Protokół proteomiczny: sonikacja bezkontaktowa usprawnia przygotowanie próbek peptydowych do MS

Proteomika typu bottom-up stała się podstawą współczesnego odkrywania biomarkerów, biologii strukturalnej i diagnostyki klinicznej. Trawiąc białka do peptydów przed analizą metodą spektrometrii mas (MS), badacze mogą uzyskać większe pokrycie sekwencji i bardziej wiarygodne oznaczenia ilościowe. Jednak przygotowanie próbek biologicznych o dużej złożoności do MS pozostaje wymagające pod względem technicznym. Najnowsze postępy metodologiczne pokazują, jak kontrolowane przetwarzanie ultradźwiękowe – w szczególności przy użyciu bezkontaktowego sonikatora wielopróbówkowego VialTweeter i sonikatora do mikropłytek UIP400MTP – może znacznie usprawnić ten proces, poprawić odtwarzalność i zapobiec typowym ograniczeniom przepustowości aparatury.
Zapoznaj się ze szczegółowym protokołem przygotowania próbek pozwalającym uzyskać peptydy o wielkości odpowiedniej do analizy metodą MS.

Kto powinien stosować sonikację bezkontaktową do przygotowania próbek peptydowych?

• Laboratoria proteomiki typu bottom-up i badań odkrywczych: Badacze przygotowujący próbki o dużej złożoności do procedur LC-MS lub MALDI, którzy potrzebują powtarzalnego, wysokiego odzysku peptydów z różnych matryc biologicznych.
• Użytkownicy S-Trap™ i wychwytywania w zawiesinie: Zespoły korzystające z oczyszczania na mikrokolumnach, które potrzebują kontrolowanego ścinania DNA, aby zapobiegać zatykaniu kolumn i zapewniać sprawne nanoszenie oraz trawienie próbek.
• Zespoły badań klinicznych i translacyjnych: Laboratoria przetwarzające tkanki, komórki, osocze, surowicę lub płyn mózgowo-rdzeniowy, w których kluczowe znaczenie mają odtwarzalność między seriami i integralność próbek.
• Zespoły zajmujące się ilościową i celowaną analizą MS: Laboratoria prowadzące rygorystyczne badania porównawcze, w których sonikatory z sonotrodą stwarzają ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego mogącego zaburzyć oznaczanie ilościowe peptydów o niskiej obfitości.
• Centralne jednostki usługowe i laboratoria o wysokiej przepustowości: Zespoły przetwarzające jednocześnie wiele powtórzeń biologicznych, które korzystają z sonikacji w zamkniętych probówkach w bloku wielopróbówkowym VialTweeter, eliminującej czyszczenie sonotrody, skracającej czas pracy manualnej i utrzymującej warunki aseptyczne.
• Badacze modyfikacji potranslacyjnych i struktury białek: Badacze potrzebujący łagodnego przetwarzania w kontrolowanej temperaturze, aby zachować labilne modyfikacje i zmaksymalizować pokrycie sekwencji podczas lizy i homogenizacji komórek.

Przegląd protokołu: od tkanek i komórek do peptydów gotowych do analizy MS

Powszechnie stosowana procedura proteomiki typu bottom-up opisana przez Wojtkiewicz i wsp. zapewnia niezawodną, skalowalną metodę przygotowania próbek peptydowych z różnych matryc biologicznych. Przy materiale wyjściowym obejmującym 50–100 mg błyskawicznie zamrożonej tkanki lub 1–20 milionów komórek protokół wykorzystuje technologię wychwytywania w zawiesinie (S-Trap™), aby skutecznie usuwać detergenty, sole i zanieczyszczenia przed trawieniem enzymatycznym.
Po lizie, oznaczeniu ilościowym białek, redukcji i alkilacji próbka jest zakwaszana i nanoszona na kolumnę wirówkową S-Trap™, w której zachodzi trawienie trypsyną/lysC. Uzyskane peptydy są eluowane, suszone i poddawane analizie LC-MS. W przypadku 50 mg tkanki ludzkiego serca procedura ta powtarzalnie dostarcza ilość peptydów wystarczającą na 30–40 nastrzyków, umożliwiając identyfikację ponad 4 000 unikalnych białek w każdym przebiegu analizy. Chociaż reakcje chemiczne i oczyszczanie na kolumnach są dobrze zdefiniowane, powodzenie całej procedury w dużym stopniu zależy od początkowych etapów fizycznego rozbijania materiału i postępowania z DNA.
Protokół zaleca stosowanie sonikatora wielopróbówkowego VialTweeter do lizy komórek przez sonikację i ścinania DNA – oba etapy mają kluczowe znaczenie dla analizy peptydów.

Ultradźwiękowa liza komórek i tkanek do ekstrakcji białek

W procedurze proteomiki typu bottom-up sonikacja jest kluczowym etapem lizy próbek komórkowych w celu ekstrakcji białek do późniejszej analizy metodą spektrometrii mas. Po dodaniu buforu do lizy komórek zawierającego SDS do osadu komórkowego próbki są poddawane przetwarzaniu ultradźwiękowemu przy użyciu sonikatora wielopróbówkowego VialTweeter. Protokół przewiduje użycie probówek mikrowirówkowych o pojemności 1,5 mL i pracę sonikatora przy 30% mocy przez 10 sekund, po których następuje 10 sekund przerwy, powtarzaną przez 3 cykle. Po odczekaniu 1 minuty cykl powtarza się jeszcze dwa razy. Próbki są stale chłodzone lodem.
Proces ten nie tylko pomaga w rozbijaniu komórek, lecz jest też niezbędny do ścinania genomowego DNA uwalnianego podczas lizy. Skuteczne ścinanie DNA ma kluczowe znaczenie dla zmniejszenia lepkości próbek i zapobiegania zatykaniu kolumn S-Trap™, zapewniając tym samym optymalny odzysk białek i niezawodne późniejsze trawienie do peptydów.

Kluczowa rola ultradźwiękowego ścinania DNA

Jednym z najczęstszych problemów w procedurach opartych na S-Trap™ jest zatykanie kolumn, które jest niemal wyłącznie powodowane przez genomowe DNA o dużej masie cząsteczkowej uwalniane podczas homogenizacji komórek lub tkanek. Nienaruszone DNA drastycznie zwiększa lepkość próbki, zatrzymuje peptydy i blokuje mikroporowate złoże sorbentu S-Trap™.
Przetwarzanie ultradźwiękowe rozwiązuje ten problem przez mechaniczną fragmentację DNA na małe, rozpuszczalne fragmenty. Dzięki zastosowaniu kontrolowanej energii akustycznej VialTweeter skutecznie ścina kwasy nukleinowe bez wytwarzania nadmiernego ciepła ani wprowadzania obcych zanieczyszczeń. Takie zmniejszenie lepkości zapewnia sprawne nanoszenie próbek, stałe natężenie przepływu przez kolumnę i niezakłóconą kinetykę trawienia.

Zoptymalizowane parametry sonikacji przy użyciu VialTweeter

Protokół określa wysoce odtwarzalny schemat sonikacji, zoptymalizowany pod kątem integralności próbek biologicznych i zgodności z późniejszą analizą MS. W przypadku próbek w probówkach mikrowirówkowych o pojemności 1,5mL, przetwarzanych przy użyciu bezkontaktowego sonikatora blokowego Hielscher VialTweeter, następujące parametry zapewniają lizę i optymalne ścinanie DNA przy zachowaniu struktury białek:

• Amplituda: 30% mocy
• Schemat cyklu: 10 sekund WŁ. / 10 sekund WYŁ.
• Czas trwania: 3 cykle (10sec WŁ./10sec WYŁ.) → 1-minutowa przerwa na lodzie → powtórzenie jeszcze 2 razy
• Kontrola temperatury: podczas przetwarzania próbki są umieszczane na lodzie, aby zapobiec denaturacji termicznej i przedwczesnej aktywności enzymatycznej

Takie podejście oparte na sonikacji impulsowej zapobiega miejscowemu przegrzewaniu, minimalizuje utlenianie peptydów i zapewnia równomierną ekspozycję akustyczną we wszystkich fiolkach. Układ z zamkniętymi probówkami eliminuje również konieczność czyszczenia sonotrody między próbkami, radykalnie skracając czas pracy manualnej i zmniejszając zmienność wynikającą z pracy operatora.

Najważniejsze zalety dla współczesnych procedur proteomicznych

Włączenie VialTweeter do procedury proteomiki typu bottom-up zapewnia szereg korzyści operacyjnych i naukowych:

1. Powtarzalna fragmentacja DNA: Równomierne dostarczanie energii akustycznej do wszystkich fiolek zapewnia odtwarzalne zmniejszenie lepkości i zapobiega zmienności między seriami podczas nanoszenia próbek na S-Trap™.
2. Zachowanie labilnych modyfikacji: Przetwarzanie w niskiej temperaturze w kąpieli lodowej chroni modyfikacje potranslacyjne (PTM) i zapobiega agregacji białek wywołanej ciepłem podczas lizy komórek.
3. Usprawnione dalsze przetwarzanie: Lizaty przetworzone przy użyciu VialTweeter można bezpośrednio klarować przez wirowanie i poddawać oznaczeniom ilościowym bez dodatkowych etapów oczyszczania, co przyspiesza przejście do trawienia w S-Trap™.
4. Skalowalność i elastyczność: Te same ustawienia sonikacji stosuje się zarówno do próbek tkanek o dużej złożoności, jak i do zawiesin komórkowych, wspierając procedury proteomiki odkrywczej, celowanych oznaczeń ilościowych i glikoproteomiki. Sonikatory do mikropłytek Hielscher umożliwiają łatwe zwiększenie skali do dużej liczby próbek w płytkach wielodołkowych.

Literatura / Źródła

• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
• Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
• Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.