Eluição de anticorpos utilizando a sonicação de elevado rendimento

A cromatografia de afinidade é uma técnica poderosa para a purificação de proteínas, que requer uma eluição inespecífica assistida por ultra-sons, sendo uma técnica fiável de preparação de amostras para obter anticorpos a partir da cromatografia de afinidade. A eluição eficiente e reprodutível de anticorpos alvo ligados a matrizes de afinidade é significativamente melhorada por sonicação. O sonicador de placas de elevado rendimento UIP400MTP é perfeitamente adequado para eluir um elevado número de amostras em placas de 96 poços, microtitulação e multipoços e facilita a recuperação de anticorpos em cromatografia de afinidade.

Como é que a sonicação facilita a eluição?

Utilizando a eluição não específica intensificada por ultra-sons, os trabalhadores de laboratório e os cientistas podem recuperar eficazmente os anticorpos purificados das colunas de cromatografia de afinidade. Estes anticorpos purificados são utilizados em aplicações a jusante em vários domínios, como a imunologia, a biotecnologia e o diagnóstico médico.

A eluição é uma fase de preparação da amostra utilizada normalmente na cromatografia de afinidade: A cromatografia de afinidade explora as interações altamente específicas entre uma molécula alvo (como um anticorpo) e um ligando imobilizado numa matriz cromatográfica. Isto permite a purificação selectiva da molécula alvo a partir de uma mistura complexa, utilizando a afinidade de ligação específica das moléculas, por exemplo, anticorpos.
Ligação específica de anticorpos: Os anticorpos são frequentemente purificados por cromatografia de afinidade, onde se ligam seletivamente a um ligando imobilizado na resina de cromatografia. Este pode ser um antigénio, uma proteína A/G ou qualquer outra molécula que interaja especificamente com o anticorpo de interesse.
Eluição: Após a ligação do anticorpo alvo à matriz, o passo seguinte envolve a eluição (ou lavagem) do anticorpo ligado da resina. Esta etapa de eluição envolve normalmente a rutura da ligação específica entre o anticorpo e o ligando. Este passo pode ser facilitado por sonicação.
Eluição não específica assistida por ultra-sons: Ao contrário dos métodos de eluição específicos que perturbam apenas a interação anticorpo-ligando, os métodos de eluição não específicos perturbam todas as interações na resina, incluindo as não específicas. Isto pode ser vantajoso quando se trata de contaminantes fortemente ligados que podem interferir com o processo de purificação. Aqui entra em jogo a sonicação! As ondas ultra-sónicas são utilizadas para gerar bolhas de cavitação no tampão de eluição. Quando essas bolhas colapsam perto da matriz de resina, produzem forças de cisalhamento localizadas intensas e microfluxo. Esta perturbação mecânica ajuda a quebrar as interações não específicas entre o anticorpo e o ligando, facilitando a eluição do anticorpo ligado a partir da matriz.

Vantagens da eluição por ultra-sons utilizando a sonicação

A eluição por ultra-sons oferece várias vantagens, nomeadamente no contexto das técnicas de purificação de proteínas, como a cromatografia de afinidade.
Por exemplo, a sonicação supera os métodos alternativos em termos de integridade, recuperação, pureza, versatilidade e eficiência das proteínas. Estas vantagens fazem da eluição ultra-sónica a escolha preferida para os processos de purificação de proteínas, particularmente em aplicações em que é essencial manter a estrutura e a atividade das proteínas. Além disso, a eluição ultra-sónica destaca-se pela sua simplicidade, eficiência, versatilidade e compatibilidade com uma vasta gama de proteínas e matrizes de afinidade. Aplicando ondas de ultra-sons para perturbar as interações proteína-matriz, a eluição ultra-sónica oferece um método suave e rápido para a purificação de proteínas, assegurando elevadas taxas de recuperação e preservando a integridade das proteínas para aplicações a jusante.

Mais suavidade na estrutura das proteínas: A eluição a pH baixo envolve a utilização de tampões ácidos para interromper a ligação entre a proteína alvo (por exemplo, anticorpos) e a matriz de afinidade. No entanto, a exposição a um pH baixo pode desnaturar as proteínas, comprometendo potencialmente a sua estrutura e atividade biológica. Em contrapartida, a eluição ultra-sónica baseia-se principalmente na rutura mecânica e não na desnaturação química, o que a torna mais suave para a estrutura da proteína. Isto é particularmente vantajoso quando se purificam proteínas delicadas ou anticorpos sensíveis a alterações de pH.

• Redução do risco de agregação: A eluição com baixo pH pode aumentar o risco de agregação das proteínas devido ao seu desdobramento e à exposição das regiões hidrofóbicas. A agregação pode levar à perda de atividade da proteína e a dificuldades no processamento a jusante. A eluição ultra-sónica, por comparação, minimiza o risco de agregação, empregando forças mecânicas para perturbar as interações entre a proteína e a matriz de afinidade sem alterar significativamente a conformação nativa da proteína.
• Recuperação e pureza melhoradas: A eluição por ultra-sons pode atingir taxas de recuperação e níveis de pureza mais elevados em comparação com métodos de eluição alternativos. A rutura mecânica proporcionada pela ultra-sons liberta eficazmente as proteínas ligadas da matriz de afinidade, minimizando as interações não específicas. Isto resulta numa maior recuperação da proteína alvo com uma contaminação reduzida de moléculas ligadas de forma não específica, contribuindo para uma maior pureza da fração eluída.
• Processamento de alto rendimento: Hielscher Ultrasonics oferece vários sonicadores para purificação de proteínas assistida por ultrassom, eluição e biopanning. A placa de microtitulação-sonicador UIP400MTP permite o processamento em massa de amostras em 96 poços e outras placas multiwell. O VialTweeter é ideal para a sonicação simultânea e sem complicações de até 10 tubos, tais como frascos Eppendorf, sob as mesmas condições. O CupHorn é um sonicador versátil ideal para vários tubos, pequenos béqueres e outros recipientes. E, claro, os sonicadores clássicos do tipo sonda com micropontas são uma ferramenta de laboratório bem estabelecida para a preparação de amostras. A gama de produtos Hielscher Ultrasonics tem o sonicador ideal para a configuração da sua experiência e para o tamanho da sua amostra.
• Versatilidade e compatibilidade: A eluição por ultra-sons é compatível com uma vasta gama de proteínas e matrizes de afinidade, oferecendo versatilidade nas aplicações de purificação. Em contrapartida, a eluição a pH baixo pode não ser adequada para determinadas proteínas sensíveis a condições ácidas ou para matrizes de afinidade propensas a degradação ou lixiviação a pH baixo. A eluição por ultra-sons constitui uma alternativa suave e universalmente aplicável que pode ser adaptada a necessidades específicas de purificação sem comprometer a integridade das proteínas ou a estabilidade da matriz.
• Tempo e eficiência: A eluição ultra-sónica requer normalmente tempos de eluição mais curtos em comparação com outros métodos de eluição. A libertação rápida e eficiente de proteínas ligadas facilitada pela ultra-sons reduz o tempo de processamento e aumenta a eficiência global da purificação, tornando-a uma opção atractiva para aplicações de elevado rendimento ou quando são necessários resultados sensíveis ao tempo.

Biopanning assistido por ultra-sons

O biopanning é uma técnica crítica na purificação de anticorpos, especialmente quando é necessário obter anticorpos altamente específicos para investigação ou diagnóstico médico. O biopanning é o processo em que os anticorpos são isolados a partir de uma mistura de anticorpos, a chamada biblioteca de anticorpos.

Como funciona o Biopanning ultrassónico?

Começa com uma biblioteca de anticorpos, uma mistura de vários anticorpos. Cada anticorpo é caracterizado pela sua própria forma e especificidade. Para a análise e a terapêutica, é necessário isolar anticorpos específicos que reconheçam um determinado alvo, como um vírus ou uma célula cancerígena. Utilizando o biopanning, estes anticorpos específicos podem ser isolados. A ultrassonografia ajuda a facilitar o processo de biopanning, tornando a purificação de anticorpos mais eficiente.

Começando com uma biblioteca de anticorpos, os anticorpos são normalmente apresentados na superfície de um bacteriófago, célula de levedura ou outro sistema de apresentação. Esta biblioteca representa uma gama diversificada de anticorpos.
Na primeira etapa, esta biblioteca é exposta à sua molécula alvo. Os anticorpos que se ligam ao alvo aderem, enquanto os outros são lavados. Para remover os anticorpos não ligados, as amostras são lavadas várias vezes com uma solução tampão.

Agora, temos amostras que contêm apenas anticorpos ligados. No entanto, isto significa que os anticorpos ainda estão ligados ao seu sistema de visualização. Para os libertar, a interação anticorpo-ligante tem de ser quebrada. Este passo é conhecido como eluição. As amostras podem ser eluídas utilizando uma solução que perturbe a ligação, por exemplo, utilizando um tampão de eluição específico, um caotrópico, baixando o valor do pH, aplicando calor, etc. Estas técnicas de eluição destroem a ligação anticorpo-ligando, mas também podem deteriorar os próprios anticorpos. É por isso que a sonicação é utilizada como técnica alternativa para remover suavemente os anticorpos do seu alvo.

Após a finalização da etapa de eluição, obtemos anticorpos purificados, prontos para utilização em investigação, diagnóstico ou terapia.

O biopanning é uma técnica poderosa na purificação de anticorpos e a eluição ultra-sónica facilita e intensifica a eficácia – resultando em anticorpos altamente purificados e não danificados. O biopanning ultrassónico permite aos cientistas isolar anticorpos altamente específicos de amostras complexas, abrindo portas a uma vasta gama de aplicações.

Sonicadores para purificação de anticorpos

Os sonicadores Hielscher são ferramentas bem estabelecidas, utilizadas nas melhores instalações de investigação do mundo. Valorizados pelo seu design de ponta e desempenho superior, os sonicadores Hielscher são considerados ferramentas de laboratório indispensáveis nos campos da biotecnologia e da biologia molecular. A Hielscher Ultrasonics oferece sonicadores para amostras individuais, bem como para a preparação de amostras de alto rendimento, que facilitam a purificação eficiente de anticorpos e a eluição de moléculas ligadas ao alvo, e permitem um biopanning eficiente para isolar anticorpos específicos com precisão e rapidez.
No contexto da purificação de anticorpos, os sonicadores Hielscher são excelentes para facilitar os passos de lavagem e eluição, removendo eficazmente os anticorpos não ligados e preservando a integridade dos complexos ligados ao alvo. O seu controlo preciso e escalabilidade permitem condições de processamento personalizadas, assegurando resultados de purificação óptimos numa vasta gama de volumes e complexidades de amostras.
Os sonicadores Hielscher representam a inovação tecnológica no processamento ultrassónico, oferecendo capacidades sem paralelo para a purificação de anticorpos, eluição e biopanning. Com a sua precisão, fiabilidade e facilidade de operação, os vários sistemas de ultra-sons oferecem uma eficiência e versatilidade óptimas para a investigação, diagnóstico e terapia biofarmacêutica.
Contacte-nos agora para saber mais sobre os sonicadores Hielscher para purificação de anticorpos, eluição e biopanning! A nossa equipa técnica experiente tem todo o prazer em discutir a sua aplicação relacionada com anticorpos!

Conceção, fabrico e consultoria – Qualidade fabricada na Alemanha

Os ultrassons Hielscher são conhecidos pelos seus elevados padrões de qualidade e design. A robustez e a facilidade de operação permitem a integração harmoniosa dos nossos ultrassons nas instalações industriais. As condições difíceis e os ambientes exigentes são facilmente controlados pelos ultrassons Hielscher.

A Hielscher Ultrasonics é uma empresa certificada pela ISO e dá especial ênfase aos ultrassons de alto desempenho com tecnologia de ponta e facilidade de utilização. Naturalmente, os ultrassons da Hielscher estão em conformidade com a CE e cumprem os requisitos da UL, CSA e RoHs.

Comparação da eluição ultra-sónica com as técnicas de eluição tradicionais

1. Eluição em gradiente: Na eluição em gradiente, a força de ligação entre a proteína alvo e a matriz de afinidade é gradualmente reduzida através da alteração da composição do tampão de eluição. Isto pode envolver a alteração de factores como o pH, a concentração de sais ou a concentração de ligandos concorrentes. A eluição em gradiente permite o ajuste fino das condições de eluição para libertar seletivamente a proteína alvo, minimizando a ligação não específica.
   Vantagens da eluição por ultra-sons: A eluição ultra-sónica proporciona uma libertação mais rápida e uniforme das proteínas ligadas em comparação com a eluição em gradiente. Embora a eluição em gradiente exija uma otimização e monitorização cuidadosas das condições de eluição, a eluição ultra-sónica proporciona um método mais simples e mais eficiente para a recuperação de proteínas.
2. Eluição competitiva: Na eluição competitiva, é introduzida uma concentração elevada de um ligando concorrente no tampão de eluição para perturbar a ligação entre a proteína alvo e a matriz de afinidade. O ligando concorrente compete com a proteína alvo pelos locais de ligação na matriz, deslocando assim a proteína e libertando-a no eluato.
   Vantagens da eluição por ultra-sons: A eluição ultra-sónica oferece uma alternativa mais suave e versátil à eluição competitiva. A eluição competitiva pode exigir a utilização de concentrações elevadas de agentes caotrópicos (ou seja, um co-soluto que perturba a rede de ligações de hidrogénio entre as moléculas de água e reduz a estabilidade do estado nativo das proteínas, enfraquecendo o efeito hidrofóbico) ou de produtos químicos agressivos, que podem afetar a estabilidade e a atividade das proteínas. Em contrapartida, a eluição ultra-sónica proporciona uma rutura mecânica sem a necessidade de agentes químicos adicionais, preservando a integridade das proteínas e assegurando taxas de recuperação elevadas.
3. Eluição induzida pela temperatura: A eluição induzida pela temperatura envolve a alteração da temperatura do tampão de eluição para perturbar a ligação entre a proteína-alvo e a matriz de afinidade. Isto pode ser conseguido aumentando ou diminuindo a temperatura, dependendo da interação específica proteína-matriz.
   Vantagens da eluição por ultra-sons: A eluição ultra-sónica oferece um método mais rápido e controlado para a eluição de proteínas em comparação com os métodos induzidos pela temperatura. Enquanto a eluição induzida pela temperatura pode exigir um controlo preciso dos gradientes de temperatura e tempos de equilíbrio mais longos, a eluição ultra-sónica proporciona uma rutura mecânica imediata, resultando em tempos de eluição mais curtos e numa maior eficiência.
4. Eluição enzimática: A eluição enzimática utiliza enzimas específicas que clivam as ligações entre a proteína alvo e a matriz de afinidade, libertando a proteína no eluato. Este método é particularmente útil para as proteínas que estão fortemente ligadas à matriz ou para aplicações que requerem um controlo preciso das condições de eluição.
   Vantagens da eluição por ultra-sons: A eluição ultra-sónica oferece uma alternativa não enzimática e sem químicos à eluição enzimática. Enquanto a eluição enzimática pode exigir a otimização da concentração de enzimas, do tempo de incubação e das condições de pH, a eluição ultra-sónica proporciona um método simples e universalmente aplicável para a recuperação de proteínas sem necessidade de reagentes adicionais ou de equipamento especializado.