Preparação ultrassónica de amostras assistida por filtração (FASP): melhoria dos fluxos de trabalho de proteómica com sonicação avançada
A preparação ultrassónica de amostras assistida por filtração (FASP) está a emergir como um método altamente eficiente e reprodutível na proteómica moderna. Ao integrar sonicação controlada nos fluxos de trabalho de FASP estabelecidos, os investigadores podem melhorar significativamente a extração de proteínas, a eficiência da digestão e a qualidade global dos dados. Com a crescente procura de preparação de amostras com elevada capacidade de processamento e reprodutibilidade, os sonicadores de sonicação focalizada, como o sonicador de microplacas UIP400MTP, estão a ganhar relevância científica e prática.
Contexto científico: por que razão a FASP é importante na proteómica
A preparação de amostras assistida por filtração (FASP) tornou-se um método de referência na proteómica bottom-up devido à sua capacidade de remover detergentes, sais e outros contaminantes, permitindo simultaneamente uma digestão enzimática eficiente. Contudo, os protocolos clássicos de FASP enfrentam frequentemente limitações relacionadas com lise incompleta, digestão inconsistente e variabilidade das amostras – especialmente quando se trata de células ou tecidos biológicos complexos ou resistentes.
É aqui que a energia ultrassónica focalizada (sonicação) proporciona uma vantagem decisiva. Ao introduzir forças mecânicas de cisalhamento e cavitação, a sonicação melhora várias etapas críticas do fluxo de trabalho de FASP sem comprometer a integridade das proteínas.
Sonicador de placas multipoços UIP400MTP facilita a preparação de amostras assistida por filtração (FASP)
Os efeitos positivos da sonicação na FASP ultrassónica
A sonicação introduz cavitação acústica controlada – formação e colapso de bolhas microscópicas – que gera forças localizadas de cisalhamento e microcorrentes.
A sonicação melhora tanto a etapa de alquilação como a de digestão na FASP ultrassónica, melhorando a transferência de massa e acelerando a cinética das reações. A aplicação de energia ultrassónica gera cavitação, originando microcorrentes localizadas e forças transitórias de cisalhamento que promovem uma mistura rápida e uma penetração eficiente dos reagentes na matriz proteica ou no ambiente do filtro. Durante a alquilação, isto resulta numa modificação mais uniforme e rápida dos resíduos de cisteína pela iodoacetamida. Na etapa de digestão, a sonicação aumenta a acessibilidade dos locais de clivagem proteolítica e melhora as interações enzima–substrato, acelerando assim a atividade da tripsina e aumentando a eficiência da digestão. Globalmente, o tratamento ultrassónico reduz o tempo de processamento, mantendo ou melhorando o grau de conclusão das reações e a reprodutibilidade.
Na preparação de amostras para proteómica, a FASP ultrassónica traduz-se em:
- Rutura celular e extração de proteínas mais eficientes, mesmo em tecidos resistentes ou amostras microbianas
- Melhor solubilização das proteínas
- Melhor acessibilidade das enzimas durante a digestão
- Redução do tempo de processamento e aumento da reprodutibilidade
Ao contrário dos métodos convencionais de lise mecânica ou química, o processamento ultrassónico é altamente controlável e escalável, o que o torna particularmente adequado para fluxos de trabalho de proteómica normalizados.
Vantagens da FASP ultrassónica face às abordagens convencionais
A integração da sonicação nos protocolos de FASP proporciona benefícios mensuráveis que afetam diretamente os resultados da espectrometria de massa a jusante.
A FASP ultrassónica permite uma recuperação mais completa das proteínas, particularmente a partir de amostras difíceis, como tecidos fibrosos ou biofilmes. A distribuição uniforme da energia assegura um tratamento consistente entre réplicas, reduzindo a variabilidade – um requisito essencial para a proteómica quantitativa.
Além disso, a sonicação acelera a cinética da digestão ao melhorar a interação enzima–substrato. Isto resulta frequentemente em tempos de digestão mais curtos e num maior rendimento de péptidos, mantendo a cobertura da sequência.
Do ponto de vista do fluxo de trabalho, os sistemas ultrassónicos reduzem a intervenção manual e eliminam a necessidade de tratamentos químicos agressivos, preservando a integridade das amostras e simplificando a normalização dos protocolos.
Diagrama de Venn que mostra o aumento do número de proteínas identificadas pela FASP ultrassónica em comparação com a FASP realizada durante a noite
Imagem e estudo: ©Carvalho et al., 2020
Sonicador de placas multipoços UIP400MTP para preparação de amostras assistida por filtração (FASP)
Protocolo: FASP ultrassónica com elevada capacidade de processamento com o UIP400MTP
Para laboratórios que processam grandes conjuntos de amostras, o sonicador de microplacas UIP400MTP permite a sonicação simultânea de placas multipoços padrão (por exemplo, placas de 96 poços), aumentando significativamente a capacidade de processamento de amostras e a reprodutibilidade.
Neste formato, as amostras (normalmente 50–200 µL por poço) são preparadas diretamente em microplacas compatíveis com ultrafiltração ou processamento a jusante. Os tampões de lise são semelhantes aos utilizados nos protocolos padrão de FASP.
O UIP400MTP aplica energia ultrassónica uniforme em todos os poços. A sonicação é normalmente realizada com uma amplitude de 60–80% durante 2–4 minutos, dependendo do tipo de amostra. Monitorize a temperatura com o sensor de temperatura conectável. Utilize sonicação pulsada e, opcionalmente, um refrigerador de laboratório.
Exemplo de protocolo:
- Na etapa de alquilação, as amostras são sonicadas com o sonicador de microplacas (UIP400MTP) com uma amplitude de 40% durante 7 ciclos (30 s LIGADO, 15 s DESLIGADO; tempo total de sonicação: 5 min 45 s).
- Após a sonicação, a solução de iodoacetamida (IAA) é removida por centrifugação. Antes da digestão com tripsina, as amostras devem ser lavadas para remover a ureia residual, um agente caotrópico forte que inibe a atividade enzimática. Por isso, as amostras são lavadas duas vezes com 200 μL de bicarbonato de amónio (AmBic) a 25 mM.
- Em seguida, adicionam-se 100 μL de solução de tripsina (relação enzima/proteína de 1:30) preparada em bicarbonato de amónio a 12,5 mM. A digestão das proteínas é então realizada com o UIP400MTP nas mesmas condições de sonicação (amplitude de 40%, 7 ciclos, 30 s LIGADO / 15 s DESLIGADO; tempo total: 5 min 45 s).
- Após a sonicação, as amostras são transferidas para placas de filtração ou processadas com sistemas de FASP baseados em placas. As etapas de redução e alquilação são realizadas na placa, mantendo um fluxo de trabalho simplificado.
- A digestão com tripsina é realizada em condições controladas (por exemplo, 37°C, 4–16 horas), com a opção de uma breve estimulação ultrassónica para acelerar a atividade enzimática e melhorar o rendimento de péptidos.
- Os péptidos são recuperados por centrifugação e ficam prontos para análise por LC-MS/MS.
A principal vantagem deste sistema reside na sua capacidade de proporcionar condições de processamento idênticas em todos os poços, minimizando os efeitos de lote e permitindo comparações quantitativas robustas em estudos de proteómica de grande escala.
O sonicador multitubos VialTweeter acelera e melhora a preparação de amostras assistida por filtração (FASP) em proteómica
Relevância científica
A integração da sonicação nos fluxos de trabalho de FASP não é apenas um aperfeiçoamento técnico – representa um avanço metodológico na preparação de amostras para proteómica. À medida que esta área evolui para uma maior capacidade de processamento de amostras, automatização e reprodutibilidade, as tecnologias ultrassónicas permitem superar estrangulamentos fundamentais no processamento de amostras.
Estudos recentes salientam cada vez mais a importância de uma preparação de amostras consistente para uma descoberta fiável de biomarcadores e para a proteómica quantitativa. A FASP ultrassónica contribui diretamente para este objetivo ao melhorar a eficiência da extração, a consistência da digestão e a robustez global do fluxo de trabalho.
Além disso, a escalabilidade dos sistemas ultrassónicos – desde frascos individuais com o VialTweeter até microplacas completas com o UIP400MTP – acompanha a crescente procura de estudos de proteómica tanto exploratórios como com grandes coortes.
Adquira um sonicador para facilitar o seu fluxo de trabalho de FASP!
A preparação ultrassónica de amostras assistida por filtração combina os pontos fortes comprovados da FASP com as vantagens físicas da sonicação. Ao melhorar a lise e a digestão e ao normalizar os fluxos de trabalho, os sistemas ultrassónicos oferecem uma solução poderosa para a proteómica moderna.
O sonicador multitubos VialTweeter e o sonicador de microplacas UIP400MTP exemplificam como a energia ultrassónica focalizada pode transformar a preparação de rotina de amostras num processo mais eficiente, reprodutível e cientificamente robusto – conduzindo, em última análise, a dados proteómicos de maior qualidade e a uma compreensão biológica mais aprofundada.
Escolha o sonicador mais adequado para a sua preparação de amostras assistida por filtração
| Modelo de sonicador | Benefícios para a FASP | Utilização mais adequada |
| Sonicador de microplacas UIP400MTP | Sonicação uniforme em microplacas inteiras; fornecimento de energia altamente reprodutível; acelera a alquilação e a digestão enzimática em fluxos de trabalho com elevada capacidade de processamento de amostras; compatível com a preparação automatizada de amostras. | Fluxos de trabalho de FASP com elevada capacidade de processamento de amostras em placas de 96 poços ou formatos semelhantes, incluindo aplicações de rastreio em proteómica. |
| Sonicador multitubos VialTweeter | Sonicação simultânea e uniforme de vários tubos fechados; minimiza a contaminação cruzada e a perda de amostras; melhora a penetração e a mistura dos reagentes, aumentando a eficiência da alquilação e da digestão. | Processamento paralelo de várias amostras de FASP com capacidade de processamento moderada e elevada reprodutibilidade. |
| CupHorn (sonicação indireta em “banho de alta intensidade” para tubos selados) | Sonicação indireta de alta intensidade para recipientes selados; excelente controlo da temperatura e processamento sem contaminação; promove uma transferência de massa eficiente sem contacto direto com a sonda. | Processamento de amostras em vários recipientes de amostras / amostras sensíveis ou perigosas que exigem recipientes fechados e uma distribuição consistente da energia. |
| Sonicadores de laboratório do tipo sonda (sonicação direta) | Intensidade ultrassónica e transferência de energia máximas; rutura rápida e aceleração das reações; eficaz para amostras proteicas difíceis de digerir ou altamente complexas. | Processamento de uma única amostra, amostras maiores ou matrizes difíceis em que são necessárias potência e velocidade máximas. |
Conceção, fabrico e consultoria – qualidade fabricada na Alemanha
Os sonicadores Hielscher são bem conhecidos pelos seus padrões de qualidade e conceção do mais elevado nível. A robustez e a facilidade de utilização permitem a integração harmoniosa dos nossos sonicadores em instalações industriais. Os sonicadores Hielscher lidam facilmente com condições adversas e ambientes exigentes.
A Hielscher Ultrasonics é uma empresa com certificação ISO e dá especial ênfase a sonicadores de alto desempenho com tecnologia de ponta e facilidade de utilização. Naturalmente, os sonicadores Hielscher cumprem os requisitos CE e satisfazem os requisitos de UL, CSA e RoHs.
Perguntas frequentes
Para que é utilizada a preparação de amostras assistida por filtração?
A preparação de amostras assistida por filtração (FASP) é utilizada para preparar amostras proteicas para análise proteómica baseada em espectrometria de massa. Permite a remoção eficiente de detergentes, sais e outros contaminantes de baixa massa molecular, retendo as proteínas num filtro com um limiar de corte de massa molecular, onde podem ser desnaturadas, reduzidas, alquiladas e digeridas enzimaticamente em péptidos adequados para análise por LC–MS/MS.
Quais são as vantagens da FASP em proteómica?
As principais vantagens da FASP em proteómica são a sua capacidade de processar amostras complexas e ricas em detergentes, produzindo simultaneamente misturas de péptidos com um elevado grau de limpeza e compatíveis com espectrometria de massa. Melhora a eficiência e a reprodutibilidade da digestão ao realizar as reações no ambiente confinado de um filtro, reduz a perda de amostras em comparação com métodos baseados em precipitação e permite uma troca eficaz de tampão. Globalmente, a FASP melhora a recuperação de péptidos, a qualidade dos dados e a cobertura do proteoma, tornando-se um fluxo de trabalho robusto e amplamente adotado na proteómica bottom-up.
Bibliografia / Referências
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FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
- Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
- Walter, J., Monthoux, C., Fortes, C. et al. (2020): The bovine cumulus proteome is influenced by maturation condition and maturational competence of the oocyte. Scientific Reports 10, 9880 (2020).
O sonicador sem contacto UIP400MTP facilita a FASP em placas de 96 poços
A Hielscher Ultrasonics fabrica homogeneizadores ultrassónicos de alto desempenho desde a escala laboratorial até à escala industrial.