Sonikacja mikropłytek w proteomice shotgun – nota aplikacyjna

Proteomika shotgun wymaga wydajnego, powtarzalnego przygotowania próbek, aby przekształcić złożony materiał biologiczny w peptydy gotowe do analizy LC-MS/MS. Sonikator do mikropłytek UIP400MTP wspiera ten proces, umożliwiając standaryzowaną, równoległą sonikację próbek o małej objętości i pomagając laboratoriom usprawnić rozbijanie, ekstrakcję i ponowną solubilizację w procedurach wykorzystujących mikropłytki. Ta nota aplikacyjna opisuje, jak włączyć UIP400MTP do przygotowania próbek do analiz proteomicznych, wykorzystując opublikowaną procedurę dotyczącą pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z badań PLA2G12A/Th17 jako przykład sprawdzony w laboratorium.

Sonikacja mikropłytek dla większej powtarzalności proteomiki shotgun

Dla badaczy zajmujących się proteomiką powtarzalne przygotowanie próbek ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości danych LC-MS/MS. Sonikator do mikropłytek UIP400MTP umożliwia standaryzowaną, równoległą sonikację w procedurach opartych na płytkach oraz procedurach o małej objętości próbek i wysokiej wydajności przetwarzania.

Jest szczególnie przydatny w laboratoriach pracujących z:

• Dużymi zestawami próbek, które wymagają jednolitego przetwarzania w wielu dołkach
• Materiałem dostępnym w ograniczonej ilości, w przypadku którego należy zminimalizować straty próbek i zmienność
• Próbkami bogatymi w lipidy, takimi jak pęcherzyki zewnątrzkomórkowe
• Złożonymi preparatami biologicznymi, które wymagają wydajnego rozbijania, ekstrakcji lub ponownej solubilizacji
• Porównawczą proteomiką shotgun, w której niezbędna jest powtarzalność między warunkami i powtórzeniami

Włączając sonikację mikropłytek przed trawieniem, badacze mogą lepiej przygotować próbki do:

• Ekstrakcji i ponownej solubilizacji białek
• Trawienia trypsyną/Lys-C
• Akwizycji danych nano-LC/MS/MS
• Dalszej ilościowej analizy proteomicznej

Sonikacja mikropłytek może przynieść korzyści:

• Centralnym pracowniom proteomicznym
• Laboratoriom badającym EV
• Laboratoriom immunologii i biologii komórki
• Zespołom prowadzącym badania translacyjne
• Zespołom z obszaru nauk o życiu zwiększającym skalę od przygotowania pojedynczych próbek do procedur o większej wydajności przetwarzania

Przygotowanie próbek o wysokiej wydajności przetwarzania do analizy proteomu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Czym jest proteomika shotgun?

Proteomika shotgun stała się podstawową strategią analityczną służącą do charakteryzowania złożonych próbek biologicznych, od lizatów całych komórek i ekstraktów tkankowych po oczyszczone organelle, pęcherzyki zewnątrzkomórkowe i próbki kliniczne dostępne w niewielkiej ilości. Jej główna zaleta polega na połączeniu trawienia białek, chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości oraz obliczeniowego wnioskowania o białkach na podstawie peptydów. Jednak jakość końcowego zbioru danych proteomicznych jest określana na długo przed dotarciem próbki do spektrometru mas. Wydajne rozbijanie próbek, solubilizacja białek, usuwanie substancji zakłócających, powtarzalne trawienie enzymatyczne i niezawodny odzysk peptydów mają decydujące znaczenie dla głębokości pokrycia proteomu i wiarygodności ilościowej.
Dla badaczy zajmujących się proteomiką i laboratoriów z obszaru nauk o życiu pracujących z próbkami dostępnymi w ograniczonej ilości lub szczególnie cennymi przygotowanie próbek jest często wąskim gardłem.

Wyzwania związane z pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi w proteomice

Na przykład pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) stanowią szczególnie wymagającą klasę próbek. Są to otoczone błoną, bogate w lipidy cząstki o rozmiarach nanometrycznych, charakteryzujące się stosunkowo niskim uzyskiem białka i dużym ryzykiem przenoszenia lipidów, soli, detergentów, białek surowicy i innych składników matrycy do kolejnych etapów. Cechy te mogą zakłócać wydajność trawienia, sprawność chromatografii, stabilność elektrorozpylania i identyfikację peptydów. Procedura przygotowania próbek do proteomiki EV musi więc być wystarczająco skuteczna, aby rozbić struktury pęcherzyków i solubilizować ich zawartość białkową, a jednocześnie pozostawać kompatybilna z późniejszym trawieniem enzymatycznym i analizą LC-MS/MS.
W tym kontekście sonikacja dostosowana do mikropłytek stanowi praktyczne podejście do powtarzalnego, równoległego przetwarzania próbek. Modele sonikatorów do mikropłytek Hielscher UIP400MTP (400 W) i UIP550MTP (550 W) są przeznaczone do sonikacji próbek w płytkach wielodołkowych i naczyniach o małej objętości, umożliwiając procedury o większej wydajności przetwarzania niż konwencjonalne sonikatory z pojedynczą sonotrodą. Dla laboratoriów proteomicznych ten format jest atrakcyjny, ponieważ może ograniczyć zmienność wynikającą z czynności manualnych, usprawnić równoległą obróbkę wielu próbek i bardziej naturalnie wpasować się w ciągi przygotowania próbek oparte na płytkach.

Przykładowa procedura

Niedawno opisana procedura proteomiki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w badaniach biologii komórek Th17 zależnej od PLA2G12A stanowi przydatny, sprawdzony w laboratorium przykład włączenia sonikatora do mikropłytek UIP400MTP do przygotowania próbek do proteomiki shotgun. W tej serii badań próbki EV przygotowywano do analizy proteomu z zastosowaniem obróbki metanolem, sonikacji za pomocą UIP400MTP, wirowania, suszenia, trawienia trypsyną/Lys-C oraz chromatografii cieczowej (LC) o nanoprzepływie sprzężonej z tandemową spektrometrią mas (MS) o wysokiej rozdzielczości. Wyniki badań biologicznych opublikowali w 2026 roku Mochizuki-Ono i współpracownicy; analiza proteomiczna pomogła w nich scharakteryzować, jak PLA2G12A zmienia białka zawarte w EV w kontekście patogennych odpowiedzi limfocytów T.

Sonikator do płytek wielodołkowych UIP400MTP

Dlaczego sonikacja mikropłytek?
UIP400MTP umożliwia standaryzowaną, równoległą sonikację próbek o małej objętości. Jest to przydatne, gdy ważne są powtarzalność, mała ilość materiału wejściowego oraz wydajność przetwarzania wielu próbek.


Lista kontrolna kontroli jakości

• Potwierdzić jednakową ilość wejściową EV odpowiadającą tej samej ilości białka we wszystkich próbkach.
• Stosować losowe lub zrównoważone rozmieszczenie próbek podczas przetwarzania.
• Utrzymywać jednakową objętość metanolu, czas sonikacji, czas suszenia i objętość trawienia.
• Monitorować uzysk peptydów i całkowitą liczbę zidentyfikowanych białek.
• Sprawdzać odsetek pominiętych miejsc cięcia i rozkład długości peptydów.
• Oceniać kształt pików chromatograficznych i powtarzalność czasu retencji.
• Uwzględnić próby ślepe w celu monitorowania przenoszenia pozostałości między próbkami.
• W większych badaniach stosować zbiorcze próbki QC.
• Oceniać współczynnik zmienności między powtórzeniami.
• Stosować PCA lub pokrewne metody do identyfikacji efektów serii lub próbek odstających.

Zalecenia dotyczące dokumentowania

Przy publikowaniu lub dokumentowaniu tej procedury należy podać ilość wejściową EV, format płytki, objętość metanolu, amplitudę i czas sonikacji UIP400MTP, warunki wirowania, metodę suszenia, bufor do trawienia, stężenie enzymów, czas trawienia, warunki zakwaszania, platformę LC-MS/MS, tryb akwizycji, wersję oprogramowania, bazę danych, próg FDR, metodę normalizacji oraz procedurę analizy statystycznej.
Wszystkie sonikatory do mikropłytek Hielscher automatycznie rejestrują ważne parametry procesu, takie jak amplituda, czas sonikacji i temperatura, wraz ze znacznikiem daty i czasu w postaci pliku CVS na zintegrowanej karcie SD. Rejestrowanie danych na potrzeby powtarzalności i kontroli jakości nigdy nie było łatwiejsze!

Szczegóły badania: proteomika shotgun EV w badaniu PLA2G12A

Badanie PLA2G12A stanowi konkretny przykład zastosowania UIP400MTP w procedurze proteomiki shotgun. Pytanie biologiczne dotyczyło tego, jak wydzielana fosfolipaza PLA2G12A modyfikuje pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pochodzące z komórek Th17 i tym samym wpływa na różnicowanie patogennych limfocytów T. Autorzy wykazali, że PLA2G12A działa na błony EV, wytwarzając lizofosfolipidy, w tym 1-oleoilo-lizofosfatydyloetanoloaminę, oraz że dalsza sygnalizacja kwasu lizofosfatydowego za pośrednictwem LPA2 przyczynia się do różnicowania Th17. Oprócz sygnalizacji lipidowej w badaniach analizowano również zawartość EV, w tym RNA i białka, co uczyniło proteomikę shotgun ważnym elementem strategii charakteryzowania.
W procedurze przygotowania EV komórki Th17 hodowano w pożywce zawierającej płodową surowicę bydlęcą pozbawioną egzosomów. Supernatanty hodowlane najpierw wirowano w celu usunięcia komórek, filtrowano przez filtr 0,22 µm, zatężano przez ultrafiltrację/ultrawirowanie, przemywano, ponownie zawieszano w PBS i oznaczano ilościowo metodą BCA do oznaczania białka. Ten wstępny etap przygotowania EV zapewniał możliwość wprowadzenia do procedury proteomicznej określonej ilości materiału EV odpowiadającej określonej ilości białka.
Do analizy proteomicznej shotgun autorzy użyli próbek EV odpowiadających 5 µg białka. Próbki te wysuszono w probówkach PCR i dodano 25 µL metanolu. Następnie próbki sonikowano przez 3 minuty za pomocą sonikatora do mikropłytek UIP400MTP. Po sonikacji próbki wirowano w 4°C przez 20 minut przy 19 000 × g. Po usunięciu 20 µL supernatantu próbki odwirowano do sucha. Następnie białka rozpuszczono za pomocą sonikacji w 4 µL roztworu trypsyny/Lys-C o stężeniu 100 ng/µL w 50 mM wodorowęglanie amonu. Trawienie prowadzono przez 2 godziny w 37°C, wytrząsając przy 300 rpm. Hydrolizat zakwaszono 1 µL 1,25% kwasu trifluorooctowego i poddano analizie metodą chromatografii cieczowej o nanoprzepływie sprzężonej z tandemową spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości.
Ta procedura podkreśla kilka przydatnych zasad proteomiki EV przy małej ilości materiału wejściowego. Po pierwsze, ilość materiału wejściowego normalizowano względem ilości białka, co jest ważne przy porównywaniu EV pochodzących z różnych genotypów lub poddanych różnym zabiegom. Po drugie, przed sonikacją stosowano metanol, wspomagając rozbijanie i ekstrakcję, a jednocześnie unikając układów detergentowych, które mogą utrudniać LC-MS/MS. Po trzecie, etap sonikacji był krótki i standaryzowany, co jest zgodne z równoległym przetwarzaniem próbek. Po czwarte, trawienie trypsyną/Lys-C prowadzono w bardzo małej objętości, ograniczając rozcieńczenie i wspomagając odzysk peptydów z niewielkiej ilości materiału wejściowego. Wreszcie bezpośrednie przejście od trawienia do zakwaszenia i LC-MS/MS zminimalizowało zbędne czynności związane z obsługą próbek.
W dalszej metodzie LC-MS/MS wykorzystano rozdział w odwróconym układzie faz o nanoprzepływie, sprzężony ze spektrometrem mas Q-Exactive HF Orbitrap. Próbki zatrzymywano na prekolumnie C18, a następnie rozdzielano na kolumnie analitycznej o średnicy wewnętrznej 50 µm przy 200 nL/min i 40°C. Gradient prowadzono od niskiej zawartości rozpuszczalnika organicznego do 35% rozpuszczalnika B w ciągu 60 minut, po czym następowało płukanie przy wysokiej zawartości rozpuszczalnika organicznego i ponowne równoważenie. Akwizycję MS prowadzono w trybie jonów dodatnich, stosując akwizycję niezależną od danych z dysocjacją indukowaną zderzeniami o wyższej energii. Surowe pliki DIA analizowano za pomocą DIA-NN 1.8 z biblioteką widm przewidzianą in silico.