Produção biossintética de oligossacáridos de leite humano
A biossíntese de oligossacarídeos do leite humano (HMOs) via fermentação ou reações enzimáticas é um processo complexo, consumidor e muitas vezes de baixo rendimento. Ultrasonication aumenta a transferência de massa entre substrato e fábricas de células e estimula o crescimento celular e metabolismo. Desse modo, a sonicação intensifica a fermentação e os processos bioquímicos, resultando em uma produção acelerada e mais eficiente de HMOs.
Oligossacáridos do leite humano
Os oligossacáridos do leite humano (HMOs), também conhecidos como glicanos do leite humano, são moléculas de açúcar que fazem parte do grupo dos oligossacáridos. Exemplos proeminentes de HMOs incluem a 2'-fucosilactose (2′-FL), lacto-N-neotetraose (LNnT), 3'-galactosilactose (3′-GL) e difucosilactose (DFL).
Embora o leite materno humano seja composto por mais de 150 estruturas diferentes de HMO, apenas a 2′-fucosilactose (2′-FL) e a lacto-N-neotetraose (LNnT) são atualmente produzidas a nível comercial e utilizadas como aditivos nutricionais em fórmulas para lactentes.
Os oligossacáridos do leite humano (HMOs) são conhecidos pela sua importância na nutrição dos bebés. Os oligossacáridos do leite humano são um tipo único de nutrientes, que actuam como prebióticos, antimicrobianos anti-adesivos e imunomoduladores no intestino do bebé e contribuem substancialmente para o desenvolvimento do cérebro. Os HMOs encontram-se exclusivamente no leite materno humano; outros leites de mamíferos (por exemplo, vaca, cabra, ovelha, camelo, etc.) não possuem esta forma específica de oligossacáridos.
Os oligossacáridos do leite humano são o terceiro componente sólido mais abundante no leite humano, que pode estar presente tanto na forma dissolvida como emulsionada ou suspensa na água. A lactose e os ácidos gordos são os sólidos mais abundantes encontrados no leite humano. Os HMOs estão presentes numa concentração de 0,35-0,88 onças (9,9-24,9 g)/L. São conhecidos aproximadamente 200 oligossacáridos do leite humano estruturalmente diferentes. O oligossacárido dominante em 80% de todas as mulheres é o 2′-fucosilactose, que está presente no leite materno humano numa concentração de aproximadamente 2,5 g/L.
Uma vez que os HMO não são digeridos, não contribuem para a nutrição em termos calóricos. Sendo hidratos de carbono indigestos, funcionam como prebióticos e são fermentados seletivamente pela microflora intestinal desejável, especialmente pelas bifidobactérias.
- promover o desenvolvimento dos bebés
- são importantes para o desenvolvimento do cérebro
- tem propriedades anti-inflamatórias e
- efeitos anti-adesivos no trato gastro-intestinal
- apoia o sistema imunitário dos adultos
a processador ultrassónico UIP2000hdT aumenta a transferência de massa e ativa as fábricas de células para maiores rendimentos de moléculas biossintetizadas, como os HMOs
Biossíntese dos oligossacáridos do leite humano
As fábricas de células e os sistemas enzimáticos/quimioenzimáticos são tecnologias atualmente utilizadas para a síntese de HMOs. Para a produção de HMO à escala industrial, a fermentação de fábricas de células microbianas, a síntese bioquímica e diferentes reacções enzimáticas são formas viáveis de bioprodução de HMO. Devido a razões económicas, a biossíntese através de fábricas de células microbianas é atualmente a única técnica utilizada a nível da produção industrial de HMOs.
Fermentação de HMOs utilizando fábricas de células microbianas
E.coli, Saccharomyces cerevisiae e Lactococcus lactis são fábricas de células comummente utilizadas para a bioprodução de moléculas biológicas como os HMO. A fermentação é um processo bioquímico que utiliza microrganismos para converter um substrato em moléculas biológicas específicas. As fábricas de células microbianas utilizam açúcares simples como substrato, que convertem em HMOs. Uma vez que os açúcares simples (por exemplo, a lactose) são um substrato abundante e barato, este facto mantém o processo de biossíntese eficiente em termos de custos.
O crescimento e a taxa de bioconversão são influenciados principalmente pela transferência de massa de nutrientes (substrato) para os microrganismos. A taxa de transferência de massa é um fator principal que afecta a síntese do produto durante a fermentação. Ultrasonication é bem conhecido para promover a transferência de massa.
Durante a fermentação, as condições no bioreactor devem ser constantemente monitorizadas e reguladas para que as células possam crescer o mais rapidamente possível, a fim de produzir as biomoléculas pretendidas (por exemplo, oligossacáridos como HMOs; insulina; proteínas recombinantes). Teoricamente, a formação do produto inicia-se logo que a cultura de células começa a crescer. No entanto, especialmente em células geneticamente modificadas, tais como microrganismos modificados, é geralmente induzida mais tarde pela adição de uma substância química ao substrato, que regula a expressão da biomolécula alvo. Os bioreactores ultra-sónicos (sono-bioreactores) podem ser controlados com precisão e permitem a estimulação específica dos micróbios. Isto resulta numa biossíntese acelerada e em rendimentos mais elevados.
Lise e extração por ultra-sons: A fermentação de HMOs complexos pode ser limitada por títulos de fermentação baixos e produtos que permanecem intracelulares. A lise e extração ultra-sónicas são utilizadas para libertar material intracelular antes da purificação e dos processos a jusante.
Fermentação promovida por ultra-sons
A taxa de crescimento de micróbios, tais como Escherichia coli, E.coli engenharia, Saccharomyces cerevisiae e Lactococcus lactis pode ser acelerado através do aumento da taxa de transferência de massa e permeabilidade da parede celular através da aplicação de ultra-sons de baixa frequência controlada. Como uma técnica de processamento suave e não térmica, a ultrassonografia aplica forças puramente mecânicas no caldo de fermentação.
Cavitação acústica: O princípio de funcionamento da sonicação baseia-se na cavitação acústica. A sonda ultra-sónica (sonotrodo) acopla ondas de ultra-sons de baixa frequência no meio. As ondas de ultra-sons viajam através do líquido criando ciclos alternados de alta pressão (compressão) / baixa pressão (rarefação). Ao comprimir e esticar o líquido em ciclos alternados, surgem pequenas bolhas de vácuo. Estas pequenas bolhas de vácuo crescem ao longo de vários ciclos até atingirem um tamanho que não lhes permite absorver mais energia. Neste ponto de crescimento máximo, a bolha de vácuo implode violentamente e gera condições locais extremas, conhecidas como o fenómeno da cavitação. No "ponto quente" cavitacional, podem ser observados elevados diferenciais de pressão e temperatura e forças de cisalhamento intensas com jactos de líquido até 280 m/s. Através destes efeitos cavitacionais, consegue-se uma transferência de massa completa e sonoporação (perfuração das paredes e membranas celulares). Os nutrientes do substrato são flutuados para e dentro das células inteiras vivas, de modo a que as fábricas de células sejam alimentadas de forma óptima e o crescimento, bem como as taxas de conversão, sejam acelerados. Biorreatores ultra-sônicos são uma estratégia simples, mas altamente eficaz para processar biomassa em um processo de biossíntese one-pot.
Uma sonicação suave e controlada com precisão é bem conhecida por intensificar os processos de fermentação.
A sonicação melhora "a produtividade de muitos bioprocessos que envolvem células vivas através do aumento da absorção do substrato, da produção ou crescimento melhorados pelo aumento da porosidade celular e da libertação potencialmente melhorada de componentes celulares". (Naveena et al. 2015)
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- Fermentação acelerada
- Estimulação específica da célula
- Aumento da absorção de substratos
- Aumento da porosidade celular
- Fácil de operar
- seguro
- Readaptação simples
- expansão linear a escala larga
- Processamento em lote ou em linha
- ROI rápido
Naveena et al. (2015) descobriram que a intensificação ultra-sônica oferece várias vantagens durante o bioprocessamento, incluindo baixos custos operacionais em comparação com outras opções de tratamento de reforço, simplicidade de operação e requisitos de energia modestos.
O MultiSonoReactor MSR-4 é um homogeneizador industrial em linha adequado para a biossíntese melhorada de Oligossacáridos de Leite Humano (HMO).
Reactores de Fermentação Ultrassónicos de Alto Desempenho
Os processos de fermentação envolvem microorganismos vivos, tais como bactérias ou leveduras, que funcionam como fábricas de células. Embora a sonicação seja aplicada para promover a transferência de massa e aumentar a taxa de crescimento e conversão dos microrganismos, é crucial controlar a intensidade ultra-sónica com precisão para evitar a destruição das fábricas de células.
A Hielscher Ultrasonics é especialista na conceção, fabrico e distribuição de ultrassons de alto desempenho, que podem ser controlados e monitorizados com precisão para garantir rendimentos de fermentação superiores.
O controlo do processo não só é essencial para obter rendimentos elevados e uma qualidade superior, como também permite repetir e reproduzir os resultados. Especialmente quando se trata da estimulação de fábricas de células, a adaptação específica da célula dos parâmetros de sonicação é essencial para alcançar altos rendimentos e para evitar a degradação celular. Por isso, todos os modelos digitais de ultrasonicators Hielscher estão equipados com software inteligente, que permite ajustar, monitorizar e rever os parâmetros de sonicação. Os parâmetros do processo ultrassónico, tais como amplitude, temperatura, pressão, duração da sonicação, ciclos de trabalho e entrada de energia são essenciais para promover a produção de HMO através da fermentação.
O software inteligente dos ultrassónicos Hielscher regista automaticamente todos os parâmetros importantes do processo no cartão SD integrado. O registo automático de dados do processo de sonicação são a base para a padronização do processo e reprodutibilidade / repetibilidade, que são necessários para as Boas Práticas de Fabricação (GMP).
Rectores de ultra-sons para fermentação
A Hielscher oferece sondas ultra-sónicas de vários tamanhos, comprimentos e geometrias, que podem ser utilizadas tanto para tratamentos em lote como em fluxo contínuo. Os reactores ultra-sónicos, também conhecidos como sono-bioreactores, estão disponíveis para qualquer volume que abranja o bioprocessamento ultrassónico, desde pequenas amostras de laboratório até ao nível de produção piloto e totalmente comercial.
É sabido que a localização do sonotrodo ultrassónico no recipiente de reação influencia a distribuição da cavitação e do microfluxo no meio. O sonotrodo e o reator de ultra-sons devem ser escolhidos de acordo com o volume de processamento do caldo de células. Embora a sonicação possa ser efectuada tanto em modo descontínuo como contínuo, para volumes de produção elevados recomenda-se a utilização de uma instalação de fluxo contínuo. Ao passar através de uma célula de fluxo ultrassónico, todo o meio celular obtém exatamente a mesma exposição à ultra-sons, assegurando o tratamento mais eficaz. Hielscher Ultrasonics ampla gama de sondas ultra-sônicas e reatores de células de fluxo permite montar a configuração ideal de bioprocessamento ultra-sônico.
Hielscher Ultrasonics – Do laboratório ao piloto e à produção
A Hielscher Ultrasonics abrange todo o espetro do equipamento ultrassónico, oferecendo homogeneizadores ultra-sónicos portáteis compactos para a preparação de amostras, sistemas de bancada e sistemas-piloto, bem como unidades ultra-sónicas industriais potentes que processam facilmente cargas de camiões por hora. Sendo versáteis e flexíveis nas opções de instalação e montagem, os ultrassons da Hielscher podem ser facilmente integrados em todos os tipos de reactores descontínuos, lotes alimentados ou configurações de fluxo contínuo.
Vários acessórios, bem como peças personalizadas, permitem a adaptação ideal da sua configuração ultra-sónica aos requisitos do seu processo.
Construídos para funcionar 24 horas por dia, 7 dias por semana, em plena carga e em condições exigentes, os processadores ultra-sónicos Hielscher são fiáveis e requerem pouca manutenção.
O quadro seguinte dá-lhe uma indicação da capacidade de processamento aproximada dos nossos ultra-sons:
| Volume do lote | caudal | Dispositivos recomendados |
|---|---|---|
| 1 a 500mL | 10 a 200mL/min | UP100H |
| 10 a 2000mL | 20 a 400mL/min | UP200Ht, UP400ST |
| 0.1 a 20L | 0.2 a 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 a 100L | 2 a 10L/min | UIP4000hdt |
| n.d. | 10 a 100L/min | UIP16000 |
| n.d. | maior | grupo de UIP16000 |
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Homogeneizadores ultra-sónicos de alta potência de laboratório para piloto e Industrial escala.
Literatura / Referências
- Muschiol, Jan; Meyer, Anne S. (2019): A chemo-enzymatic approach for the synthesis of human milk oligosaccharide backbone structures. Zeitschrift für Naturforschung C, Volume 74: Issue 3-4, 2019. 85-89.
- Birgitte Zeuner, David Teze, Jan Muschiol, Anne S. Meyer (2019): Synthesis of Human Milk Oligosaccharides: Protein Engineering Strategies for Improved Enzymatic Transglycosylation. Molecules 24, 2019.
- Yun Hee Choi, Bum Seok Park, Joo‐Hyun Seo, Byung‐Gee Ki (2019): Biosynthesis of the human milk oligosaccharide 3‐fucosyllactose in metabolically engineered Escherichia coli via the salvage pathway through increasing GTP synthesis and β‐galactosidase modification. Biotechnology and Bioengineering Volume 116, Issue 12. December 2019.
- Balakrishnan Naveena, Patricia Armshaw, J. Tony Pembroke (2015): Ultrasonic intensification as a tool for enhanced microbial biofuel yields. Biotechnology of Biofuels 8:140, 2015.
- Shweta Pawar, Virendra K. Rathod (2020): Role of ultrasound in assisted fermentation technologies for process enhancements. Preparative Biochemistry & Biotechnology 50(6), 2020. 1-8.
Fatos, vale a pena conhecer
Biossíntese utilizando fábricas de células
Uma fábrica de células microbianas é um método de bioengenharia que utiliza células microbianas como meio de produção. Através da engenharia genética de micróbios, o ADN de microrganismos como bactérias, leveduras, fungos, células de mamíferos ou algas é modificado, transformando os micróbios em fábricas de células. As fábricas de células são utilizadas para converter substratos em moléculas biológicas valiosas, que são utilizadas, por exemplo, na produção de alimentos, produtos farmacêuticos, químicos e combustíveis. Diferentes estratégias de biossíntese baseadas em fábricas de células têm como objetivo a produção de metabolitos nativos, a expressão de vias biossintéticas heterólogas ou a expressão de proteínas.
As fábricas de células podem ser utilizadas para sintetizar metabolitos nativos, para exprimir vias biossintéticas heterólogas ou para exprimir proteínas.
Biossíntese de metabolitos nativos
Os metabolitos nativos são definidos como moléculas biológicas que as células utilizadas como fábricas de células produzem naturalmente. As fábricas de células produzem estas moléculas biológicas quer intracelularmente, quer como substância segregada. Esta última é preferida, uma vez que facilita a separação e a purificação dos compostos visados. Exemplos de metabolitos nativos são os aminoácidos e os ácidos nucleicos, os antibióticos, as vitaminas, as enzimas, os compostos bioactivos e as proteínas produzidas a partir das vias anabólicas das células.
Vias biossintéticas de Heterologus
Quando se tenta produzir um composto interessante, uma das decisões mais importantes é a escolha entre a produção no hospedeiro nativo, e a otimização deste hospedeiro, ou a transferência da via para outro hospedeiro bem conhecido. Se o hospedeiro original puder ser adaptado a um processo de fermentação industrial e não houver riscos para a saúde ao fazê-lo (por exemplo, produção de subprodutos tóxicos), esta pode ser a estratégia preferida (como foi o caso, por exemplo, da penicilina). No entanto, em muitos casos modernos, o potencial de utilização de uma fábrica de células preferida industrialmente e de processos de plataforma relacionados supera a dificuldade de transferência da via.
Expressão de proteínas
A expressão de proteínas pode ser conseguida através de formas homólogas e heterólogas. Na expressão homóloga, um gene que está naturalmente presente num organismo é sobre-expresso. Através desta sobre-expressão, pode ser produzido um maior rendimento de uma determinada molécula biológica. Para a expressão heteróloga, um gene específico é transferido para uma célula hospedeira na qual o gene não está presente naturalmente. Utilizando a engenharia celular e a tecnologia de ADN recombinante, o gene é inserido no ADN do hospedeiro, de modo a que a célula hospedeira produza (grandes) quantidades de uma proteína que não produziria naturalmente. A expressão de proteínas é feita numa variedade de hospedeiros, desde bactérias, por exemplo, E. coli e Bacillis subtilis, leveduras, por exemplo, Klyuveromyces lactis, Pichia pastoris, S. cerevisiae, fungos filamentosos, por exemplo, A. niger, e células derivadas de organismos multicelulares, como mamíferos e insectos. As proteínas inumeras são de grande interesse comercial, incluindo enzimas a granel, produtos biofarmacêuticos complexos, diagnósticos e reagentes de investigação. (cf. A.M. Davy et al. 2017)