Produção biossintética de oligossacáridos do leite humano

A biossíntese de oligossacáridos do leite humano (HMOs) por fermentação ou reações enzimáticas é um processo complexo, que consome recursos e que frequentemente apresenta baixo rendimento. A aplicação de ultrassons aumenta a transferência de massa entre o substrato e as fábricas celulares e estimula o crescimento e o metabolismo celulares. Assim, a sonicação intensifica a fermentação e os processos bioquímicos, resultando numa produção de HMOs mais rápida e eficiente.

Oligossacáridos do leite humano

Os oligossacáridos do leite humano (HMOs), também conhecidos como glicanos do leite humano, são moléculas de açúcar que pertencem ao grupo dos oligossacáridos. Entre os exemplos mais relevantes de HMOs encontram-se a 2’-fucosilactose (2′-FL), a lacto-N-neotetraose (LNnT), a 3’-galactosilactose (3′-GL) e a difucosilactose (DFL).
Embora o leite materno humano contenha mais de 150 estruturas diferentes de HMOs, atualmente apenas a 2′-fucosilactose (2′-FL) e a lacto-N-neotetraose (LNnT) são produzidas à escala comercial e utilizadas como aditivos nutricionais em fórmulas para lactentes.
Os oligossacáridos do leite humano (HMOs) são conhecidos pela sua importância na nutrição dos bebés. Os oligossacáridos do leite humano são um tipo único de nutrientes que atuam como prebióticos, agentes antimicrobianos antiaderentes e imunomoduladores no intestino do lactente e contribuem substancialmente para o desenvolvimento cerebral. Os HMOs encontram-se exclusivamente no leite materno humano; os leites de outros mamíferos (por exemplo, vaca, cabra, ovelha, camela, etc.) não contêm estas formas específicas de oligossacáridos.
Os oligossacáridos do leite humano são o terceiro componente sólido mais abundante no leite humano, podendo estar presentes na água sob forma dissolvida, emulsionada ou suspensa. A lactose e os ácidos gordos são os sólidos mais abundantes no leite humano. Os HMOs estão presentes numa concentração de 0,35–0,88 onças (9,9–24,9 g)/ L. São conhecidos aproximadamente 200 oligossacáridos do leite humano estruturalmente diferentes. O oligossacárido dominante em 80% de todas as mulheres é a 2′-fucosilactose, presente no leite materno humano numa concentração de aproximadamente 2,5 g/ L.
Como os HMOs não são digeridos, não contribuem com calorias para a nutrição. Sendo hidratos de carbono indigeríveis, funcionam como prebióticos e são seletivamente fermentados pela microflora intestinal desejável, especialmente pelas bifidobactérias.

Biossíntese de oligossacáridos do leite humano

As fábricas celulares e os sistemas enzimáticos / quimioenzimáticos são tecnologias atualmente utilizadas para a síntese de HMOs. Para a produção de HMOs à escala industrial, a fermentação de fábricas celulares microbianas, a síntese bioquímica e diferentes reações enzimáticas são vias viáveis de bioprodução de HMOs. Por razões económicas, a biossíntese através de fábricas celulares microbianas é atualmente a única técnica utilizada na produção industrial de HMOs.

Fermentação de HMOs utilizando fábricas celulares microbianas

E.coli, Saccharomyces cerevisiae e Lactococcus lactis são fábricas celulares habitualmente utilizadas para a bioprodução de moléculas biológicas, como os HMOs. A fermentação é um processo bioquímico que utiliza microrganismos para converter um substrato nas moléculas biológicas pretendidas. As fábricas celulares microbianas utilizam açúcares simples como substrato, convertendo-os em HMOs. Como os açúcares simples (por exemplo, a lactose) são um substrato abundante e barato, o processo de biossíntese mantém uma boa relação custo-eficiência.
As taxas de crescimento e de bioconversão são influenciadas principalmente pela transferência de massa dos nutrientes (substrato) para os microrganismos. A taxa de transferência de massa é um dos principais fatores que afetam a síntese do produto durante a fermentação. A aplicação de ultrassons é bem conhecida por promover a transferência de massa.
Durante a fermentação, as condições no biorreator devem ser constantemente monitorizadas e reguladas para que as células possam crescer o mais rapidamente possível e, em seguida, produzir as biomoléculas pretendidas (por exemplo, oligossacáridos como os HMOs; insulina; proteínas recombinantes). Teoricamente, a formação do produto começa assim que a cultura celular começa a crescer. Contudo, especialmente nas células geneticamente modificadas, como os microrganismos modificados por engenharia genética, é geralmente induzida mais tarde através da adição ao substrato de uma substância química que aumenta a expressão da biomolécula pretendida. Os biorreatores ultrassónicos (sonobiorreatores) podem ser controlados com precisão e permitem a estimulação específica dos microrganismos. Isto resulta numa biossíntese mais rápida e em rendimentos mais elevados.
Lise e extração ultrassónicas: a fermentação de HMOs complexos pode ser limitada por baixas concentrações de produto na fermentação e pela permanência dos produtos no interior das células. A lise e a extração ultrassónicas são utilizadas para libertar material intracelular antes da purificação e dos processos subsequentes.

Fermentação promovida por ultrassons

A taxa de crescimento de microrganismos como Escherichia coli, E.coli modificada por engenharia genética, Saccharomyces cerevisiae e Lactococcus lactis pode ser acelerada através do aumento da taxa de transferência de massa e da permeabilidade da parede celular mediante a aplicação controlada de ultrassons de baixa frequência. Enquanto técnica de processamento suave e não térmica, a aplicação de ultrassons exerce forças puramente mecânicas no caldo de fermentação.
Cavitação acústica: o princípio de funcionamento da sonicação baseia-se na cavitação acústica. A sonda ultrassónica (sonotrodo) acopla ondas ultrassónicas de baixa frequência ao meio. As ondas ultrassónicas propagam-se através do líquido, criando ciclos alternados de alta pressão (compressão) / baixa pressão (rarefação). A compressão e o estiramento do líquido em ciclos alternados dão origem a minúsculas bolhas de vácuo. Estas pequenas bolhas de vácuo crescem ao longo de vários ciclos até atingirem um tamanho em que já não conseguem absorver mais energia. Neste ponto de crescimento máximo, a bolha de vácuo implode violentamente e gera condições localmente extremas, conhecidas como o fenómeno de cavitação. No «ponto quente» de cavitação, podem observar-se elevados diferenciais de pressão e temperatura e forças intensas de cisalhamento, com jatos de líquido de até 280m/sec. Estes efeitos de cavitação permitem obter uma transferência de massa completa e sonoporação (a perfuração das paredes celulares e das membranas celulares). Os nutrientes do substrato são transportados até às células vivas inteiras e para o seu interior, de modo que as fábricas celulares sejam nutridas de forma ótima e as taxas de crescimento e de conversão sejam aceleradas. Os biorreatores ultrassónicos constituem uma estratégia simples, mas altamente eficaz, para processar biomassa num processo de biossíntese num único reator.
É bem conhecido que uma sonicação suave e controlada com precisão intensifica os processos de fermentação.
A sonicação melhora «a produtividade de muitos bioprocessos que envolvem células vivas através da melhoria da absorção do substrato, do aumento da produção ou do crescimento mediante o aumento da porosidade celular e, potencialmente, do aumento da libertação de componentes celulares». (Naveena et al. 2015)
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Naveena et al. (2015) constataram que a intensificação ultrassónica oferece várias vantagens durante o bioprocessamento, incluindo baixos custos de operação em comparação com outras opções de tratamento destinadas a melhorar o processo, simplicidade de operação e necessidades de potência modestas.

Reatores ultrassónicos de alto desempenho para fermentação

Os processos de fermentação envolvem microrganismos vivos, como bactérias ou leveduras, que funcionam como fábricas celulares. Quando a sonicação é aplicada para promover a transferência de massa e aumentar as taxas de crescimento e de conversão dos microrganismos, é crucial controlar com precisão a intensidade ultrassónica para evitar a destruição das fábricas celulares.
A Hielscher Ultrasonics é especialista na conceção, no fabrico e na distribuição de sonicadores de alto desempenho, que podem ser controlados e monitorizados com precisão para garantir rendimentos de fermentação superiores.

O controlo do processo é essencial para obter rendimentos elevados e qualidade superior e também permite repetir e reproduzir os resultados. Especialmente no que diz respeito à estimulação das fábricas celulares, a adaptação dos parâmetros de sonicação às células específicas é essencial para alcançar rendimentos elevados e prevenir a degradação celular. Por isso, todos os modelos digitais de sonicadores Hielscher estão equipados com software inteligente, que permite ajustar, monitorizar e rever os parâmetros de sonicação. Os parâmetros do processo ultrassónico, como a amplitude, a temperatura, a pressão, a duração da sonicação, os ciclos de trabalho e a energia fornecida, são essenciais para promover a produção de HMOs por fermentação.
O software inteligente dos sonicadores Hielscher regista automaticamente todos os parâmetros importantes do processo no cartão SD integrado. O registo automático dos dados do processo de sonicação constitui a base da normalização do processo e da reprodutibilidade / repetibilidade, exigidas pelas Boas Práticas de Fabrico (GMP).

Reatores ultrassónicos para fermentação

A Hielscher oferece sondas ultrassónicas de vários tamanhos, comprimentos e geometrias, que podem ser utilizadas tanto em tratamentos por lotes como em tratamentos de fluxo contínuo. Os reatores ultrassónicos, também conhecidos como sonobiorreatores, estão disponíveis para qualquer volume, abrangendo o bioprocessamento ultrassónico desde pequenas amostras laboratoriais até à escala piloto e à produção plenamente comercial.
É bem conhecido que a localização do sonotrodo ultrassónico no recipiente de reação influencia a distribuição da cavitação e das microcorrentes no meio. O sonotrodo e o reator ultrassónico devem ser escolhidos em função do volume de caldo celular a processar. Embora a sonicação possa ser realizada tanto por lotes como em modo contínuo, para volumes de produção elevados recomenda-se a utilização de uma instalação de fluxo contínuo. Ao passar por uma célula de fluxo ultrassónica, todo o meio celular fica exposto à sonicação exatamente da mesma forma, garantindo o tratamento mais eficaz. A vasta gama de sondas ultrassónicas e de reatores com células de fluxo da Hielscher Ultrasonics permite montar a configuração ideal de bioprocessamento ultrassónico.

Hielscher Ultrasonics – Do laboratório à escala piloto e à produção

A Hielscher Ultrasonics abrange todo o espectro de equipamentos ultrassónicos, oferecendo desde homogeneizadores ultrassónicos compactos de mão para preparação de amostras até sistemas de bancada e piloto, bem como potentes unidades ultrassónicas industriais que processam facilmente cargas de camião por hora. Graças à sua versatilidade e flexibilidade nas opções de instalação e montagem, os sonicadores Hielscher podem ser facilmente integrados em todos os tipos de reatores por lotes, de lotes alimentados ou de instalações de fluxo contínuo.
Vários acessórios, bem como peças personalizadas, permitem adaptar de forma ideal a sua instalação ultrassónica aos requisitos do seu processo.
Concebidos para funcionamento 24/7 em plena carga e em serviço intensivo sob condições exigentes, os processadores ultrassónicos Hielscher são fiáveis e requerem apenas pouca manutenção.
A tabela abaixo dá-lhe uma indicação da capacidade aproximada de processamento dos nossos sonicadores: