Fluxos de trabalho proteómicos com digestão de proteínas de elevado rendimento

A proteómica é um domínio essencial para a compreensão dos processos e sistemas biológicos, sendo a digestão das proteínas um passo fundamental nos seus fluxos de trabalho. Tradicionalmente, a digestão de proteínas é efectuada em solução utilizando enzimas proteolíticas como a tripsina, que hidrolisa especificamente ligações peptídicas em resíduos de lisina e arginina. Este processo gera péptidos adequados para ionização e fragmentação em aplicações de espetrometria de massa (MS). Contudo, os métodos de digestão convencionais requerem 12-24 horas para serem concluídos, criando estrangulamentos significativos nos fluxos de trabalho proteómicos.
A ultrassonografia oferece uma alternativa poderosa, reduzindo drasticamente os tempos de digestão de horas para apenas alguns minutos. Quando combinada com sonicadores avançados de várias amostras, como o Hielscher CupHorn, o VialTweeter e o sonicador de placas de 96 poços UIP400MTP, a ultrassonografia permite uma proteómica acelerada e de elevado rendimento. Estas tecnologias simplificam os fluxos de trabalho, reduzindo o tempo de preparação das amostras e aumentando a eficiência sem comprometer a reprodutibilidade ou a qualidade dos dados.

O papel da energia ultra-sônica na digestão de proteínas

A ultrassonografia emprega ondas de ultrassom focalizadas para criar microbolhas localizadas por cavitação que colapsam para gerar forças de cisalhamento intensas. Este fenómeno aumenta a transferência de massa, promove a mistura de enzimas com substratos e desdobra as estruturas proteicas, expondo os locais de clivagem a enzimas proteolíticas como a tripsina.
O resultado? Uma redução significativa do tempo de digestão sem comprometer a eficiência ou a reprodutibilidade.

Digestão proteolítica reforçada por ultra-sons: Metodologia e Resultados

Protocolo de digestão acelerada

A digestão assistida por ultra-sons combina enzimas proteolíticas e energia ultra-sónica para acelerar os fluxos de trabalho. Por exemplo, utilizando o Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz), o fluxo de trabalho de digestão procede da seguinte forma:

1. Redução: As amostras de proteínas (0,5 mg/mL, 20 µL) são tratadas com DTT (2 µL, 110 mM) em tampão de bicarbonato de amónio (12,5 mM). A sonicação é aplicada a 50% de amplitude durante 5 minutos.
2. Alquilação: Após a adição de IAA (2 µL, 400 mM), a sonicação é repetida nas mesmas condições.
3. Digestão: As amostras são diluídas e incubadas com nanopartículas de tripsina imobilizadas. Uma ronda final de sonicação (5 minutos) completa a digestão. Os péptidos são separados, secos e armazenados para análise MS.

Este método ultrassónico reduz o tempo total de preparação de 12 horas para menos de 30 minutos. Apesar do processo acelerado, o rendimento e a qualidade dos péptidos permanecem consistentes com os métodos tradicionais da noite para o dia.

Eficiência da digestão ultra-sónica de proteínas

Em estudos comparativos utilizando proteomas de E. coli:

• Identificação da proteína: As amostras digeridas por ultra-sons identificaram 777 proteínas em 5 minutos, em comparação com 817 em 12 horas. As identificações de proteínas partilhadas excederam os 70%.
• Reprodutibilidade: As análises em duplicado revelaram valores de correlação superiores a 98% em cada método, demonstrando fiabilidade.
• Seletividade: Certas proteínas foram preferencialmente digeridas por cada método, com a digestão ultra-sónica a favorecer 65 proteínas e a digestão durante a noite 54 proteínas. Tais diferenças matizadas sublinham o potencial único de ultra-sons para aplicações específicas.

Resultados da quantificação de proteínas sem marcador de sete proteínas adicionadas a uma E. coli
amostra. As seguintes proteínas foram adicionadas em dois níveis diferentes, conforme indicado na coluna
designado por "rácio Theo". O rácio Theo é o rácio teórico entre os dois níveis utilizados neste
experiência. Albumina de soro bovino (ALBU), β-lactoglobulina (LACB), α-S1 caseína (CASA1),
α-S2 caseína (CASA2), citocromo c (CYC), ovalbumina (OVAL) e anidrase carbónica 2
(CAH2). Os rácios foram calculados utilizando as intensidades das proteínas LFQ obtidas a partir de MaxQuant
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
Estudo e gráfico: © Martins et al., 2019)

Tripsina imobilizada em nanopartículas

A integração de nanopartículas de tripsina imobilizadas (por exemplo, T-FMNPs) com ultra-sons melhora ainda mais os fluxos de trabalho proteómicos. Estas nanopartículas proporcionam uma elevada área de superfície para interações enzima-substrato, aumentando a eficiência. Quando aplicado a proteomas complexos, como o de E. coli, o método combinado alcança:

• Velocidade: Digestão completa em 5 minutos.
• Exatidão: Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• Escalabilidade: A adaptação a plataformas com vários poços, como a UIP400MTP, permite um processamento de elevado rendimento.

Clique aqui para obter o protocolo pormenorizado com instruções passo a passo!
(cf. Martins et al., 2019)

Digestão proteolítica a alta velocidade e de alto rendimento com sonicadores Hielscher

Os melhores modelos de Sonicator para proteómica

A Hielscher Ultrasonics oferece vários modelos de sonicadores para a preparação simultânea de várias amostras, facilitando os fluxos de trabalho de alto rendimento. Quer trabalhe com frascos, tubos de ensaio, placas de poços múltiplos (por exemplo, placas de 6, 24, 96 poços) ou placas de Petri – oferecemos-lhe os sonicadores ideais para as suas experiências.

Sonicador de placas com vários poços UIP400MTP

Para um rendimento máximo, o UIP400MTP oferece a capacidade de processar placas de 96 poços por ultra-sons. Compatível com qualquer microplaca padrão, o UIP400MTP não necessita de descartáveis proprietários dispendiosos e dá-lhe a liberdade de escolher a melhor placa multipoços para a sua investigação. Ao fornecer energia uniforme em toda a placa, permite a rápida redução, alquilação e digestão de até 200 proteomas complexos em apenas 1 hora. Este nível de automação e eficiência é crucial para proteómica de alto rendimento e aplicações clínicas. Saiba mais sobre o sonicador de placas multipoços!

VialTweeter

O VialTweeter foi concebido para laboratórios que requerem a sonicação simultânea de até 10 frascos ou tubos de ensaio. A sua abordagem não invasiva elimina os riscos de contaminação cruzada, assegurando simultaneamente uma digestão de proteínas reprodutível. Este dispositivo é ideal para investigadores que trabalham com volumes de amostras limitados ou diversos tipos de amostras.
Saiba mais sobre o sonicador multitubos VialTweeter!

Hielscher UP200St-CupHorn

O sonicador CupHorn é um dispositivo potente concebido para o processamento simultâneo de várias amostras em recipientes selados. Garante uma distribuição uniforme da energia ultra-sónica e um controlo preciso da temperatura. A capacidade de processar até cinco amostras em simultâneo, associada à sua compatibilidade com fluxos de trabalho reduzidos, alquilados e digeridos, faz do CupHorn uma ferramenta fiável para a proteómica baseada em MS.
Saiba mais sobre o CupHorn SonoReactor!

Protocolo passo-a-passo para a digestão proteolítica assistida por ultrassom usando tripsina imobilizada por nanopartículas

Este protocolo de Martins et al. (2019) é otimizado para a digestão rápida de proteínas usando energia ultrassônica e tripsina imobilizada por nanopartículas (T-FMNPs). As etapas delineadas garantem redução eficiente, alquilação e proteólise adequadas para aplicações de espetrometria de massa (MS).
Etapas do protocolo

1. Redução de ligações de dissulfureto
   • Adicionar 2 µL de solução de DTT (110 mM) a 20 µL de amostra de proteína (0,5 mg/mL) em tampão AmBic.
   • Colocar o tubo de amostra no sonoreactor UP200St-CupHorn.
   • Sonicar a amostra durante 2,5 minutos a 50% de amplitude (200 W, 26 kHz).
   • Pausa durante um breve intervalo para permitir o arrefecimento e, em seguida, sonicar durante mais 2,5 minutos nas mesmas condições.
2. Alquilação de resíduos de cisteína reduzidos
   • Adicionar 2 µL de solução de IAA (400 mM) à amostra de proteína reduzida.
   • Sonicar durante 2,5 minutos a 50% de amplitude para facilitar a alquilação.
   • Pausa para arrefecimento e, em seguida, sonicar durante mais 2,5 minutos.

   Nota: Minimizar a exposição da amostra alquilada à luz para evitar a degradação dos AIA.

3. Diluição da amostra
   • Diluir a amostra de proteína alquilada para um volume final de 100 µL utilizando tampão AmBic 25 mM contendo 4% de acetonitrilo (v/v).
   • Misturar bem por pipetagem suave.
4. Digestão proteolítica com tripsina imobilizada em nanopartículas
   • Adicionar 20 µL de solução de T-FMNP (3 mg/mL) à amostra de proteína diluída.
   • Sonicar a mistura no sonoreactor durante 2,5 minutos a 50% de amplitude.
   • Pausa para arrefecimento, depois sonicar durante mais 2,5 minutos nas mesmas condições.
5. Separação de nanopartículas de tripsina
   • Utilizar um íman para separar as T-FMNPs do sobrenadante que contém os péptidos digeridos.
   • Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifugação.
6. Preparação de péptidos para análise MS
   • Secar o sobrenadante que contém os péptidos numa centrifugadora a vácuo.
   • Armazenar os péptidos secos a -20°C até à análise posterior por espetrometria de massa.