Ultraschallënnerstëtzt Proteinextraktioun aus Tumorgeweebe – Protokoll

Dëse Protokoll beschreift eng Method fir d’ultraschallënnerstëtzt Proteinextraktioun aus Tumorgeweebe, déi de Standard-CPTAC-Aarbechtsoflaf fir d’Harnstofflys weiderentwéckelt, andeems e kontrolléierte Schrëtt vun der Ultraschallbehandlung mat enger Sond beim Opbrieche vum Geweebe bäigefüügt gëtt. Op Basis vun der etabléierter CPTAC-Virbereedungsstrategie fir eng déifgräifend Proteom- a Phosphoproteomanalys verbessert dës Modifikatioun d’Opbrieche vun Zellen a subzelluläre Strukturen, reduzéiert d’Viskositéit vun de Prouwen a verbessert d’Fräisetzung vu Proteinnen, déi typescherweis méi schwéier duerch Harnstofflys eleng ze gewanne sinn, besonnesch membrangebonnen an DNA-bindend oder zellkärassoziéiert Proteinnen. An der Etüd, déi dësem Protokoll zugronn läit, huet den ultraschallënnerstëtzten Aarbechtsoflaf den Nowäis souwuel vu Proteinnen wéi och vu Phosphopeptide verbessert an dobäi d’Kompatibilitéit mat der uschléissender Analysekette am CPTAC-Stil erhalen, déi Verdauung, TMT-Markéierung, Fraktionéierung, Phosphopeptidberäicherung an LC-MS/MS-Analys ëmfaasst.

Ultraschallënnerstëtzt Proteinextraktioun aus Tumorgeweebe fir eng déifgräifend proteomesch a phosphoproteomesch Analys

De folgende Protokoll ass fir d’Extraktioun vu Proteinnen aus kryopulveriséiertem Tumorgeweebe an engem Lyspuffer mat 8 M Harnstoff optiméiert: En zousätzleche Schrëtt vun der Ultraschallbehandlung mat enger Sond verbessert d’Ausbezuelung vu schwéier ze gewinnende Proteinklassen, besonnesch vu membranassoziéierten an DNA-/zellkärassoziéierte Proteinnen, virun der Verdauung an der uschléissender LC-MS/MS-Analys. An der Etüd vu Li et al. (2025), déi dësem Protokoll zugronn läit, huet d’Bäifüge vun der Ultraschallbehandlung den Nowäis vu membran- an zellkärassoziéierte Proteinne verbessert an an hirem Aarbechtsoflaf eng déifgräifend Ofdeckung vun >12.000 Proteinnen an >25.000 Phosphopeptiden ënnerstëtzt.

Uwendungsberäich vum Protokoll

Benotzt dës Prozedur fir:

• frësch agefruerent, kryopulveriséiert Tumorgeweebe
• Zellpellets oder aner biologesch Prouwen, fir déi eng Extraktioun op Harnstoffbasis schonn etabléiert ass
• Aarbechtsofleef fir global Proteomik a Phosphoproteomik mat tryptescher Verdauung an optionaler TMT-Markéierung

D’Etüd vu Li et al. (2025) gëtt un, datt den Aarbechtsoflaf och op aner Prouftyppe wéi Zelllinnen, Blutt an Urin uwendbar ass; jee no Prouftyp kann awer eng Optiméierung néideg sinn.

Optiméierten Aarbechtsoflaf fir d’Proufvirbereedung mat integréiertem Ultraschallbehandlungsschrëtt. Den optiméierten Aarbechtsoflaf an de Versuchsplang baséieren op dem CPTAC-Protokoll fir d’Proufvirbereedung fir eng global proteomesch a phosphoproteomesch Analys.
Etüd a Schema: ©Li et al., 2025

Funktiounsprinzip

An der ursprénglecher Etüd gouf eng Ultraschallbehandlung zum Standard-CPTAC-Aarbechtsoflaf fir d’Harnstofflys bäigefüügt an e verbesserten Nowäis vu Proteinne festgestallt, déi mat Membranen an Zellkäre verbonne sinn. D’Auteure ginn un, datt d’Parameter vun der Ultraschallbehandlung un d’Gréisst/Konzentratioun vun der Prouf präzis ugepasst musse ginn – duerch d’Wiel vun der Sonotrodagréisst, dem Energieandrag an dem zäitlechen Oflaf vun den Impulser.

Fir den Hielscher UP200Ht an UP200St bedeit dat zum Beispill:

• d’Amplitud an den Impulsmodus als Haaptsteiervariabele benotzen
• d’Prouwen déi ganzen Zäit kal halen (d. h. op Äis)
• mat virsiichtegen Astellungen ufänken
• d’Astellungen unhand vun der Kloerheet vun der Prouf, der Temperatur, der Proteinausbezuelung an der Qualitéit vun de Peptide fir déi uschléissend Schrëtt optiméieren

 
Béid Hielscher Ultraschallapparatmodeller mat 200 Watt, UP200Ht an UP200St, si fir kleng a mëttel Proufvolumenen entworf an hunn astellbar Amplituden- an Impulsparameter; béid Ultraschallhomogenisatore bidden eng digital Steierung iwwer en Touchscreen fir eng präzis Parameterastellung, eng automatesch Donnéeënopzeechnung, en uschléissbaren Temperatursensor, eng Fernsteierung an eng Proufbeliichtung.
 

Reagenzie fir d’ultraschallënnerstëtzt Proteinextraktioun

Harnstoff-Lyspuffer

Direkt virum Gebrauch frësch preparéieren:

• 8 M Harnstoff
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/mL Aprotinin
• 10 µg/mL Leupeptin
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 2, 1:100 (v/v)
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 3, 1:100 (v/v)

Den Harnstoff muss komplett opgeléist sinn, ier Zousazstoffer bäigefüügt ginn; Inhibitore sollten direkt virum Gebrauch bäigefüügt ginn; de Puffer sollt op Äis gehale ginn; an nom Bäifüge vun den Zousazstoffer gëtt e liicht Schwenken amplaz vun engem kräftege Mësche mam Vortexmëscher recommandéiert.
 

Zousätzlech Reagenzien:

• Reagenzie fir de BCA-Proteinassay
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• Iodacetamid
• LysC
• Trypsin
• Seejomessesaier
• TMT-Reagenzien, wann eng multiplexéiert quantitativ Proteomik benotzt gëtt
• IMAC-Reagenzien, wann eng Phosphopeptid-Uräicherung duerchgefouert gëtt

Ausrëschtung fir d’ultraschallënnerstëtzt Proteinextraktioun

Néideg

Recommandéiert Sondewal

Benotzt fir Prouwe vu ronn 200–1000 µL eng Sonotrod mat klengem Duerchmiesser, déi fir déi direkt Behandlung vu klenge Volumen mat héijer Intensitéit gëeegent ass. Hielscher bitt verschidde Sonotrodenduerchmiesseren un, a méi kleng Spëtztenduerchmiessere liwweren eng méi héich Intensitéit un der Spëtzt.

Prakteschen Hiweis: Benotzt déi klengst Sond, déi eng effizient Mëschung ouni iwwerméisseg Schaumbildung oder Kontakt mat der Gefässwand erméiglecht.

Wann Dir mat méi Prouwe gläichzäiteg schafft, kéint Dir Follgendes a Betruecht zéien: de VialTweeter Ultraschallapparat fir méi Réiercher oder den UIP400MTP Ultraschallapparat fir Mikroplacken!

Schrëtt-fir-Schrëtt-Uleedung: Oflaf vun der ultraschallënnerstëtzter Proteinextraktioun

A. Virkillen a virbereeden

1. Killt d’Zentrifug op 4°C of.
2. Bereet frëschen Harnstoff-Lysepuffer vir an haalt en op Äis.
3. Montéiert den UP200Ht oder UP200St op engem Stativ an engem Schallschutzgehäis.
4. Bereet en Äisbad vir, dat grouss genuch ass, fir d’Prouweréiercher oprecht a stabil ze halen.

Déi frësch Virbereedung vum Puffer an d’Handhabung bei niddreger Temperatur sinn entscheedend.

B. Ufänglech Harnstoffextraktioun

1. Haalt dat kryopulveriséiert Geweeben op Äis.
2. Gitt 200 µL gekillten Harnstoff-Lysepuffer pro 50 mg naasst Geweeben derbäi.
3. Mëscht 5–10 s bei héijer Vitess mam Vortex-Mëscher.
4. Inkubéiert 15 min bei 4°C.
5. Widderhuelt de Schrëtt aus Vortex-Mëschung an Inkubatioun nach eng Kéier.
6. Zentrifugéiert bei 20.000g fir 10 min bei 4°C.
7. Transfert d’Lysat / den Iwwerstand an e proppert Réierche mat gerénger Proteinbindung.

C. Ultraschallbehandlung mam UP200Ht oder UP200St

Ufanksbedéngunge fir d’Ultraschallbehandlung

• Amplitud: mat 20–30% ufänken
• Impulsdauer: 5 s UN
• Killung: 2 min op Äis tëscht den Impulser
• Zuel vun den Zyklen: 4 Zyklen
• Gesamtzäit vun der aktiver Ultraschallbehandlung: 20 s
• Gesamtprozesszäit inklusiv Killung: ongeféier 8–10 min

Schrëtt vun der Ultraschallbehandlung

1. Transfert d’Lysat an e Réierchen, dat fir d’Ultraschallbehandlung gëeegent ass. Benotzt e schmuele Réierche mat dënner Wand, dat e gudde Wärmenaustausch an e séchert Antauche vun der Sond erméiglecht.
2. Stellt d’Réierchen an en Äisbad. D’Publikatioun bezeechent d’Killung wärend der Ultraschallbehandlung als entscheedend, fir Hëtztschied ze verhënneren.
3. Taucht d’Sondespëtzt an d’Prouf an. Haalt d’Spëtzt déif genuch an der Flëssegkeet, fir eng stabil Kavitatioun ze erméiglechen, awer loosst se weder d’Wand nach de Buedem vum Réierche beréieren.
4. Féiert een Impuls vu 5 s mat der Ufanksamplitud duerch.
5. Setzt d’Prouf direkt nees ganz op Äis fir 2 min.
6. Widderhuelt dat, bis 4 Zyklen ofgeschloss sinn.
7. Kontrolléiert d’Lysat nom Zyklus.
8. Fuert nëmme weider, wann et néideg ass, mat jeeweils engem zousätzlechen Impuls vu 5 s, ëmmer gefollegt vun enger vollstänneger Ofkillung.
9. Stoppt, soubal d’Lysat méi eenheetlech a manner fadenzéiend / viskos gëtt.
   Den Endpunkt ass e méi duerchscheinend Lysat, dat Drëpsen amplaz vun engem kontinuéierleche viskose Stroum formt.
10. Zentrifugéiert bei ongeféier 16.000g fir 15 min bei 4°C.
11. Transfert de gekläerten Iwwerstand an e frëscht Réierchen a moosst d’Proteinkonzentratioun.

Verglach vun der globaler Proteomik a Phosphoproteomik tëscht Prouwen, déi mat Ultraschall behandelt goufen, a Prouwen, déi net mat Ultraschall behandelt goufen.
a. Zuel vun den identifizéierte Proteinnen (global Proteomik) an alle PDX-Tumorgeweeben mat oder ouni Ultraschallbehandlung. b. Zuel vun den identifizéierte Phosphopeptiden (IMAC-Uräicherung) an alle PDX-Tumorgeweeben mat oder ouni Ultraschallbehandlung. Nëmme Proteinnen a Phosphopeptide mat engem Abundanzverhältnes, dat méi grouss wéi oder gläich dem 25. Perzentil war, goufe gezielt. D’Abundanzverhältnes gouf tëscht de selwechten Zorte vu Prouwe berechent.
Etüd a Grafiken: ©Li et al., 2025

Uschléissend Verdauung an Analys

Fuert no der Ultraschallbehandlung an der Klärung esou virun, wéi et am ursprénglechen Aarbechtsoflaf nom CPTAC-Modell beschriwwe gëtt:

1. Verdënnt d’Lysat 1:3 (v/v) mat 50 mM Tris-HCl pH 8,0, fir d’Harnstoffkonzentratioun op <2 M ze reduzéieren.
2. Gitt LysC mat 1 mAU pro 50 µg Protein derbäi an inkubéiert 2 h bei 25°C.
3. Gitt Trypsin an engem Enzym:Substrat-Verhältnes vun 1:49 (w/w) derbäi a loosst iwwer Nuecht bei 25°C verdauen.
4. Stoppt d’Reaktioun mat Seejomessesaier bis zu enger Endkonzentratioun vun 1%.
5. Fuert jee no Bedarf mat der Entsalzung, der TMT-Markéierung, der Fraktionéierung, der Ureecherung vu Phosphopeptiden an der LC-MS/MS weider.

Differenziell Expressioun vu Phosphopeptiden aus TMT-markéierter MS.
a. De basale Subtyp, mat ervirgehuewene Beispiller vu mënschleche Phosphopeptiden (Ufank an Enn vun der Proteinsequenz), déi an Ultraschall-behandelte Prouwe géintiwwer onbehandelte Prouwen eropreguléiert sinn. b. De luminale Subtyp, mat ervirgehuewene Beispiller vu mënschleche Phosphopeptiden (Ufank an Enn vun der Proteinsequenz), déi an Ultraschall-behandelte Prouwe géintiwwer onbehandelte Prouwen eropreguléiert sinn. c. Ugeräichert KEGG-Signalweeër op Basis vun de Proteine vun eropreguléierte Phosphopeptiden am Ultraschall-behandelte basale Subtyp vun Tumoren. d. Ugeräichert KEGG-Signalweeër op Basis vun de Proteine vun eropreguléierte Phosphopeptiden am Ultraschall-behandelte luminale Subtyp vun Tumoren.
Etüd a Grafiken: ©Li et al., 2025

Design, Fabrikatioun a Berodung – Qualitéit aus Däitschland

D’Ultraschallapparater vun Hielscher si fir hir héchste Qualitéits- an Designstandarde bekannt. Robustheet an einfach Bedéngung erlaben eng reiwungslos Integratioun vun eisen Ultraschallapparater an industriell Anlagen. D’Ultraschallapparater vun Hielscher gi liicht mat haarde Bedéngungen an usprochsvollen Ëmfeld eens.

Hielscher Ultrasonics ass eng ISO-zertifizéiert Entreprise a leet besonnesche Wäert op héichleeschtungsfäeg Ultraschallapparater mat modernster Technologie a benotzerfrëndlecher Bedéngung. Selbstverständlech sinn d’Ultraschallapparater vun Hielscher CE-konform an erfëllen d’Ufuerderunge vun UL, CSA a RoHs.

Literatur / Referenzen

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.