Fluxos de trabalho de proteómica com digestão de proteínas de elevada capacidade de processamento

A proteómica é uma área essencial para compreender os processos e sistemas biológicos, sendo a digestão de proteínas uma etapa crítica dos seus fluxos de trabalho. Tradicionalmente, a digestão de proteínas é realizada em solução com enzimas proteolíticas como a tripsina, que hidrolisa especificamente as ligações peptídicas nos resíduos de lisina e arginina. Este processo gera péptidos bem adequados à ionização e à fragmentação em aplicações de espectrometria de massa (MS). No entanto, os métodos de digestão convencionais requerem 12–24 horas para ficarem concluídos, criando estrangulamentos significativos nos fluxos de trabalho de proteómica.
A ultrassonicação oferece uma alternativa potente, reduzindo drasticamente os tempos de digestão de horas para apenas alguns minutos. Quando combinada com sonicadores avançados para múltiplas amostras, como o Hielscher CupHorn, o VialTweeter e o sonicador para placas de 96 poços UIP400MTP, a ultrassonicação permite uma proteómica acelerada e com elevada capacidade de processamento. Estas tecnologias agilizam os fluxos de trabalho, reduzindo o tempo de preparação das amostras e aumentando a eficiência sem comprometer a reprodutibilidade ou a qualidade dos dados.

O papel da energia ultrassónica na digestão de proteínas

A ultrassonicação utiliza ondas de ultrassons focadas para criar cavitação – microbolhas localizadas que colapsam, gerando forças de cisalhamento intensas. Este fenómeno melhora a transferência de massa, promove a mistura das enzimas com os substratos e desenrola as estruturas das proteínas, expondo os locais de clivagem a enzimas proteolíticas como a tripsina.
O resultado? Uma redução significativa do tempo de digestão sem comprometer a eficiência ou a reprodutibilidade.

Digestão proteolítica melhorada por ultrassons: metodologia e resultados

Protocolo de digestão acelerada

A digestão assistida por ultrassons combina enzimas proteolíticas e energia ultrassónica para acelerar os fluxos de trabalho. Por exemplo, com o Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz), o fluxo de trabalho de digestão decorre da seguinte forma:

1. Redução: As amostras de proteínas (0,5 mg/mL, 20 µL) são tratadas com DTT (2 µL, 110 mM) em tampão de bicarbonato de amónio (12,5 mM). Aplica-se sonicação a 50% de amplitude durante 5 minutos.
2. Alquilação: Após a adição de IAA (2 µL, 400 mM), repete-se a sonicação nas mesmas condições.
3. Digestão: As amostras são diluídas e incubadas com nanopartículas que contêm tripsina imobilizada. Uma ronda final de sonicação (5 minutos) completa a digestão. Os péptidos são separados, secos e armazenados para análise por MS.

Este método ultrassónico reduz o tempo total de preparação de 12 horas para menos de 30 minutos. Apesar da aceleração do processo, o rendimento e a qualidade dos péptidos mantêm-se consistentes com os dos métodos tradicionais de digestão durante a noite.

Eficiência da digestão ultrassónica de proteínas

Em estudos comparativos com proteomas de E. coli:

• Identificação de proteínas: As amostras digeridas por ultrassons permitiram identificar 777 proteínas em 5 minutos, em comparação com 817 em 12 horas. As identificações de proteínas comuns às duas abordagens excederam 70%.
• Reprodutibilidade: As análises de réplicas mostraram valores de correlação superiores a 98% dentro de cada método, demonstrando fiabilidade.
• Seletividade: Determinadas proteínas foram preferencialmente digeridas por cada método, favorecendo a digestão ultrassónica 65 proteínas e a digestão durante a noite 54 proteínas. Estas diferenças subtis realçam o potencial único da ultrassonicação para aplicações específicas.

Resultados da quantificação de proteínas sem marcação de sete proteínas adicionadas a uma amostra de E. coli
. As seguintes proteínas foram adicionadas em dois níveis diferentes, conforme indicado na coluna
denominada “Theo Ratio”. Theo Ratio é a razão teórica entre os dois níveis utilizados nesta
experiência. Albumina sérica bovina (ALBU), β-lactoglobulina (LACB), caseína α-S1 (CASA1),
caseína α-S2 (CASA2), citocromo c (CYC), ovalbumina (OVAL) e anidrase carbónica 2
(CAH2). As razões foram calculadas utilizando as intensidades de proteínas LFQ obtidas na análise com o MaxQuant
. Aplicou-se o teste t de Student para comparar os valores obtidos com cada método (p>0,01, n=3, t-teórico=4,6).
Estudo e gráfico: © Martins et al., 2019)

Tripsina imobilizada em nanopartículas

A integração de nanopartículas que contêm tripsina imobilizada (por exemplo, T-FMNPs) com a ultrassonicação melhora ainda mais os fluxos de trabalho de proteómica. Estas nanopartículas proporcionam uma elevada área superficial para as interações entre enzima e substrato, aumentando a eficiência. Quando aplicado a proteomas complexos, como o de E. coli, o método combinado permite alcançar:

• Rapidez: Digestão completa em 5 minutos.
• Exatidão: Quantificação de proteínas comparável à dos métodos tradicionais (p > 0,01, n=3).
• Escalabilidade: A adaptação a plataformas de múltiplos poços, como o UIP400MTP, permite um processamento de elevada capacidade.

Clique aqui para consultar o protocolo detalhado com instruções passo a passo!
(cf. Martins et al., 2019)

Digestão proteolítica a alta velocidade e com elevada capacidade de processamento com sonicadores Hielscher

Os melhores modelos de sonicadores para proteómica

A Hielscher Ultrasonics oferece vários modelos de sonicadores para a preparação simultânea de múltiplas amostras, facilitando fluxos de trabalho com elevada capacidade de processamento. Quer trabalhe com frascos, tubos de ensaio, placas de múltiplos poços (por exemplo, placas de 6, 24 ou 96 poços) ou placas de Petri – oferecemos os sonicadores ideais para as suas experiências.

Sonicador para placas de múltiplos poços UIP400MTP

Para a máxima capacidade de processamento, o UIP400MTP permite processar placas de 96 poços por ultrassons. Compatível com qualquer microplaca padrão, o UIP400MTP não requer consumíveis descartáveis exclusivos dispendiosos e dá-lhe a liberdade de escolher a melhor placa de múltiplos poços para a sua investigação. Ao fornecer energia uniforme em toda a placa, permite a redução, a alquilação e a digestão rápidas de até 200 proteomas complexos em apenas 1 hora. Este nível de automatização e eficiência é crucial para a proteómica de elevada capacidade de processamento e para aplicações clínicas. Saiba mais sobre o sonicador para placas de múltiplos poços!

VialTweeter

O VialTweeter foi concebido para laboratórios que necessitam de sonicar simultaneamente até 10 frascos ou tubos de ensaio. A sua abordagem não invasiva elimina os riscos de contaminação cruzada, garantindo ao mesmo tempo uma digestão de proteínas reprodutível. Este dispositivo é ideal para investigadores que trabalham com volumes de amostra limitados ou com diversos tipos de amostras.
Saiba mais sobre o sonicador para múltiplos tubos VialTweeter!

Hielscher UP200St-CupHorn

O sonicador CupHorn é um dispositivo potente concebido para o processamento simultâneo de múltiplas amostras em recipientes selados. Garante uma distribuição uniforme da energia ultrassónica e um controlo preciso da temperatura. A capacidade de processar até cinco amostras simultaneamente, aliada à sua compatibilidade com fluxos de trabalho que incluem redução, alquilação e digestão, torna o CupHorn uma ferramenta fiável para a proteómica baseada em MS.
Saiba mais sobre o CupHorn SonoReactor!

Protocolo passo a passo para digestão proteolítica assistida por ultrassonicação com tripsina imobilizada em nanopartículas

Este protocolo de Martins et al. (2019) está otimizado para a digestão rápida de proteínas com energia ultrassónica e tripsina imobilizada em nanopartículas (T-FMNPs). As etapas descritas garantem uma redução, uma alquilação e uma proteólise eficientes, adequadas a aplicações de espectrometria de massa (MS).
Etapas do protocolo

1. Redução das ligações dissulfureto
   • Adicione 2 µL de solução de DTT (110 mM) à amostra de proteínas de 20 µL (0,5 mg/mL) em tampão AmBic.
   • Coloque o tubo da amostra no sonorreator UP200St-CupHorn.
   • Sonique a amostra durante 2,5 minutos a 50% de amplitude (200 W, 26 kHz).
   • Faça uma breve pausa para permitir o arrefecimento e, em seguida, sonique durante mais 2,5 minutos nas mesmas condições.
2. Alquilação dos resíduos de cisteína reduzidos
   • Adicione 2 µL de solução de IAA (400 mM) à amostra de proteínas reduzida.
   • Sonique durante 2,5 minutos a 50% de amplitude para facilitar a alquilação.
   • Faça uma pausa para arrefecimento e, em seguida, sonique durante mais 2,5 minutos.

   Nota: Minimize a exposição da amostra alquilada à luz para evitar a degradação do IAA.

3. Diluição da amostra
   • Dilua a amostra de proteínas alquilada até um volume final de 100 µL com tampão AmBic de 25 mM contendo 4% de acetonitrilo (v/v).
   • Misture bem por pipetagem suave.
4. Digestão proteolítica com tripsina imobilizada em nanopartículas
   • Adicione 20 µL de solução de T-FMNP (3 mg/mL) à amostra de proteínas diluída.
   • Sonique a mistura no sonorreator durante 2,5 minutos a 50% de amplitude.
   • Faça uma pausa para arrefecimento e, em seguida, sonique durante mais 2,5 minutos nas mesmas condições.
5. Separação das nanopartículas que contêm tripsina
   • Utilize um íman para separar as T-FMNPs do sobrenadante que contém os péptidos digeridos.
   • Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga.
6. Preparação dos péptidos para análise por MS
   • Seque o sobrenadante que contém os péptidos numa centrífuga de vácuo.
   • Armazene os péptidos secos a -20°C até à análise posterior por espectrometria de massa.