Ultradźwiękowa dezagregacja komórek w próbkach bakteryjnych
Próbki bakteryjne rzadko trafiają do laboratorium jako rzeczywiste zawiesiny pojedynczych komórek. Hodowle rosną w łańcuchach i kłaczkach, izolaty środowiskowe tworzą agregaty związane zewnątrzkomórkowymi substancjami polimerowymi, a osady uzyskane przez wirowanie często trudno ponownie zawiesić mimo dokładnego mieszania na worteksie. Oznaczanie liczby żywych komórek, gęstości optycznej, cytometria przepływowa i profilowanie mikrobiomu zakładają, że jedna cząstka odpowiada jednej komórce. Ultradźwiękowa dezagregacja komórek rozwiązuje tę sprzeczność: krótkie, kontrolowane impulsy sonikacji rozdzielają agregaty na pojedyncze komórki bez powodowania ich lizy.
Dlaczego agregacja komórek zniekształca wyniki
Agregacja jest cechą biologiczną, a nie błędem przygotowania próbek. Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces i wiele gatunków środowiskowych rośnie w łańcuchach, skupiskach lub fragmentach biofilmu, a zewnątrzkomórkowe DNA i polisacharydy sklejają komórki w osadach i eluatach z wymazów. Konsekwencje analityczne mają charakter systematyczny:
- Liczba kolonii jest zaniżana, ponieważ jedno skupisko tworzy jedną kolonię niezależnie od liczby zawartych w nim komórek.
- Pomiary gęstości optycznej i liczniki cząstek rejestrują agregaty zamiast komórek, zniekształcając krzywe wzrostu.
- Cytometria przepływowa i sortowanie komórek błędnie zliczają zdarzenia odpowiadające skupiskom komórek i wykluczają je z analizy.
- Ekstrakcje DNA i białek reprezentują wyłącznie komórki na powierzchni agregatu, zniekształcając dane dotyczące mikrobiomu i dane omiczne.
Konwencjonalne metody zaradcze są powolne, niepełne lub powodują zmiany chemiczne. Intensywne pipetowanie i mieszanie na worteksie pozostawiają mikroagregaty. Dyspersja enzymatyczna lub z użyciem chelatorów modyfikuje powierzchnię komórek, którą możesz chcieć analizować. Mechaniczna dezagregacja przez kontrolowaną kawitację działa w ciągu kilku sekund i nie wymaga dodatków.
Jeden agregat oznacza jedną kolonię – i jeden błędny wynik. Zobacz, jak ultradźwiękowa dezagregacja pozwala uzyskać rzeczywiste zawiesiny pojedynczych komórek bez lizy, aerozoli ani manipulowania sondą. Poproś o więcej informacji!
Sonikator do wielu probówek VialTweeter do bezkontaktowego przygotowania próbek: rozdzielaj skupiska komórek w szczelnie zamkniętych probówkach
Jak sonikacja rozdziela agregaty komórek bez powodowania ich lizy
Ultradźwiękowa dezagregacja komórek wykorzystuje różnicę w wytrzymałości mechanicznej. Agregaty bakteryjne są utrzymywane przez stosunkowo słabe wiązania międzykomórkowe i macierz zewnątrzkomórkową, podczas gdy nienaruszona osłona komórkowa wytrzymuje znacznie większe ścinanie. Gdy skalibrowane ultradźwięki docierają do zawiesiny, kawitacja akustyczna wytwarza mikroprzepływy, impulsy ciśnienia i siły ścinające, które najpierw działają na granicach agregatów. Skupiska, łańcuchy i fragmenty biofilmu są rozdzielane przez ścinanie (deaglomeracja), zanim zostanie osiągnięty poziom energii powodujący pękanie błon (lizę).
Ultradźwiękowa dezagregacja skupisk komórek bakteryjnych
Dezagregacja czy liza – znaczenie parametrów sonikacji
W praktyce oznacza to, że dezagregację i lizę przeprowadza się za pomocą tego samego urządzenia pracującego przy różnych parametrach. Przy umiarkowanej amplitudzie, krótkich cyklach impulsowych i kontrolowanej temperaturze uzyskuje się zawiesinę pojedynczych, żywych komórek. Zwiększenie amplitudy, czasu ekspozycji lub temperatury próbki przesuwa proces w kierunku całkowitego rozbijania komórek w celu pozyskania składników wewnątrzkomórkowych. Generatory Hielscher umożliwiają precyzyjne ustawianie amplitudy, mocy, impulsów i dostarczanej energii oraz zapisanie metody, dzięki czemu etap dezagregacji jest powtarzalny dla różnych próbek, operatorów i serii.
Wydajna sonikacja bezkontaktowa
Sonikacja w łaźni nie zapewnia takiego poziomu kontroli. Ultradźwiękowe łaźnie i zbiorniki czyszczące dostarczają jedynie niewielką energię ultradźwiękową, co skutkuje niepełnym przygotowaniem próbek, a kawitacja występuje nierównomiernie, więc obróbka każdej probówki zależy od jej położenia w łaźni. VialTweeter przekazuje intensywne, skupione siły ultradźwiękowe bezpośrednio przez ściankę naczynia do nawet 10 szczelnie zamkniętych próbek jednocześnie. Obróbka wymagająca długiej ekspozycji o zmiennym czasie w łaźni jest realizowana według znormalizowanego schematu impulsów.
Bezkontaktowe sonikatory Hielscher przekazują intensywne, skupione ultradźwięki przez ścianki zamkniętych fiolek. VialTweeter przetwarza jednocześnie do 10 fiolek z identycznym natężeniem, bez sondy w próbce, bez zanieczyszczenia krzyżowego i bez uwalniania aerozoli. Gdy wymaga tego wydajność przetwarzania próbek, sonikatory do mikropłytek UIP400MTP i UIP550MTP zapewniają ten sam kontrolowany transfer energii do płytek wielodołkowych.
VialTweeter poddaje sonikacji jednocześnie do 10 mniejszych fiolek i do 5 większych probówek.
Zalety bezkontaktowej dezagregacji ultradźwiękowej
- Brak zanieczyszczenia krzyżowego: Ponieważ fiolki pozostają przez cały czas zamknięte, a żadna sonda nie jest zanurzana w próbce, całkowicie unika się zanieczyszczenia krzyżowego i utraty próbki. Między próbkami nie trzeba niczego sterylizować, a jedna seria nie może wpływać na kolejną.
- Ochrona przed aerozolami: Sonikacja sondą w otwartym naczyniu wytwarza zakaźne aerozole i zanieczyszcza powierzchnie urządzenia. Sonikacja w szczelnie zamkniętej fiolce utrzymuje próbkę wewnątrz jej własnej probówki, co ma znaczenie podczas pracy z bakteriami chorobotwórczymi, takimi jak Mycobacterium tuberculosis, oraz innymi czynnikami biologicznymi wymagającymi poziomu bezpieczeństwa BSL-2 lub BSL-3.
- Brak erozji końcówki: Sondy tytanowe mogą podczas pracy uwalniać do próbki niewielką ilość mikrocząstek. Cząstki te zmieniają gęstość optyczną i wyniki zliczania cząstek na dalszych etapach. Pośrednia sonikacja przez ściankę naczynia całkowicie eliminuje to źródło cząstek stałych.
- Równomierne przetwarzanie próbek: VialTweeter dostarcza ultradźwięki o takim samym natężeniu do każdej z maksymalnie 10 fiolek, dzięki czemu wyniki sonikacji są jednolite i powtarzalne. Znikają efekty zależne od położenia, które utrudniają pracę z łaźniami i sonikację pojedynczych próbek sondą, a wartości odniesienia pozostają porównywalne między powtórzeniami.
- Integralność próbki: probówki pozostają zamknięte przez cały czas przetwarzania, więc próbka nie może ulec zanieczyszczeniu, zepsuciu ani ulotnieniu. Małe objętości można przetwarzać bez rozcieńczania, w tym cenne osady z próbek klinicznych, dla których dodatkowy etap przenoszenia jest niedopuszczalny.
- Kontrola procesu: Amplitudę można regulować od 20 do 100%, tryb impulsowy od 0 do 100%, a systemy umożliwiają monitorowanie temperatury, dzięki czemu wrażliwe na temperaturę szczepy i białka pozostają poniżej progów powodujących uszkodzenia.
Typowe zastosowania
- Analiza mikrobiomu i treści jelitowej: dyspergowanie Lactobacillus, Bifidobacterium i próbek kału przed posiewem lub sekwencjonowaniem, aby skupiska nie zaniżały wyników zliczania.
- Mikrobiologia żywności i wody: dezagregacja kłaczków w wymazach, popłuczynach i bulionach namnażających w celu dokładnego oznaczania liczby kolonii i żywotności.
- Badania biofilmu: odzyskiwanie komórek z nośników i powierzchni w postaci zawiesin pojedynczych komórek, bez obróbki enzymatycznej, która usuwałaby białka powierzchniowe.
- Diagnostyka kliniczna: ponowne zawieszanie plwociny, ropy i eluatów z wymazów w warunkach izolacji materiału biologicznego.
- Hodowla komórkowa: rozdzielanie skupisk komórek ssaczych, owadzich i CHO przed zliczaniem i pasażowaniem.
- Przygotowanie w ramach całego procesu: to samo urządzenie, które przeprowadza dezagregację przy niskiej amplitudzie, wykonuje pełne rozbijanie komórek przy wyższych ustawieniach, dzięki czemu liza, ekstrakcja białek i fragmentacja DNA następują bez przenoszenia próbek między probówkami.
Sonikator do płytek wielodołkowych UIP400MTP do deaglomeracji skupisk komórek przy wysokiej wydajności przetwarzania próbek
Sonikatory do mikropłytek UIP400MTP i UIP550MTP przetwarzają nie tylko płytki wielodołkowe, lecz także próbki w statywach na probówki.
Znajdź odpowiedni sonikator do swojego procesu dezagregacji
Sonikator do wielu probówek VialTweeter
Metoda z wyboru do sterylnej dezagregacji w szczelnie zamkniętych fiolkach. VialTweeter, napędzany procesorem UP200St o mocy 200 watów i częstotliwości 26 kHz z automatycznym dostrajaniem, przekazuje ultradźwięki pośrednio przez ścianki nawet 10 zamkniętych fiolek jednocześnie, z mocą do 10 W na probówkę, zapewniając jednolite i powtarzalne wyniki bez zanieczyszczenia krzyżowego i bez utraty próbki. Tytanową sonotrodę VialTweeter można sterylizować w autoklawie, a ustawienia amplitudy i impulsów można regulować i zapisywać, co zapewnia zakres kontroli potrzebny w protokole deaglomeracji. Standardowa sonotroda z 10 pozycjami mieści fiolki do autosamplera, probówki do mikrowirówek oraz probówki Eppendorf lub Nunc o pojemności od 1 do 5 mL. Urządzenie zaciskowe VialPress obsługuje do 5 większych naczyń o średnicy do 20 mm.
Dostępne są dedykowane modele VialTweeter do pojedynczych probówek Falcon oraz modele do pojedynczych fiolek dostosowane do wielkości naczynia. Po zdemontowaniu sonotrody blokowej jednostka główna UP200St działa jako konwencjonalny sonikator z sondą do bezpośredniej obróbki próbek o małej i średniej objętości.
Sonikatory do mikropłytek
Zwiększ skalę przygotowania próbek do wysokiej wydajności dzięki sonikacji płytek wielodołkowych: w procesach wykorzystujących płytki sonikatory do mikropłytek UIP400MTP i UIP550MTP rozszerzają bezkontaktową, równomierną sonikację z dziesięciu probówek na całą płytkę.
UIP400MTP o mocy 400 watów przetwarza standardowe płytki mikrotitracyjne i wielodołkowe, w tym formaty 96-dołkowe, z precyzyjną kontrolą amplitudy, mocy i impulsów, a także z timerem, sondą temperatury i chłodzeniem w łaźni wodnej. Odrywanie biofilmu i przetwarzanie hodowli bakteryjnych to ugruntowane zastosowania sonikatora do mikropłytek UIP400MTP.
UIP550MTP o mocy 550 watów jest opcją o większej mocy – idealną do bardziej wymagających zastosowań.
Oba systemy sonikacji bezkontaktowej niezawodnie przetwarzają płytki 6-, 12-, 24-, 48-, 96- i 384-dołkowe, a także próbki w statywach na probówki i szalkach Petriego. Sonikatory do mikropłytek Hielscher współpracują z dowolną standardową płytką, eliminując konieczność stosowania drogich materiałów eksploatacyjnych przeznaczonych wyłącznie do danego systemu. Dzięki programowalnym limitom temperatury sonikacja automatycznie zatrzymuje się po osiągnięciu maksymalnej temperatury próbki i wznawia po ochłodzeniu, chroniąc żywotność w powtarzanych cyklach. Inteligentne i niezawodne przygotowanie próbek z wysoką wydajnością zapewniające powtarzalne wyniki.
Poniższa tabela przedstawia przybliżoną wydajność przetwarzania naszych laboratoryjnych sonikatorów do próbek stosowanych w naukach o życiu, genomice, proteomice i diagnostyce:
| Zalecane urządzenia | Objętość partii | Natężenie przepływu |
|---|---|---|
| Sonikator do wielu probówek VialTweeter | fiolki od 0,5 do 1,5mL | nie dotyczy |
| Sonikator do płytek wielodołkowych UIP400MTP (440 watów) | płytki wielodołkowe / mikrotitracyjne | nie dotyczy |
| Sonikator do płytek wielodołkowych UIP550MTP (550 watów) | płytki wielodołkowe / mikrotitracyjne | nie dotyczy |
| Ultradźwiękowy CupHorn | CupHorn do fiolek lub zlewki | nie dotyczy |
| Sonikator z sondą UP100H o mocy 100 watów | od 1 do 500mL | od 10 do 200mL/min |
| UP200Ht, UP200St – modele sonikatorów z sondą o mocy 200 watów | od 10 do 1000mL | od 20 do 200mL/min |
| Sonikator z sondą UP400St o mocy 400 watów | od 10 do 2000mL | od 20 do 400mL/min |
| GDmini2 | sterylny ultradźwiękowy mikroreaktor przepływowy | nie dotyczy |
| Ultradźwiękowa wstrząsarka do sit | nie dotyczy | nie dotyczy |
Najczęściej zadawane pytania dotyczące ultradźwiękowej dezagregacji komórek
Jaka jest różnica między dezagregacją komórek a lizą komórek?
Dezagregacja, nazywana również deaglomeracją, rozdziela skupione komórki, tworząc zawiesinę pojedynczych komórek, które pozostają nienaruszone i żywe. Liza powoduje pękanie osłony komórkowej i uwalnianie zawartości wewnątrzkomórkowej. Oba procesy są wywoływane przez ścinanie kawitacyjne, a różnica polega na ilości dostarczanej energii. Przy zoptymalizowanych ustawieniach amplitudy, impulsów i temperatury sonikacja zapewnia dezagregację poniżej progu lizy.
Dlaczego łaźnie ultradźwiękowe nie nadają się do znormalizowanej dezagregacji?
Łaźnie dostarczają jedynie niewielką energię ultradźwiękową, co prowadzi do niepełnego przygotowania próbek, a kawitacja rozwija się bardzo nierównomiernie w całym zbiorniku, więc każda próbka jest poddawana innej obróbce zależnie od swojego położenia. Oznaczenia liczebności mikroorganizmów i badania porównawcze wymagają porównywalności. Bezkontaktowe sonikatory, takie jak sonikator do wielu probówek VialTweeter oraz sonikatory do mikropłytek UIP400MTP i UIP550MTP, przetwarzają wszystkie naczynia przy ustawionych warunkach ultradźwiękowych, co poprawia powtarzalność między powtórzeniami.
Czy sonikacja może uszkodzić komórki?
Tak, jeśli parametry nie są kontrolowane. Nadmierna sonikacja lub niekontrolowane ogrzewanie mogą uszkodzić komórki, a uwolnione DNA zwiększa lepkość próbek i sprzyja ponownej agregacji. Dlatego proces należy opracować świadomie: umiarkowana amplituda, cykle impulsowe, chłodzenie i urządzenia z ograniczeniem temperatury utrzymują obróbkę w obszarze krzywej odpowiadającym dezagregacji.
Wszystkie cyfrowe sonikatory Hielscher oferują precyzyjnie regulowane parametry, podłączane czujniki temperatury, programowalne ustawienia i automatyczne rejestrowanie danych, zapewniając niezawodne przygotowanie próbek.
Czy próbkę trzeba przenieść do innego naczynia?
Nie. Fiolki i płytki są przetwarzane w swoich oryginalnych, zamkniętych pojemnikach. Pośrednia sonikacja pozwala uniknąć zarówno strat podczas przenoszenia, jak i przenoszenia pozostałości materiału związanego z manipulowaniem sondą.
Jakie formaty fiolek może przetwarzać VialTweeter?
Standardowa sonotroda z 10 pozycjami mieści fiolki do autosamplera, probówki do mikrowirówek oraz probówki Eppendorf lub Nunc o pojemności od 1 do 5 mL. Akcesorium VialPress mieści do 5 większych naczyń o średnicy do 20 mm. Dostępne są dedykowane modele VialTweeter do pojedynczych probówek Falcon oraz modele dostosowane do pojedynczych fiolek lub większych formatów.
Czy jednym urządzeniem można przeprowadzać dezagregację i lizę?
Tak. Ten sam zestaw, który przeprowadza dezagregację przy umiarkowanej amplitudzie, wykonuje całkowite rozbijanie komórek przy wyższej amplitudzie i dłuższej ekspozycji, dzięki czemu uzyskanie zawiesiny pojedynczych komórek i późniejszą ekstrakcję można przeprowadzić kolejno bez zmiany platformy.
Czy sonikacja jest stosowana w testach MBEC?
Sonikacja jest ugruntowanym i w dużej mierze standardowym elementem. W teście MBEC z pokrywką z kołkami, po wyhodowaniu biofilmów na polistyrenowych kołkach i poddaniu ich działaniu antybiotyku, kołki przenosi się do świeżego podłoża i poddaje mieszaniu na worteksie oraz sonikacji, aby oderwać i zdeagregować przylegające komórki biofilmu do postaci zawiesiny planktonicznej przed wykonaniem seryjnych rozcieńczeń i oznaczeniem liczby żywych komórek (MBEC odczytuje się jako najniższe stężenie zmniejszające liczbę odzyskanych żywych komórek o ≥3 log10 względem biofilmu niepoddanego obróbce). Sonikacja znacząco poprawia jakość dyspersji: niepełne uwolnienie komórek osadzonych w macierzy EPS powoduje niedoszacowanie eradykacji i zawyża wartości MBEC. Ukierunkowana sonikacja dołków mieszczących kołki na płytkach testowych za pomocą sonikatora do mikropłytek UIP400MTP eliminuje tradycyjne słabości sonikacji w łaźni – mianowicie nierównomierny rozkład energii, ogrzewanie oraz ryzyko powstawania aerozoli i zanieczyszczenia krzyżowego.
Dowiedz się, jak bezkontaktowy sonikator do mikropłytek UIP400MTP ułatwia testy MBEC!
Czy sonikacja jest stosowana w testach MIC?
Sonikację stosuje się w różnych procesach związanych z oznaczaniem MIC w celu poprawy wydajności i powtarzalności:
- w mykobakteriologii, gdzie plwocina i inne lepkie próbki są rutynowo dekontaminowane i homogenizowane, czasami z użyciem sonikacji, przed badaniem lekowrażliwości, a krótka dyspersja inokulów prątków tworzących skupiska sprzyja dokładnemu oznaczaniu MIC;
- w przypadku organizmów podatnych na agregację (np. paciorkowców, gronkowców w osadach), u których mikroagregaty zniekształcają gęstość inokulum; oraz
- w diagnostyce łączonej, takiej jak posiew płynu po sonikacji implantu, a następnie badanie lekowrażliwości w zakażeniu okołoprotezowym stawu (zastosowanie zbliżone do MBEC, a nie klasycznego MIC).
Literatura / źródła
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
- Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
Wybierz własną płytkę! Sonikator do mikropłytek UIP550MTP przeprowadza dezagregację próbek bakteryjnych w dowolnej standardowej płytce wielodołkowej.
Modele sonikatorów Hielscher do wielu próbek UIP400MTP do mikropłytek, VialTweeter i CupHorn: szybkie przygotowanie próbek z wysoką wydajnością przetwarzania