Ultradźwiękowa dezagregacja komórek w próbkach bakteryjnych

Próbki bakteryjne rzadko mają postać prawdziwych zawiesin jednokomórkowych. Hodowle rozwijają się w postaci łańcuchów i kłaczków, izolaty środowiskowe tworzą agregaty związane przez pozakomórkowe substancje polimerowe, a osady po odwirowaniu często nie dają się ponownie zawiesić pomimo intensywnego mieszania w wirówce. Liczenie żywych komórek, pomiar gęstości optycznej, cytometria przepływowa oraz profilowanie mikrobiomu opierają się na założeniu, że jedna cząstka odpowiada jednej komórce. Ultradźwiękowa dezagregacja komórek rozwiązuje ten problem: krótkie, kontrolowane impulsy sonikacji rozdzielają agregaty na pojedyncze komórki bez ich lizy.

Dlaczego agregacja komórek wpływa negatywnie na wyniki badań

Agregacja jest zjawiskiem biologicznym, a nie błędem w przygotowaniu próbki. Bakterie z rodzajów Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces oraz wiele gatunków występujących w środowisku naturalnym rozrastają się w postaci łańcuchów, skupisk lub fragmentów biofilmu, a pozakomórkowe DNA i polisacharydy łączą komórki w grudki oraz w eluatach z wymazów. Konsekwencje analityczne są systematyczne:

• Liczba kolonii jest zaniżona, ponieważ jedna grupa komórek tworzy jedną kolonię, niezależnie od tego, ile komórek zawiera.
• Gęstość optyczna i liczniki cząstek rejestrują agregaty zamiast komórek, co powoduje zniekształcenie krzywych wzrostu.
• W cytometrii przepływowej i sortowaniu komórek zdarzenia, w których komórki uległy zgrupowaniu, są błędnie zliczane i wykluczane z analizy.
• Ekstrakcje DNA i białek obejmują jedynie komórki znajdujące się na powierzchni agregatu, co powoduje zniekształcenie danych dotyczących mikrobiomu i danych omicznych.

Tradycyjne metody są powolne, niekompletne lub powodują zmiany chemiczne. Energiczne pipetowanie i mieszanie w wirówce pozostawia mikroagregaty. Dyspersja enzymatyczna lub oparta na chelatorach modyfikuje powierzchnię komórek, które zamierzasz analizować. Mechaniczna dezagregacja poprzez kontrolowaną kawitację przebiega w ciągu kilku sekund i nie wymaga stosowania żadnych dodatków.

W jaki sposób sonikacja powoduje rozdzielenie komórek bez ich lizy

Ultradźwiękowa dezagregacja komórek wykorzystuje różnicę w wytrzymałości mechanicznej. Agregaty bakteryjne są utrzymywane razem przez stosunkowo słabe wiązania międzykomórkowe oraz macierz pozakomórkową, podczas gdy nienaruszona otoczka komórkowa wytrzymuje znacznie większe siły ścinające. Gdy skalibrowane fale ultradźwiękowe docierają do zawiesiny, kawitacja akustyczna generuje mikroprądy, impulsy ciśnienia i siły ścinające, które oddziałują najpierw na granicach faz agregatów. Skupiska, łańcuchy i fragmenty biofilmu ulegają rozdzieleniu (deaglomeracja) jeszcze przed osiągnięciem poziomu energii, przy którym dochodzi do pęknięcia błon (liza).

Rozbijanie skupisk komórek bakteryjnych za pomocą ultradźwięków

Rozpad lub liza – Znaczenie parametrów sonikacji

W praktyce oznacza to, że dezagregacja i liza to ten sam proces realizowany przy różnych parametrach. Przy umiarkowanej amplitudzie, krótkich cyklach impulsowych i kontrolowanej temperaturze uzyskuje się zawiesinę żywych komórek pojedynczych. Zwiększenie amplitudy, czasu ekspozycji lub temperatury próbki powoduje przesunięcie procesu w kierunku całkowitego rozbicia komórek w celu uzyskania celów wewnątrzkomórkowych. Generatory firmy Hielscher umożliwiają precyzyjne ustawienie amplitudy, mocy, impulsów i wniesionej energii oraz zapisanie metody, dzięki czemu etap dezagregacji jest powtarzalny w odniesieniu do różnych próbek, operatorów i serii pomiarów.

Wydajne bezkontaktowe ultradźwiękowanie

Wykorzystanie wanny ultradźwiękowej nie zapewnia takiego poziomu kontroli. Wanny i zbiorniki do czyszczenia ultradźwiękowego dostarczają jedynie niewielką energię ultradźwiękową, co skutkuje niepełnym przygotowaniem próbek, a kawitacja zachodzi nierównomiernie, przez co każda probówka jest poddawana obróbce w zależności od jej położenia w wannie. Urządzenie VialTweeter przekazuje intensywne, skupione siły ultradźwiękowe bezpośrednio przez ściankę naczynia do maksymalnie 10 zamkniętych próbek jednocześnie. Zabiegi wymagające długiego, zmiennego czasu ekspozycji w kąpieli są realizowane w ramach znormalizowanego schematu impulsów.
Bezkontaktowe sonikatory firmy Hielscher wytwarzają intensywne, skupione fale ultradźwiękowe przenikające przez ścianki zamkniętych fiolek. Urządzenie VialTweeter pozwala na jednoczesną obróbkę nawet 10 fiolek z identyczną intensywnością, bez umieszczania sondy w próbce, bez ryzyka zanieczyszczenia krzyżowego i bez uwalniania aerozoli. W przypadku gdy wymaga tego wydajność, sonikatory do mikropłytek UIP400MTP i UIP550MTP zapewniają ten sam kontrolowany transfer energii do płytek wielokomorowych.

Zalety bezkontaktowej dezagregacji ultradźwiękowej

• Całkowity brak zanieczyszczeń krzyżowych: Ponieważ fiolki pozostają stale zamknięte, a żadna sonda nie jest zanurzana w próbce, całkowicie unika się zanieczyszczenia krzyżowego i utraty próbki. Nie ma potrzeby sterylizacji żadnych elementów między kolejnymi próbkami, a jeden cykl pomiarowy nie ma wpływu na następny.
• Ochrona przed aerozolami: Ultradźwiękowanie z otwartą sondą powoduje powstawanie aerozoli zakaźnych i zanieczyszcza powierzchnie sprzętu. Ultradźwiękowanie w zamkniętej fiolce pozwala na izolowanie próbki wewnątrz własnej probówki, co ma znaczenie podczas pracy z bakteriami chorobotwórczymi, takimi jak Mycobacterium tuberculosis oraz innymi czynnikami wymagającymi poziomu bezpieczeństwa BSL-2 lub BSL-3.
• Brak utraty napiwku: Sondy tytanowe mogą podczas pracy uwalniać do próbki niewielką ilość mikrocząstek. Cząstki te wpływają na gęstość optyczną i liczbę cząstek w dalszej części procesu. Pośrednie ultradźwiękowanie przez ściankę zbiornika całkowicie eliminuje to źródło cząstek stałych.
• Równomierna przepustowość: Urządzenie VialTweeter zapewnia jednakowe natężenie ultradźwięków dla każdej z maksymalnie 10 fiolek, dzięki czemu wyniki sonikacji są jednolite i powtarzalne. Eliminuje to wpływ położenia, który stanowi problem w przypadku kąpieli ultradźwiękowych i sondowania pojedynczych próbek, a wyniki bazowe pozostają porównywalne we wszystkich powtórzeniach.
• Integralność próbki: Probówki pozostają zamknięte przez cały czas trwania procesu, dzięki czemu próbka nie może ulec zanieczyszczeniu, zepsuciu ani ulotnieniu. Małe objętości można analizować bez rozcieńczania, w tym cenne osady kliniczne, w przypadku których nie można sobie pozwolić na dodatkowy etap przenoszenia.
• Kontrola procesu: Amplitudę można regulować w zakresie od 20 do 100%, tryb impulsowy w zakresie od 0 do 100%, a systemy obsługują monitorowanie temperatury, dzięki czemu szczepy i białka wrażliwe na temperaturę pozostają poniżej progów powodujących uszkodzenia.

Typowe zastosowania

• Analiza mikrobiomu i treści jelitowej: rozproszenie bakterii z rodzajów Lactobacillus i Bifidobacterium oraz próbek kału przed posiewem lub sekwencjonowaniem, tak aby skupiska bakterii nie zaniżały wyników liczenia.
• Mikrobiologia żywności i wody: rozbijanie kłaczków w wymazach, płukankach i pożywkach wzbogacających w celu dokładnego oznaczenia liczby kolonii i żywotności.
• Badania nad biofilmami: odzyskiwanie komórek z nośników i powierzchni w postaci zawiesin pojedynczych komórek, bez stosowania obróbki enzymatycznej, która mogłaby spowodować usunięcie białek powierzchniowych.
• Diagnostyka kliniczna: ponowne zawieszanie plwociny, ropy i eluatów z wymazów w warunkach izolacji.
• Hodowla komórkowa: rozdzielanie zbrylonych agregatów komórek ssaków, owadów i komórek CHO przed zliczeniem i pasażowaniem.
• Przygotowanie w ramach całego procesu: to samo urządzenie, które rozbija komórki przy niskiej amplitudzie, przy wyższych ustawieniach zapewnia całkowite rozerwanie komórek, dzięki czemu liza, ekstrakcja białek i fragmentacja DNA następują bez konieczności przenoszenia próbek między probówkami.

Literatura / Referencje