vezes para várias centenas, e já está estabelecida ou está em desenvolvimento para a produção em escala industrial. (cf. Liu et al.; Microb. Fato celular. 2017)
Por exemplo, biomoléculas nano-tamanhos à base de proteínas com propriedades auto-montadas, como ferritina e partículas semelhantes a vírus, são especialmente interessantes para o desenvolvimento de vacinas, pois imitam o tamanho e a estrutura dos patógenos e são receptivas à conjugação superficial de antígenos para promover a interação com células imunes. Tais moléculas são expressas nas chamadas fábricas de células (por exemplo, cepas de E. coli projetadas), que produzem uma determinada molécula-alvo.

Protocolo para Lise Ultrassônica e de E. coli BL21 para Lançamento de Ferritin

Ferritin é uma proteína, que a função primária é o armazenamento de ferro. A ferritina mostra capacidades promissoras como nanopartículas auto-montadas em vacinas, onde é usada como veículo de entrega de vacinas (por exemplo, proteínas de pico SARS-Cov-2). A pesquisa científica de Sun et. al. (2016) mostra que a ferritina recombinante pode ser liberada como uma forma solúvel de Escherichia coli em baixas concentrações de NaCl (≤50 mmol/L). A fim de expressar ferritina em E. coli BL21 e liberar a ferrtina, o seguinte protocolo foi aplicado com sucesso. O pET-28a/furitin plasmid recombinante foi transformado na cepa E coli BL21 (DE3). As células ferritina E coli BL21 (DE3) foram cultivadas na mídia de crescimento LB com kanamycina de 0,5% a 37°C e induzidas a um OD600 de 0,6 com isopropílico-β-D-thiogalactopyranoside por 3 horas a 37°C. A cultura final foi então colhida por centrifugação a 8000g por 10 minutos a 4°C, e a pelota foi coletada. Em seguida, a pelota foi resuspended em meio LB (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% extrato de levedura)/tampão de lise (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7.6) e diferentes concentrações de solução NaCl (0, 50, 100, 170 e 300 mmol/L), respectivamente. Para a lise celular bacteriana, a sônica foi aplicada no modo de pulso: por exemplo, usando o ultrassônico UP400St a 100% de amplitude com um ciclo de dever de 5 segundos ON, 10 segundos OFF, para 40 ciclos) e depois centrifued a 10 000g por 15 minutos a 4°C. O supernascer e o precipitado foram analisados pela eletroforese de gel de poliacrilamida de sulfato de sódio (SDS-PAGE). Todos os géis manchados de sulfato de sódio foram escaneados com scanner de alta resolução. As imagens em gel foram analisadas usando o software Magic Chemi 1D. Para maior clareza, as bandas proteicas foram detectadas ajustando parâmetros. Os dados das bandas foram gerados a partir de triplicados técnicos. (cf. Sun et al., 2016)

Disruptores de células ultrassônicas para lise industrial de fábricas de células

A lise ultrassônica e a extração é um método confiável e confortável para liberar metabólitos de fábricas celulares, auxiliando assim uma produção eficaz de moléculas-alvo. Os disruptores de células ultrassônicas estão disponíveis do laboratório ao tamanho industrial e os processos podem ser dimensionados completamente lineares.
A Hielscher Ultrasonics é sua parceira competente para disruptores ultrassônicos de alto desempenho e tem experiência de longa data no campo de implantação de sistemas ultrassônicos em configurações industriais e de bancada.
Quando se trata de hardware e software sofisticados, os sistemas de interrupção de células Hielscher Ultrasonics cumprem todos os requisitos para o controle de processos ideal, fácil operação e simpatia do usuário. Clientes e usuários de ultrassonicadores Hielscher valorizam o benefício que os disruptores e extratores de células ultrassônicas hielscher permitem o monitoramento e controle preciso do processo – via display de toque digital e controle remoto do navegador. Todos os dados importantes de sônicação (por exemplo, energia líquida, energia total, amplitude, duração, temperatura, pressão) são armazenados automaticamente como arquivo CSV em um cartão SD integrado. Isso ajuda a obter resultados reprodutíveis e repetitivos e facilita a padronização do processo, bem como o cumprimento de boas práticas de fabricação (cGMP).
É claro que os processadores ultrassônicos Hielscher são construídos para operação 24 horas por dia, 7 dias por semana, com carga total e, portanto, podem ser operados de forma confiável em ambientes de produção industrial. Devido à alta robustez e baixa manutenção, o tempo de inatividade dos equipamentos ultrassônicos é muito baixo. Características de CIP (clean-in-place) e SIP (esterilizador no local) minimizam a limpeza laboriosa, especialmente porque todas as peças molhadas são superfícies metálicas lisas (sem orifícios ou bocais ocultos).

A tabela abaixo dá-lhe uma indicação da capacidade de processamento aproximado de nossos ultrasonicators: