Síntese de péptidos em fase sólida – Mais eficiente com sonicação
A síntese de péptidos em fase sólida (SPPS) é o método habitual de síntese de péptidos. A ultrassonicação é uma ferramenta fiável para intensificar a síntese de péptidos em fase sólida, proporcionando rendimentos mais elevados, maior pureza, ausência de racemização e uma velocidade de reação significativamente superior. A Hielscher Ultrasonics oferece várias soluções ultrassónicas para a síntese, clivagem e dissolução de péptidos.
Síntese ultrassónica de péptidos em fase sólida
A ultrassonicação já é amplamente utilizada como método de intensificação na síntese orgânica e é bem conhecida pelas suas vantagens, como tempos de reação drasticamente reduzidos, rendimentos mais elevados, menos subprodutos, a iniciação de vias reacionais que não poderiam ser alcançadas de outras formas e/ou melhor seletividade. Também se podem obter grandes benefícios quando a sonicação é acoplada às reações de síntese de péptidos. Os resultados da investigação demonstraram que a síntese de péptidos assistida por ultrassons permite obter um rendimento otimizado de péptidos com elevada pureza, sem racemização, num curto tempo de reação.
- Elevados rendimentos de péptidos
- Síntese significativamente mais rápida
- Maior pureza dos péptidos
- Sem racemização
- Síntese paralela de vários péptidos
- Adaptável a qualquer volume
Sonotrodo ultrassónico de copo para a sonicação uniforme de vários recipientes de reação, permitindo melhorar a síntese de péptidos.
Esquema que ilustra a síntese de péptidos em fase sólida de Merrifield. A ultrassonicação é utilizada para promover e melhorar a reação de síntese, bem como para a clivagem dos péptidos sintetizados, separando-os da resina.
Esquema: ©Conejos-Sanchez et al., 2014)
| Estudo | Péptido(s) estudado(s) | Tempo de reação (método clássico vs US-SPPS) | Pureza do produto bruto (método clássico vs US-SPPS) | Racemização e reações secundárias | Principais conclusões |
|---|---|---|---|---|---|
| Wołczański et al. (2019) | Met-encefalina, UB33-43-OCam, TAT48-60-NH2, B2m58-69-NH2, ACP65-74-NH2, β-endorfina | 600–1920 min → 48–284 min | 24,2–71,3% → 60,6–89,9% | Nenhuma observada para Cys/His, mesmo a 70°C | Síntese ~7–12x mais rápida; grandes melhorias de pureza, sobretudo para sequências propensas à agregação, como TAT. |
| Silva et al. (2021) | Pep1 (12 resíduos), Pep2 (9 resíduos), Pep3 (25 resíduos) | >3515/365 min → ~250/85 min (Pep1/Pep2); Pep3: 347 min (apenas US) | 73–84% → 72–82% (Pep1/Pep2) | Não testadas; observou-se uma ligeira diminuição da pureza de Pep2 | Redução do tempo de 14x para Pep1; aumento significativo dos rendimentos do produto bruto. |
| Merlino et al. (2019) | Pentapéptidos modelo, péptidos com até 44 resíduos, “sequências difíceis” (Aβ 1-42, ACP 65-74) | 60 min → 30 min (modelo) | 84% → 93% (modelo); significativamente superior à obtida por aquecimento térmico (~45°C) | Sem aumento significativo dos enantiómeros de Cys/His | Altamente eficaz para sequências difíceis/propensas à agregação; permite reduzir o excesso de reagentes, mantendo uma elevada pureza. |
Síntese de péptidos em fase sólida melhorada com ultrassons
A síntese de péptidos em fase sólida (SPPS) é uma reação química que permite construir uma cadeia peptídica através de reações sucessivas de derivados de aminoácidos num suporte poroso insolúvel. No entanto, a síntese tradicional de péptidos em fase sólida é um processo relativamente ineficiente e lento. Por isso, a intensificação ultrassónica da síntese de péptidos é uma ferramenta muito valorizada para uma síntese de péptidos mais eficaz e rápida.
Silva et al. (2021) compararam a síntese “clássica” de péptidos em fase sólida (SPPS) com fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) com a SPPS assistida por ultrassons (US), com base na preparação de três péptidos, nomeadamente o péptido Pep1 (VSPPLTLGQLLS-NH2), específico do recetor 3 do fator de crescimento dos fibroblastos (FGFR3), e os novos péptidos Pep2 (RQMATADEA-NH2) e Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2).
A SPPS assistida por US permitiu reduzir o tempo de construção dos péptidos em 14 vezes (Pep1) e 4 vezes (Pep2), em comparação com o método “clássico”. Curiosamente, a SPPS assistida por ultrassons produziu Pep1 com maior pureza (82%) do que a SPPS “clássica” (73%). A redução significativa do tempo, combinada com a elevada pureza dos péptidos brutos obtidos, levou a equipa de investigação a aplicar a SPPS assistida por US ao péptido de grandes dimensões Pep3, que apresenta um elevado número de aminoácidos hidrofóbicos e sequências homooligoméricas. Notavelmente, a síntese deste péptido de 25 resíduos foi conseguida em menos de 6 horas (347 min), com uma pureza moderada (aprox. 49%).
Síntese mais rápida de péptidos através da síntese de péptidos em fase sólida com agitação ultrassónica.
(Estudo e análise: Wołczański et al., 2019)
Merlino et al. (2019) também realizaram um estudo abrangente dos efeitos ultrassónicos na síntese de péptidos em fase sólida baseada em Fmoc, que permitiu sintetizar diferentes péptidos biologicamente ativos (com até 44 resíduos), com uma redução notável do consumo de materiais e do tempo de reação. Demonstraram que a ultrassonicação não agravou as principais reações secundárias e melhorou a síntese de péptidos com “sequências difíceis”, colocando a síntese de péptidos em fase sólida promovida por ultrassons (US-SPPS) entre as atuais estratégias de síntese de péptidos de elevada eficiência.
A disponibilidade de sistemas de elevado desempenho para a síntese ultrassónica (sónica) de péptidos permite melhorar significativamente as velocidades de síntese e aumentar a pureza dos produtos brutos. (cf. Wołczański et al., 2019)
Investigação da racemização. Comparação de espectros relevantes de RMN de 1H de péptidos modelo sintetizados manualmente pela abordagem clássica à temperatura ambiente e pelo método ultrassónico a temperatura elevada. Os desvios químicos dos protões α de His e Cys e do grupo metileno de Acm (painéis à esquerda), bem como dos protões do grupo ɣ-metilo de Val (painéis à direita), mostram que a sonicação a 70°C não provoca racemização.
(Estudo e análise: Wołczański et al., 2019)
Clivagem ultrassónica de péptidos
Após a síntese de péptidos em fase sólida (SPPS), os péptidos sintetizados têm de ser separados das resinas poliméricas por clivagem. Esta etapa também é conhecida como desproteção. Ao comparar a agitação convencional com a ultrassonicação para a clivagem dos péptidos ligados à resina, o método de agitação requer aprox. 1 hora, enquanto a clivagem ultrassónica pode ser realizada em 15 a 20 min. A clivagem ultrassónica de péptidos pode ser aplicada à clivagem de aminoácidos protegidos e péptidos ligados a resinas de poliestireno por ligações éster benzílicas.
A clivagem ultrassónica de péptidos ligados à resina de poliestireno proporciona elevados rendimentos de péptidos com elevada pureza, sem racemização, através de um procedimento rápido.
(estudo e esquema: ©Anuradha e Ravindranath, 1995)
Reator com agitação ultrassónica para melhorar e acelerar a síntese de péptidos. A imagem mostra o sonicador UP200St num reator de vidro com agitação.
Sonicadores de elevado desempenho para a síntese de péptidos
A Hielscher Ultrasonics oferece várias soluções ultrassónicas para sonicação direta e indireta. Os processadores ultrassónicos potentes e controláveis com precisão fornecem exatamente a quantidade adequada de energia ultrassónica ao recipiente de reação. Quer utilize seringas, tubos, placas multipoços ou reatores de vidro como recipientes de síntese, a Hielscher Ultrasonics oferece o sonicador mais adequado à sua aplicação com péptidos.
- péptidos personalizados
- produção de péptidos em grande escala
- bibliotecas de péptidos
Muitas sínteses de péptidos são realizadas em seringas (por exemplo, reatores de seringa com frita). O agitador ultrassónico de seringas da Hielscher submete a solução de péptidos a sonicação, acoplando as ondas ultrassónicas ao líquido através da parede da seringa. O agitador ultrassónico de seringas é uma das soluções ultrassónicas mais populares para a síntese de péptidos assistida por ultrassons.
O sonotrodo ultrassónico de copo é uma ferramenta adequada para submeter até 5 recipientes de reação a sonicação, enquanto o VialTweeter pode alojar até dez tubos de reação e, adicionalmente, cinco recipientes maiores através de um acessório de fixação por abraçadeira.
Para outros tipos de reatores, como o reator de fase sólida de Merrifield ou de Kamysz, e outros recipientes e reatores de polipropileno ou borossilicato, a Hielscher oferece sonicadores para sonicação indireta e direta com montagem personalizada por abraçadeira ou flange.
Naturalmente, os reatores de vidro maiores com agitação, por exemplo para síntese em fase líquida, podem ser facilmente equipados com sondas ultrassónicas (também conhecidas como sonotrodos ou cornetas ultrassónicas) de qualquer dimensão.
- vários tipos de sonicadores
- sonicação direta e indireta
- controlo preciso da intensidade
- controlo preciso da temperatura
- ultrassons contínuos ou pulsados
- funcionalidades inteligentes, dispositivos programáveis
- disponíveis para qualquer volume
- escalabilidade linear
Para a síntese de péptidos em fase sólida em placas multipoços/de microtitulação, o UIP400MTP é o dispositivo ideal. A cavitação ultrassónica é acoplada indiretamente e de forma uniforme aos numerosos poços de amostras, para uma transferência de massa e uma reação de síntese superiores. Veja o vídeo abaixo para ver o sonicador de microplacas UIP400MTP em ação!
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A Hielscher Ultrasonics fabrica homogeneizadores ultrassónicos de elevado desempenho para aplicações de mistura, dispersão, emulsificação e extração à escala laboratorial, piloto e industrial.
Informações úteis sobre a síntese ultrassónica de péptidos
O que são péptidos?
Os péptidos são compostos em que vários aminoácidos estão ligados por ligações amida, as chamadas ligações peptídicas. Quando se ligam em estruturas complexas – normalmente constituídas por 50 ou mais aminoácidos –, estas grandes estruturas peptídicas são designadas proteínas. Os péptidos são componentes essenciais da vida e desempenham numerosas funções no organismo.
Como funciona a síntese de péptidos?
Em química orgânica, biologia molecular e ciências da vida, a síntese de péptidos é o processo de produção de péptidos. Os péptidos são sintetizados quimicamente através de uma reação de condensação entre o grupo carboxilo de um aminoácido e o grupo amino de outro aminoácido. Utilizam-se habitualmente estratégias de grupos protetores (também designados grupos de proteção) para evitar reações secundárias indesejadas com as diversas cadeias laterais dos aminoácidos.
A síntese química (in vitro) de péptidos começa, na maioria das vezes, pelo acoplamento do grupo carboxilo do aminoácido a incorporar (extremidade C-terminal) à extremidade N-terminal da cadeia peptídica em crescimento. Ao contrário desta síntese de C para N, a biossíntese natural de proteínas constituídas por péptidos longos em organismos vivos ocorre no sentido oposto. Isto significa que, na biossíntese, a extremidade N-terminal do aminoácido a incorporar é ligada à extremidade C-terminal da cadeia proteica (de N para C).
A maioria dos protocolos de investigação e desenvolvimento para a síntese de péptidos baseia-se em métodos de fase sólida, enquanto os métodos de síntese em fase líquida são utilizados na produção industrial de péptidos em grande escala.
Qual é o estado da arte atual na síntese de péptidos?
SUS-SPPS (SPPS sustentável assistida por ultrassons) demonstrou reduzir o processo a apenas duas etapas por ciclo (acoplamento/bloqueio terminal/desproteção combinados + uma única lavagem), reduzindo significativamente o consumo de solventes e o tempo. (cf. Mottola et al., 2025)
TAPS assistida por ultrassons é uma combinação emergente com sucesso demonstrado em sínteses totais (por exemplo, lipobactin) e está a ser explorada por organizações de desenvolvimento e fabrico por contrato (CDMO) para o fabrico de princípios ativos farmacêuticos (API).
Descubra as vantagens da síntese de péptidos por TAGGING assistida por ultrassons!
Processamento contínuo está a ser explorado como uma melhoria adicional – foram descritas plataformas de síntese contínua num único recipiente assistida por marcadores sililados.
A área está a evoluir para os princípios da química verde, com os ultrassons e a TAPS a contribuírem para uma menor utilização de solventes, menores quantidades de reagentes e maior sustentabilidade.
Bibliografia / Referências
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
- Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.
A Hielscher Ultrasonics fabrica homogeneizadores ultrassónicos de elevado desempenho, desde a escala laboratorial até à escala industrial.