Lise ultrassónica de células modificadas por bioengenharia na produção industrial

Espécies bacterianas modificadas por bioengenharia, como E. coli, bem como tipos de células de mamíferos e de plantas geneticamente modificadas, são amplamente utilizadas em biotecnologia para expressar moléculas. Para libertar estas biomoléculas sintetizadas, é necessária uma técnica fiável de rutura celular. A ultrassonicação de alto desempenho é um método comprovado para uma lise celular eficiente e fiável – facilmente escalável para grandes capacidades de processamento. A Hielscher Ultrasonics oferece-lhe equipamento ultrassónico de alto desempenho para uma lise celular eficaz, de modo a produzir grandes volumes de biomoléculas de elevada qualidade.

Extração de moléculas de fábricas celulares

Para a produção de uma vasta gama de biomoléculas, podem utilizar-se vários microrganismos e células vegetais modificados como fábricas celulares microbianas, incluindo Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana e algas, entre muitos outros. Estas fábricas celulares podem produzir proteínas, lípidos, substâncias bioquímicas, polímeros, biocombustíveis e produtos oleoquímicos, que são utilizados como alimentos ou matérias-primas para aplicações industriais. As células utilizadas como fábricas celulares são cultivadas em biorreatores fechados, onde podem alcançar elevada eficiência, especificidade e baixas necessidades energéticas.
Para isolar as moléculas-alvo das culturas celulares modificadas por bioengenharia, é necessário romper as células para libertar o material intracelular. Os equipamentos ultrassónicos de rutura celular estão bem estabelecidos como uma técnica altamente fiável e eficiente para a desintegração celular e a libertação de compostos.

As fábricas celulares microbianas são células modificadas por engenharia metabólica utilizadas para a síntese de vários compostos valiosos. A rutura celular ultrassónica é um método eficiente e fiável para libertar os compostos valiosos do interior das células.
estudo e ilustração: ©Villaverde, 2010.

Vantagens dos equipamentos ultrassónicos de rutura celular

Por constituírem uma tecnologia não térmica, suave, mas altamente eficiente, os equipamentos ultrassónicos de rutura são utilizados no laboratório e na indústria para lisar células e produzir extratos de elevada qualidade, utilizados, por exemplo, para isolar moléculas de fábricas celulares.

Ultrassons de potência para a rutura eficiente de fábricas celulares microbianas

Mecanismo e efeitos dos equipamentos ultrassónicos de rutura celular:
A rutura celular ultrassónica utiliza a potência das ondas ultrassónicas. O homogeneizador ultrassónico / equipamento de rutura celular está equipado com uma sonda (também designada sonotrodo) feita de uma liga de titânio que oscila a uma frequência elevada de aprox. 20 kHz. Isto significa que a sonda ultrassónica acopla 20 000 vibrações por segundo ao líquido submetido a sonicação. As ondas ultrassónicas acopladas ao líquido caracterizam-se por ciclos alternados de alta pressão / baixa pressão. Durante um ciclo de baixa pressão, o líquido expande-se e surgem minúsculas bolhas de vácuo. Estas bolhas muito pequenas crescem ao longo de vários ciclos de pressão alternada até deixarem de conseguir absorver mais energia. Nesse momento, as bolhas de cavitação implodem violentamente e criam localmente um ambiente com uma densidade de energia extraordinária. Este fenómeno é conhecido como cavitação acústica e caracteriza-se por temperaturas localmente muito elevadas, pressões muito elevadas e forças de cisalhamento. Estas tensões de cisalhamento rompem eficientemente as paredes celulares e aumentam a transferência de massa entre o interior da célula e o solvente circundante. Enquanto técnica puramente mecânica, as forças de cisalhamento geradas por ultrassons são amplamente utilizadas e constituem o procedimento recomendado para a rutura de células bacterianas, bem como para o isolamento de proteínas. Como método simples e rápido de rutura celular, a sonicação é ideal para o isolamento em volumes pequenos, médios e grandes. Os sonicadores digitais da Hielscher estão equipados com um menu claro de definições para um controlo preciso da sonicação. Todos os dados de sonicação são automaticamente armazenados num cartão SD incorporado e são facilmente acessíveis. Opções sofisticadas de dissipação de calor, como o arrefecimento externo, a sonicação em modo pulsado, etc., durante o processo de desintegração ultrassónica asseguram a manutenção da temperatura ideal do processo e, assim, a integridade dos compostos extraídos sensíveis ao calor.

A investigação destaca os pontos fortes da rutura celular e da extração ultrassónicas

O Prof. Chemat et al. (2017) resumem no seu estudo que “a extração assistida por ultrassons é uma alternativa ecológica e economicamente viável às técnicas convencionais para alimentos e produtos naturais. Os principais benefícios são a redução do tempo de extração e de processamento, da quantidade de energia e de solventes utilizados, das operações unitárias e das emissões de CO₂ .”
Gabig-Ciminska et al. (2014) utilizaram um homogeneizador de alta pressão e um desintegrador celular ultrassónico no seu estudo para a lise de esporos, de modo a libertar ADN. Ao comparar ambos os métodos de rutura celular, a equipa de investigação conclui que, relativamente à lise celular para obter ADN de esporos, “a análise foi realizada utilizando lisados celulares provenientes da homogeneização a alta pressão. Posteriormente, apercebemo-nos de que a rutura celular ultrassónica apresenta vantagens excecionais para este fim. É bastante rápida e pode ser realizada com pequenos volumes de amostra.” (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Biomoléculas de fábricas celulares para a produção alimentar

As fábricas celulares microbianas constituem uma metodologia de produção viável e eficiente que utiliza organismos microbianos para produzir elevados rendimentos de metabolitos nativos e não nativos através da bioengenharia metabólica de microrganismos, como bactérias, leveduras, fungos, etc. As enzimas produzidas em grandes quantidades são, por exemplo, obtidas utilizando microrganismos como Aspergillus oryzae, fungos e bactérias. Estas enzimas são utilizadas na produção de alimentos e bebidas, bem como na agricultura, na bioenergia e nos cuidados domésticos.
Certas bactérias, como Acetobacter xylinum e Gluconacetobacter xylinus, produzem celulose durante o processo de fermentação, no qual são sintetizadas nanofibras através de um processo de construção de baixo para cima. A celulose bacteriana (também conhecida como celulose microbiana) é quimicamente equivalente à celulose vegetal, mas apresenta um elevado grau de cristalinidade e elevada pureza (sem lignina, hemicelulose, pectina e outros componentes biogénicos), bem como uma estrutura única de rede reticulada tridimensional (3D) tecida por nanofibras de celulose. (cf. Zhong, 2020) Em comparação com a celulose de origem vegetal, a celulose bacteriana é mais sustentável e a celulose produzida é pura, não exigindo etapas de purificação complexas. A ultrassonicação e a extração com solventes utilizando NaOH ou SDS (dodecilsulfato de sódio) são muito eficazes para o isolamento de celulose bacteriana a partir das células bacterianas.

Biomoléculas de fábricas celulares para a produção de produtos farmacêuticos e vacinas

Um dos produtos farmacêuticos mais proeminentes derivados de fábricas celulares é a insulina humana. Para a produção de insulina por bioengenharia, utilizam-se predominantemente E. coli e Saccharomyces cerevisiae. Uma vez que as moléculas de dimensão nanométrica biossintetizadas oferecem elevada biocompatibilidade, as nanopartículas biológicas, como a ferritina, são vantajosas para numerosas aplicações de biofabricação. Além disso, a produção em microrganismos modificados por engenharia metabólica é frequentemente significativamente mais eficaz em termos dos rendimentos obtidos. Por exemplo, a produção de ácido artemisínico, resveratrol e licopeno aumentou entre dez vezes e várias centenas de vezes e já está estabelecida ou em desenvolvimento para a produção à escala industrial. (cf. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
Por exemplo, as biomoléculas de dimensão nanométrica à base de proteínas com propriedades de auto-organização, como a ferritina e as partículas semelhantes a vírus, são especialmente interessantes para o desenvolvimento de vacinas, uma vez que mimetizam tanto o tamanho como a estrutura dos agentes patogénicos e permitem a conjugação de antigénios à sua superfície para promover a interação com células imunitárias. Estas moléculas são expressas nas chamadas fábricas celulares (por exemplo, estirpes modificadas de E. coli), que produzem uma determinada molécula-alvo.

Protocolo de lise ultrassónica de E. coli BL21 para a libertação de ferritina

A ferritina é uma proteína cuja função principal é o armazenamento de ferro. A ferritina apresenta potencial promissor como nanopartículas com capacidade de auto-organização em vacinas, nas quais é utilizada como veículo de administração de vacinas (por exemplo, proteínas da espícula do SARS-Cov-2). A investigação científica de Sun et. al. (2016) mostra que a ferritina recombinante pode ser libertada numa forma solúvel a partir de Escherichia coli em baixas concentrações de NaCl (≤50 mmol/L). Para expressar ferritina em E. coli BL21 e libertar a ferritina, foi aplicado com sucesso o seguinte protocolo. O plasmídeo recombinante pET-28a/ferritin foi introduzido por transformação na estirpe E coli BL21 (DE3). As células de E coli BL21 (DE3) produtoras de ferritina foram cultivadas em meios de crescimento LB com 0,5% de canamicina a 37°C e induzidas a uma OD600 de 0,6 com 0,4% de isopropil-β-D-tiogalactopiranósido durante 3 horas a 37°C. A cultura final foi então recolhida por centrifugação a 8000g durante 10 minutos a 4°C, e o sedimento foi recolhido. Em seguida, o sedimento foi ressuspenso em meio LB (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% extrato de levedura)/tampão de lise (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) e em diferentes concentrações de solução de NaCl (0, 50, 100, 170 e 300 mmol/L), respetivamente. Para a lise das células bacterianas, foi aplicada sonicação em modo pulsado: por exemplo, utilizando o sonicador UP400St a 100% de amplitude com um ciclo de funcionamento de 5 segundos LIGADO, 10 segundos DESLIGADO, durante 40 ciclos) e, em seguida, efetuou-se uma centrifugação a 10 000g durante 15 minutos a 4°C. O sobrenadante e o precipitado foram analisados por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE). Todos os géis corados com dodecilsulfato de sódio foram digitalizados com um digitalizador de alta resolução. As imagens dos géis foram analisadas utilizando o software Magic Chemi 1D. Para uma clareza ideal, as bandas de proteínas foram detetadas através do ajuste de parâmetros. Os dados das bandas foram gerados a partir de triplicados técnicos. (cf. Sun et al., 2016)

Equipamentos ultrassónicos de rutura celular para a lise industrial de fábricas celulares

A lise e a extração ultrassónicas constituem um método fiável e cómodo para libertar metabolitos de fábricas celulares, contribuindo assim para uma produção eficaz de moléculas-alvo. Os equipamentos ultrassónicos de rutura celular estão disponíveis em dimensões laboratoriais a industriais e os processos podem ser escalados de forma completamente linear.
A Hielscher Ultrasonics é o seu parceiro competente para equipamentos ultrassónicos de rutura de alto desempenho e possui uma longa experiência na implementação de sistemas ultrassónicos em instalações de bancada e industriais.
No que diz respeito a hardware e software sofisticados, os sistemas de rutura celular da Hielscher Ultrasonics satisfazem todos os requisitos de controlo ideal do processo, facilidade de operação e facilidade de utilização. Os clientes e utilizadores dos sonicadores Hielscher valorizam a vantagem de os equipamentos ultrassónicos de rutura celular e de extração da Hielscher permitirem uma monitorização e um controlo precisos do processo – através de um ecrã tátil digital e de controlo remoto pelo navegador. Todos os dados importantes de sonicação (por exemplo, energia líquida, energia total, amplitude, duração, temperatura, pressão) são automaticamente armazenados como ficheiro CSV num cartão SD integrado. Isto ajuda a obter resultados reprodutíveis e repetíveis e facilita a normalização do processo, bem como o cumprimento das Boas Práticas de Fabrico (cGMP).
Naturalmente, os processadores ultrassónicos Hielscher são construídos para funcionar 24/7 em plena carga e podem, por isso, ser operados de forma fiável em instalações de produção industrial. Graças à elevada robustez e às reduzidas necessidades de manutenção, o tempo de inatividade do equipamento ultrassónico é realmente baixo. As funcionalidades CIP (limpeza no local) e SIP (esterilização no local) minimizam a limpeza trabalhosa, sobretudo porque todas as peças em contacto com o líquido são superfícies metálicas lisas (sem orifícios ou bocais ocultos).

A tabela abaixo dá-lhe uma indicação da capacidade aproximada de processamento dos nossos sonicadores: