Lise ultrassônica de células de bioengenharia na produção industrial

Espécies de bactérias de bioengenharia, como E. coli, bem como tipos de células de mamíferos e plantas geneticamente modificadas, são amplamente utilizadas em biotecnologia para expressar moléculas. Para liberar essas biomoléculas sintetizadas, é necessária uma técnica confiável de ruptura celular. A ultrassonografia de alto desempenho é um método comprovado para lise celular eficiente e confiável – facilmente escalável para grandes rendimentos. A Hielscher Ultrasonics oferece equipamentos ultrassônicos de alto desempenho para lise celular eficaz, a fim de produzir grandes volumes de biomoléculas de alta qualidade.

Extração de moléculas de fábricas de células

Para a produção de uma ampla gama de biomoléculas, vários micróbios e células vegetais modificados podem ser usados como fábricas de células microbianas, incluindo Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana e algas, entre muitos outros. Essas fábricas de células podem produzir proteínas, lipídios, bioquímicos, polímeros, biocombustíveis e oleoquímicos, que são usados como alimento ou matéria-prima para aplicações industriais. As células usadas como fábricas de células são cultivadas em biorreatores fechados, onde podem atingir alta eficiência, especificidade e baixos requisitos de energia.
Para isolar as moléculas-alvo das culturas de células de bioengenharia, as células devem ser interrompidas para que o material intracelular seja liberado. Os disruptores celulares ultrassônicos estão bem estabelecidos como uma técnica altamente confiável e eficiente para desintegração celular e liberação de compostos.

As fábricas de células microbianas são células metabolicamente modificadas usadas para a síntese de vários compostos valiosos. A ruptura celular ultrassônica é um método eficiente e confiável para liberar os compostos valiosos do interior da célula.
estudo e gráfico: ©Villaverde, 2010.

Vantagens dos disruptores celulares ultrassônicos

Como uma tecnologia não térmica, suave, mas altamente eficiente, os disruptores ultrassônicos são usados em laboratório e na indústria para lisar células e produzir extratos de alta qualidade, por exemplo, usados para o isolamento de moléculas de fábricas de células.

Ultrassom de potência para interrupção eficiente de fábricas de células microbianas

Mecanismo e efeitos dos disruptores celulares ultrassônicos:
A interrupção celular ultrassônica usou o poder das ondas de ultrassom. O homogeneizador ultrassônico / disruptor de células é equipado com uma sonda (também conhecida como sonotrodo) feita de liga de titânio que oscila a uma alta frequência de aprox. 20 kHz. Isso significa que a sonda ultrassônica acopla 20.000 vibrações por segundo no líquido sonicado. As ondas de ultrassom acopladas ao líquido são caracterizadas por ciclos alternados de alta / baixa pressão. Durante um ciclo de baixa pressão, o líquido se expande e surgem pequenas bolhas de vácuo. Essas bolhas muito pequenas crescem ao longo de vários ciclos de pressão alternados até que não possam absorver mais energia. Nesse ponto, as bolhas de cavitação implodem violentamente e criam localmente um ambiente extraordinário de densidade energética. Este fenômeno é conhecido como cavitação acústica e é caracterizado por temperaturas localmente muito altas, pressões muito altas e forças de cisalhamento. Essas tensões de cisalhamento quebram eficientemente as paredes celulares e aumentam a transferência de massa entre o interior da célula e o solvente circundante. Como uma técnica puramente mecânica, as forças de cisalhamento geradas por ultrassom são amplamente utilizadas e o procedimento recomendado para a ruptura de células bacterianas, bem como para o isolamento de proteínas. Como um método simples e rápido de ruptura celular, a sonicação é ideal para o isolamento de volumes pequenos, médios e grandes. Os ultrassônicos digitais da Hielscher são equipados com um menu claro de configurações para controle preciso da sonicação. Todos os dados de sonicação são armazenados automaticamente em um cartão SD integrado e são simplesmente acessíveis. Opções sofisticadas de dissipação de calor, como resfriamento externo, sonicação em modo de pulso, etc., durante o processo de desintegração ultrassônica, garantem a manutenção da temperatura ideal do processo e, portanto, a integridade dos compostos sensíveis ao calor extraídos.

Pesquisa destaca os pontos fortes da ruptura e extração de células ultrassônicas

O Prof. Chemat et al. (2017) resume em seu estudo que "a extração assistida por ultrassom é uma alternativa verde e economicamente viável às técnicas convencionais de alimentos e produtos naturais. Os principais benefícios são a diminuição do tempo de extração e processamento, a quantidade de energia e solventes utilizados, as operações unitárias e o CO₂ emissões."
Gabig-Ciminska et al. (2014) usaram um homogeneizador de alta pressão e um desintegrador de células ultrassônico em seu estudo para a lise de esporos para liberar DNA. Comparando os dois métodos de ruptura celular, a equipe de pesquisa conclui que, em relação à lise celular para DNA de esporos, "a análise foi feita empregando lisados celulares da homogeneização de alta pressão. Posteriormente, percebemos que uma ruptura celular ultrassônica tem vantagens notáveis para esse fim. É bastante rápido e pode ser processado para pequenos volumes de amostra." (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Biomoléculas de fábricas de células para produção de alimentos

As fábricas de células microbianas são uma metodologia de produção viável e eficiente que utiliza organismos microbianos para produzir altos rendimentos de metabólitos nativos e não nativos por bioengenharia metabólica de microrganismos microbianos, como bactérias, leveduras, fungos, etc. As enzimas a granel são, por exemplo, produzidas usando microrganismos como Aspergillus oryzae, fungos e bactérias. Essas enzimas a granel são usadas para a produção de alimentos e bebidas, bem como na agricultura, bioenergia e cuidados domésticos.
Certas bactérias, como Acetobacter xylinum e Gluconacetobacter xylinus, produzem celulose durante o processo de fermentação, onde as nanofibras são sintetizadas em um processo de baixo para cima. A celulose bacteriana (também conhecida como celulose microbiana) é quimicamente equivalente à celulose vegetal, mas possui alto grau de cristalinidade e alta pureza (livre de lignina, hemicelulose, pectina e outros componentes biogênicos), bem como uma estrutura única de rede reticulada tridimensional (3D) tecida por nanofibra de celulose. (cf. Zhong, 2020) Em comparação com a celulose derivada de plantas, a celulose bacteriana é mais sustentável e a celulose produzida é pura, não exigindo etapas complexas de purificação. A ultrassonografia e a extração por solvente usando NaOH ou SDS (dodecil sulfato de sódio) são muito eficazes para o isolamento da celulose bacteriana das células bacterianas.

Biomoléculas de fábricas de células para produção farmacêutica e de vacinas

Um dos produtos farmacêuticos mais proeminentes derivados de fábricas de células é a insulina humana. Para a produção de insulina de bioengenharia, são utilizadas predominantemente E. coli e Saccharomyces cerevisiae. Como as moléculas nanométricas biossintetizadas oferecem alta biocompatibilidade, as nanopartículas biológicas, como a ferritina, são vantajosas para inúmeras aplicações de biofabricação. Além disso, a produção em micróbios metabolicamente modificados é muitas vezes significativamente mais eficaz nos rendimentos obtidos. Por exemplo, a produção de ácido artemisínico, resveratrol e licopeno aumentou dez vezes para várias centenas de vezes, e já está estabelecida ou está em desenvolvimento para produção em escala industrial. (cf. Liu et al.; Microb. Fato celular. 2017)
Por exemplo, biomoléculas nanométricas baseadas em proteínas com propriedades de automontagem, como ferritina e partículas semelhantes a vírus, são especialmente interessantes para o desenvolvimento de vacinas, pois imitam o tamanho e a estrutura dos patógenos e são passíveis de conjugação de antígenos de superfície para promover a interação com células imunes. Essas moléculas são expressas nas chamadas fábricas de células (por exemplo, cepas de E. coli modificadas), que produzem uma determinada molécula-alvo.

Protocolo para Lise Ultrassônica e de E. coli BL21 para Liberação de Ferritina

A ferritina é uma proteína, cuja função primária é o armazenamento de ferro. A ferritina mostra capacidades promissoras como nanopartículas de automontagem em vacinas, onde é usada como veículo de entrega de vacinas (por exemplo, proteínas spike SARS-Cov-2). A pesquisa científica de Sun et. al. (2016) mostra que a ferritina recombinante pode ser liberada como uma forma solúvel de Escherichia coli em baixas concentrações de NaCl (≤50 mmol/L). Para expressar ferritina em E. coli BL21 e liberar a ferrtina, o seguinte protocolo foi aplicado com sucesso. O plasmídeo recombinante pET-28a/ferritina foi transformado na cepa E coli BL21 (DE3). As células BL21 (DE3) de ferritina E coli foram cultivadas em meio de crescimento LB com 0,5% de canamicina a 37°C e induzidas a um OD600 de 0,6 com 0,4% de isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo por 3 horas a 37°C. A cultura final foi então colhida por centrifugação a 8000g por 10 minutos a 4°C, e o pellet foi coletado. Em seguida, o pellet foi ressuspenso em meio LB (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% extrato de levedura)/tampão de lise (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) e diferentes concentrações de solução de NaCl (0, 50, 100, 170 e 300 mmol/L), respectivamente. Para a lise de células bacterianas, a sonicação foi aplicada no modo de pulso: por exemplo, usando o Ultrassonicador UP400St a 100% de amplitude com um ciclo de trabalho de 5 segundos ON, 10 segundos OFF, por 40 ciclos) e depois centrifugado a 10.000g por 15 minutos a 4°C. O sobrenadante e o precipitado foram analisados por eletroforese em gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). Todos os géis corados com dodecil sulfato de sódio foram escaneados com scanner de alta resolução. As imagens em gel foram analisadas usando o software Magic Chemi 1D. Para maior clareza, as bandas de proteína foram detectadas ajustando os parâmetros. Os dados para as bandas foram gerados a partir de triplicatas técnicas. (cf. Sun et al., 2016)

Disruptores de células ultrassônicos para lise industrial de fábricas de células

A lise e extração ultrassônica é um método confiável e confortável para liberar metabólitos das fábricas de células, auxiliando assim na produção eficaz de moléculas-alvo. Os disruptores de células ultrassônicos estão disponíveis desde o laboratório até o tamanho industrial e os processos podem ser dimensionados de forma completamente linear.
A Hielscher Ultrasonics é seu parceiro competente para disruptores ultrassônicos de alto desempenho e tem uma longa experiência no campo da implantação de sistemas ultrassônicos em ambientes industriais e de bancada.
Quando se trata de hardware e software sofisticados, os sistemas de interrupção de células Hielscher Ultrasonics atendem a todos os requisitos para um controle de processo ideal, fácil operação e facilidade de uso. Os clientes e usuários dos ultrassônicos Hielscher valorizam o benefício de que os disruptores e extratores de células ultrassônicos Hielscher permitem o monitoramento e controle precisos do processo – através de ecrã táctil digital e controlo remoto do navegador. Todos os dados importantes de sonicação (por exemplo, energia líquida, energia total, amplitude, duração, temperatura, pressão) são armazenados automaticamente como arquivo CSV em um cartão SD integrado. Isso ajuda a obter resultados reprodutíveis e repetíveis e facilita a padronização do processo, bem como o cumprimento das Boas Práticas de Fabricação (cGMP).
Obviamente, os processadores ultrassônicos Hielscher são construídos para operação 24 horas por dia, 7 dias por semana, sob carga total e, portanto, podem ser operados de forma confiável em ambientes de produção industrial. Devido à alta robustez e baixa manutenção, o tempo de inatividade do equipamento ultrassônico é muito baixo. Os recursos CIP (limpeza no local) e SIP (esterilização no local) minimizam a limpeza trabalhosa, especialmente porque todas as partes úmidas são superfícies metálicas lisas (sem orifícios ou bicos ocultos).

A tabela abaixo fornece uma indicação da capacidade aproximada de processamento de nossos ultrassônicos: