Ultradźwiękowanie mikropłytek w proteomice typu „shotgun” – Uwaga dotycząca zastosowania

Proteomika typu „shotgun” opiera się na wydajnym i powtarzalnym przygotowaniu próbek, mającym na celu przekształcenie złożonego materiału biologicznego w peptydy gotowe do analizy metodą LC-MS/MS. Sonikator do płytek mikrotitracyjnych UIP400MTP wspiera ten proces, umożliwiając standaryzowaną, równoległą sonikację próbek o małej objętości, co pomaga laboratoriom usprawnić rozbijanie, ekstrakcję i ponowne rozpuszczanie w procesach opartych na płytkach mikrotitracyjnych. W niniejszej nocie aplikacyjnej opisano, w jaki sposób urządzenie UIP400MTP można zintegrować z procesem przygotowywania próbek proteomicznych, wykorzystując jako sprawdzony w laboratorium przykład opublikowany schemat postępowania z pęcherzykami pozakomórkowymi, pochodzący z badań nad PLA2G12A/Th17.

Ultradźwiękowanie mikropłytek w celu uzyskania bardziej powtarzalnych wyników w proteomice typu „shotgun”

Dla naukowców zajmujących się proteomiką powtarzalne przygotowanie próbek ma kluczowe znaczenie dla uzyskania danych LC-MS/MS wysokiej jakości. Sonikator do mikropłytek UIP400MTP umożliwia standaryzowaną, równoległą sonikację w procesach opartych na mikropłytkach oraz w procesach charakteryzujących się małą objętością i wysoką przepustowością.

Jest to szczególnie przydatne dla laboratoriów zajmujących się:

• Duże zbiory próbek, które wymagają spójnego przetwarzania w wielu studzienkach
• Materiał o ograniczonej ilości, w przypadku którego należy zminimalizować straty próbki i zmienność
• Próbki bogate w lipidy, takie jak pęcherzyki pozakomórkowe
• Złożone preparaty biologiczne, które wymagają skutecznego rozbicia, ekstrakcji lub ponownego rozpuszczenia
• Porównawcza proteomika typu „shotgun”, w której kluczowe znaczenie ma powtarzalność wyników w różnych warunkach i powtórzeniach

Dzięki zastosowaniu sonikacji mikropłytek przed trawieniem naukowcy mogą poprawić przygotowanie próbek do:

• Ekstrakcja i ponowna solubilizacja białek
• Trawienie trypsyną/Lys-C
• Rejestracja danych w trybie Nano-LC/MS/MS
• Ilościowa analiza proteomiczna na dalszym etapie

 

Zwiększaj skalę przygotowywania próbek do badań proteomicznych bez obaw!
Dowiedz się, w jaki sposób sonikacja mikropłytek pomaga ograniczyć zmienność wynikającą z ręcznego wykonywania czynności, usprawnić rozbijanie próbek oraz przygotować złożone próbki biologiczne do wiarygodnej analizy metodą LC-MS/MS.

Zapytanie o informacje


Adres e-mail (wymagany)


produktu lub obszar zainteresowań



Zgadzam się z Polityką prywatności









Żądanie informacji

Ultradźwiękowanie mikropłytek może przynieść następujące korzyści:

• Ośrodki proteomiczne
• Laboratoria badawcze zajmujące się pojazdami elektrycznymi
• Laboratoria immunologii i biologii komórkowej
• Grupy zajmujące się badaniami translacyjnymi
• Zespoły zajmujące się naukami przyrodniczymi, przechodzące od przygotowywania pojedynczych próbek do procesów o większej przepustowości

Przygotowanie próbek metodą wysokoprzepustową do analizy proteomu pęcherzyków pozakomórkowych

Czym jest proteomika typu „shotgun”?

Proteomika typu „shotgun” stała się kluczową strategią analityczną służącą do charakteryzowania złożonych próbek biologicznych, od lizatów całych komórek i ekstraktów tkankowych po oczyszczone organelle, pęcherzyki pozakomórkowe oraz próbki kliniczne o niewielkiej ilości materiału wyjściowego. Jej główna zaleta polega na połączeniu trawienia białek, chromatografii cieczowej o wysokiej rozdzielczości sprzężonej z tandemową spektrometrią masową oraz komputerowego wnioskowania o białkach na podstawie peptydów. Jednak o jakości końcowego zbioru danych proteomicznych decyduje się na długo przed tym, zanim próbka trafi do spektrometru masowego. Skuteczne rozbicie próbki, solubilizacja białek, usunięcie substancji zakłócających, powtarzalny rozkład enzymatyczny oraz niezawodne odzyskiwanie peptydów mają decydujące znaczenie dla głębokości pokrycia i wiarygodności ilościowej.
Dla naukowców zajmujących się proteomiką oraz laboratoriów z dziedziny nauk przyrodniczych, które pracują z ograniczoną ilością lub cennymi próbkami, przygotowanie próbek stanowi często wąskie gardło.

Wyzwania związane z pęcherzykami pozakomórkowymi w proteomice

Na przykład pęcherzyki pozakomórkowe (EV) stanowią szczególnie wymagającą klasę próbek. Są to otoczone błoną, bogate w lipidy cząstki w skali nano, charakteryzujące się stosunkowo niską wydajnością białkową oraz wysokim ryzykiem przenoszenia lipidów, soli, detergentów, białek surowicy i innych składników macierzy. Cechy te mogą zakłócać wydajność trawienia, skuteczność chromatografii, stabilność podczas elektrosprysku oraz identyfikację peptydów. Procedura przygotowania próbek do proteomiki EV musi zatem być na tyle intensywna, aby rozbić struktury pęcherzyków i rozpuszczać zawarte w nich białka, pozostając jednocześnie zgodną z dalszym trawieniem enzymatycznym i analizą LC-MS/MS.
W tym kontekście sonikacja za pomocą urządzeń kompatybilnych z mikropłytkami stanowi praktyczne rozwiązanie umożliwiające powtarzalne i równoległe przetwarzanie próbek. Modele sonikatorów do mikropłytek firmy Hielscher: UIP400MTP (400 W) i UIP550MTP (550 W) zostały zaprojektowane do sonikacji próbek w płytkach wielokomorowych i naczyniach o małej objętości, umożliwiając procesy o większej przepustowości niż w przypadku konwencjonalnych sonikatorów z pojedynczą sondą. Dla laboratoriów proteomicznych ten format jest atrakcyjny, ponieważ pozwala ograniczyć zmienność wynikającą z czynnika ludzkiego, usprawnić równoległą obróbkę wielu próbek oraz w bardziej naturalny sposób zintegrować się z procesami przygotowywania próbek opartymi na płytkach.

Przykładowy przebieg pracy

Najnowszy schemat proteomiki pęcherzyków pozakomórkowych w badaniach nad komórkami Th17, w których kluczową rolę odgrywa PLA2G12A, stanowi przydatny, sprawdzony w laboratorium przykład tego, jak sonikator do płytek mikrotitracyjnych UIP400MTP można włączyć do procesu przygotowywania próbek do proteomiki typu „shotgun”. W tej serii badań próbki pęcherzyków pozakomórkowych (EV) zostały przetworzone do analizy proteomicznej przy użyciu obróbki metanolem, sonikacji za pomocą urządzenia UIP400MTP, wirowania, suszenia, trawienia trypsyną/Lys-C oraz nano-przepływowej chromatografii cieczowej (LC) połączonej z tandemową spektrometrią masową o wysokiej rozdzielczości. Te same badania biologiczne zostały po raz pierwszy opublikowane jako preprint na platformie bioRxiv, a następnie w czasopiśmie „Cell Reports”, gdzie analiza proteomiczna pomogła scharakteryzować, w jaki sposób PLA2G12A modyfikuje białka zawarte w EV w kontekście patogennych odpowiedzi komórek T.

Sonikator do płytek wielodołkowych UIP400MTP

Dlaczego warto stosować sonikację mikropłytek?
Urządzenie UIP400MTP umożliwia standaryzowaną, równoległą sonikację próbek o małej objętości. Jest to przydatne w sytuacjach, gdy istotne znaczenie mają powtarzalność wyników, niewielka ilość próbki oraz możliwość przetwarzania wielu próbek jednocześnie.

Lista kontrolna kontroli jakości

• Należy upewnić się, że we wszystkich próbkach zastosowano taką samą ilość białka EV.
• Należy stosować losowe lub zrównoważone schematy przetwarzania próbek.
• Należy utrzymywać stałą objętość metanolu, czas sonikacji, czas suszenia oraz objętość rozkładu.
• Należy monitorować wydajność peptydów oraz identyfikację wszystkich białek.
• Sprawdź wskaźnik nieudanych rozszczepień oraz rozkład długości peptydów.
• Należy sprawdzić kształt piku chromatograficznego oraz powtarzalność czasu retencji.
• Należy pozostawić puste miejsca, aby monitorować przenoszenie danych.
• W przypadku badań na większą skalę należy wykorzystywać zbiorcze próbki kontroli jakości.
• Oszacuj współczynnik zmienności dla powtórzeń.
• Należy zastosować analizę głównych składowych (PCA) lub podobne metody w celu zidentyfikowania efektów partii lub próbek odbiegających od normy.

Zalecenia dotyczące sporządzania protokołów

Podczas publikowania lub dokumentowania tego schematu postępowania należy podać ilość wprowadzonego EV, format płytki, objętość metanolu, amplitudę i czas sonikacji urządzenia UIP400MTP, warunki wirowania, metodę suszenia, bufor trawienia, stężenie enzymu, czas trawienia, warunki zakwaszania, platformę LC-MS/MS, tryb akwizycji, wersję oprogramowania, bazę danych, próg FDR, metodę normalizacji oraz procedurę statystyczną.
Wszystkie sonikatory do mikropłytek firmy Hielscher automatycznie rejestrują ważne parametry procesu, takie jak amplituda, czas trwania sonikacji i temperatura, wraz z datą i godziną, zapisując je w pliku CSV na wbudowanej karcie SD. Prowadzenie dokumentacji danych na potrzeby odtwarzalności i kontroli jakości nigdy nie było łatwiejsze!

Szczegółowa analiza: Proteomika metodą EV Shotgun w badaniu nad genem PLA2G12A

Badanie dotyczące PLA2G12A stanowi konkretny przykład wykorzystania urządzenia UIP400MTP w procesie proteomiki typu „shotgun”. Przedmiotem badań było ustalenie, w jaki sposób wydzielana fosfolipaza PLA2G12A modyfikuje pęcherzyki pozakomórkowe pochodzące z komórek Th17, a tym samym wpływa na różnicowanie patogennych komórek T. Autorzy wykazali, że PLA2G12A oddziałuje na błony pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV), powodując powstawanie lizo-fosfolipidów, w tym 1-oleoil-lizo-fosfatydyloetanoloaminy, oraz że dalsza sygnalizacja kwasu lizo-fosfatydowego za pośrednictwem LPA2 przyczynia się do różnicowania komórek Th17. Oprócz sygnalizacji lipidowej w badaniach przeanalizowano również ładunek pęcherzyków pozakomórkowych, w tym zawartość RNA i białek, co sprawiło, że proteomika typu „shotgun” stała się ważnym elementem strategii charakteryzacji.
W ramach procedury przygotowania EV komórki Th17 hodowano w pożywce zawierającej surowicę płodową bydlęcą pozbawioną egzosomów. Supernatanty hodowli najpierw odwirowano w celu usunięcia komórek, przefiltrowano przez filtr 0,22 µm, zatężono metodą ultrafiltracji/ultrawirówki, przemyto, zawieszono w PBS i poddano oznaczeniu ilościowemu za pomocą testu białkowego BCA. Takie wstępne przygotowanie EV zapewniło, że do procesu proteomicznego można było wprowadzić określoną, równoważną pod względem zawartości białka ilość materiału EV.
Do analizy proteomicznej metodą shotgun autorzy wykorzystali próbki EV odpowiadające 5 µg ekwiwalentu białka. Próbki te wysuszono w probówkach PCR, a następnie dodano do nich 25 µL metanolu. Następnie próbki poddano sonikacji przez 3 minuty przy użyciu sonikatora do mikropłytek UIP400MTP. Po sonikacji próbki odwirowano w temperaturze 4°C przez 20 minut przy 19 000 × g. Po usunięciu 20 µl supernatantu próbki odwirowano do wyschnięcia. Następnie białka rozpuszczono poprzez sonikację w 4 µl roztworu trypsyny/Lys-C o stężeniu 100 ng/µl w 50 mM roztworze wodorowęglanu amonu. Trawienie przeprowadzono przez 2 godziny w temperaturze 37°C przy mieszaniu z prędkością 300 obr./min. Produkt trawienia zakwaszono 1 µl 1,25% kwasu trifluorooctowego i poddano analizie metodą nano-flow LC połączoną z tandemową spektrometrią masową o wysokiej rozdzielczości.
Ten schemat pracy podkreśla kilka przydatnych zasad dotyczących proteomiki EV przy niewielkiej ilości materiału wyjściowego. Po pierwsze, ilość materiału wyjściowego została znormalizowana pod kątem ekwiwalentu białkowego, co ma znaczenie przy porównywaniu EV pochodzących z różnych genotypów lub poddanych różnym zabiegom. Po drugie, przed sonikacją zastosowano metanol, co wspomagało rozbicie i ekstrakcję, pozwalając jednocześnie uniknąć stosowania układów detergentowych, które mogłyby utrudnić analizę LC-MS/MS. Po trzecie, etap sonikacji był krótki i znormalizowany, co pozwala na równoległe przetwarzanie próbek. Po czwarte, trawienie trypsyną/Lys-C przeprowadzono w bardzo małej objętości, co ograniczyło rozcieńczenie i sprzyjało odzyskiwaniu peptydów przy niewielkiej ilości materiału wyjściowego. Wreszcie, bezpośrednie przejście od trawienia do zakwaszania i analizy LC-MS/MS zminimalizowało zbędne etapy obsługi.
W dalszej części procesu zastosowano metodę LC-MS/MS opartą na separacji w fazie odwróconej z wykorzystaniem przepływu nano, połączoną ze spektrometrem masowym Q-Exactive HF Orbitrap. Próbki były wychwytywane na kolumnie wstępnej C18, a następnie rozdzielane na kolumnie analitycznej o średnicy wewnętrznej 50 µm przy prędkości przepływu 200 nL/min i temperaturze 40°C. Gradient przebiegał od niskiego stężenia rozpuszczalnika organicznego do 35% stężenia rozpuszczalnika B w ciągu 60 minut, po czym następowało płukanie wysoką zawartością rozpuszczalnika organicznego i ponowne osiągnięcie równowagi. Rejestrację danych MS przeprowadzono w trybie jonów dodatnich, stosując akwizycję niezależną od danych (DIA) z dysocjacją zderzeniową o wyższej energii. Pliki surowe DIA analizowano przy użyciu oprogramowania DIA-NN 1.8 z biblioteką widm przewidywanych in silico.