Sonikatiouns-ënnerstëtzt Proteinextraktioun aus Tumorgewebe – Protokoll

Dëse Protokoll beschreift eng sonikatiouns-ënnerstëtzt Proteinextraktiounsmethod fir Tumorgewebe, déi de Standard-CPTAC-Harnstoff-Lysis-Workflow weiderbréngt, andeems en eng kontrolléiert Probe-Sonikatiouns-Schrëtt während der Gewebestéierung derbäisetzt. Op der etabléierter déif-skala CPTAC-Proteom- a Phosphoproteom-Virbereedungsstrategie opbauend, verbessert dës Modifikatioun d'Stéierung vun der Zell- a Subzellstruktur, reduzéiert d'Viskositéit vun de Probe a verbessert d'Fräisetzung vu Proteinen, déi normalerweis méi schwéier mat Harnstoff-Lyse eleng ze recuperéieren sinn, besonnesch membrangebonnen, DNA-bindend oder nukleus-assoziéiert Proteinen. An der zuleeënder Etude huet de sonikatiounsgestëtzte Workflow d'Detektioun vu béide Proteinen a Phosphopeptiden erhéicht, während d'Kompatibilitéit mat der noer CPTAC-ähnlecher Verdauung, TMT-Markéierung, Fraktionéierung, Phosphopeptid-Beräicherung an der LC-MS/MS Analysepipeline erhale bliwwen ass.

Sonikatiouns-ënnerstëtzt Proteinextraktioun aus Tumorgewebe fir déif proteomesch an phosphoproteomesch Analyse

The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.

Uwendungsberäich fir de Protokoll

Benotzt dës Prozedur fir:

• frësch gefruerene, kryopulveriséiert Tumorgewebe
• Zellpellets oder aner biologesch Proben, wou Harnstoff-baséiert Extraktioun schonn etabléiert ass
• global Proteomik- a Phosphoproteomik-Workflows mat tryptescher Verdauung an optionaler TMT-Markéierung

D'Etude vum Li et al. (2025) seet, datt de Workflow och op aner Probentypen wéi Zelllinnen, Blutt a Urin zoutrëfft, awer Optimiséierung kann no Probetyp néideg sinn.

Optimiséierte Workflow fir d'Probepreparatioun mat engem implementéierte Sonikatiounsschrëtt. De optiméierte Workflow an den experimentellen Design baséieren op dem CPTAC Probepreparatiounsprotokoll fir global proteomesch an phosphoproteomesch Analysen.
Studie a Schema: ©Li et al., 2025

Aarbechtsprinzip

Déi ursprénglech Etude huet d'Sonikatioun an de Standard-CPTAC-Harnstoff-Lysis-Workflow integréiert an eng verbessert Detektioun vu Proteinen, déi mat Membranen a Kären assoziéiert sinn, fonnt. D'Auteuren soen, datt d'Sonikatiounsparameter fein ofgestëmmt musse ginn wat d'Gréisst/Konzentratioun vun der Probe ugeet – andeems een d'Sonotrod-Gréisst, Energieinput an d'Pulszäit auswielt.

Exemplaresch, fir den Hielscher UP200Ht an UP200St bedeit dat:

• Benotzt Amplitude an Pulsmodus als Haaptkontrollvariabelen
• Proben iwwer d'ganz Zäit kal halen (also op Äis)
• Ufank mat konservative Ëmstellungen
• Optimiséieren géint d'Kloerheet vun der Probe, Temperatur, Proteinertrag an d'Qualitéit vun de Peptiden am Downstream

 
Béid Hielscher 200 Watt Sonicator Modeller UP200Ht an UP200St si fir kleng a mëttel Sample-Volumen entwéckelt, mat justéierbare Amplitude- a Pulsastellungen; Béid ultraschall Homogenisateuren bidden digital Touchscreen-Kontroll fir präzis Parameterjustéierung, automatiséiert Donnéeënopnam, pluggbar Temperatursensor, Fernsteierung an Probenbeliichtung.
 

Reagenzien fir d'Sonikatiouns-ënnerstëtzt Proteinextraktioun

Harnstoff-Lysis-Puffer

Bereet frësch direkt virum Gebrauch vir:

• 8 M Harnstoff
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 μg/mL Aprotinin
• 10 μg/mL Leupeptin
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 μM PUGNAc
• Phosphatase-Inhibitor-Cocktail 2, 1:100 (v/v)
• Phosphatase-Inhibitor-Cocktail 3, 1:100 (v/v)

Harnstoff muss komplett opgeléist sinn, ier Zousätz derbäigesat ginn; Inhibitoren solle direkt virum Gebrauch derbäigesat ginn; de Puffer soll op Äis gehalen ginn; An et gëtt no der Zousaz vu Zousätz recommandéiert, e wirbelen amplaz vum staarke Vortexen.
 

Zousätzlech Reagenzien:

• BCA-Protein-Assay-Reagenzien
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• Iodoacetamid
• LysC
• trypsin
• Formsäure
• TMT-Reagenzien, wann multiplexéiert quantitativ Proteomik benotzt gëtt
• IMAC-Reagenzien, wann Phosphopeptid-Beräicherung duerchgefouert gëtt

Ausrüstung fir Sonikatiouns-ënnerstëtzt Proteinextraktioun

Erfuerderlech

Recommandéiert Auswiel vun der Sond

Fir Proben ronderëm 200–1000 μL benotzt een eng kleng Sonotrid, déi fir direkt héichintensiv Veraarbechtung vu klenge Volumen passend ass. Hielscher bitt verschidde Sonotrod-Duerchmiesser, an déi méi kleng Spëtzt-Duerchmiesser bidden eng méi héich Intensitéit um Tipp.

Praktesch Notiz: Benotzt déi klengst Sond, déi effizient Mëschung ouni ze vill Schaum oder Kontakt mat der Behälterwand erméiglecht.

Wann Dir mat méi Samples gläichzäiteg schafft, kéint Dir iwwerleeën de Multi-Tube Sonicator VialTweeter oder de Mikroplack Sonicator UIP400MTP!

Schrëtt-fir-Schrëtt Instruktiounen: Prozedur vun der Sonikatioun-ënnerstëtzter Proteinextraktioun

A. Virbereedung a Virbereedung

1. Killt d'Zentrifuge op 4°C.
2. Bereet frëschen Harnstoff-Lysis-Puffer vir a leet en op Äis.
3. Setzt den UP200Ht oder UP200St op engem Stänn an engem Soundgehäuse op.
4. Bereet e Äisbad vir, dat grouss genuch ass, fir d'Probenröhre oprecht a stabil ze halen.

Frësch Puffervirbereedung an kal Handhabung si kritesch.

B. Initial Harnstoffextraktioun

1. Halt kryopulveriséiert Gewebe op Äis.
2. Füügt 200 μL gekillte Harnstoff-Lysispuffer pro 50 mg naasst Gewëss derbäi.
3. Vortex 5–10 Sekonne bei héijer Vitesse.
4. Inkubéiert 15 Minutten bei 4°C.
5. Widderhëlt nach eng Kéier de Vortex-plus-Inkubatiouns-Schrëtt.
6. Zentrifugéiert bei 20.000g fir 10 Minutten bei 4°C.
7. Transferéiert de Lysat/Supernatant an eng propper Tube mat niddreger Bindung.

C. Sonikatioun mat UP200Ht oder UP200St

Ufanksbedéngungen fir Sonikatioun

• Amplitude: fänkt bei 20–30% un
• Pulslängt: 5 s ON
• Ofkillung: 2 Minutten op Äis tëscht de Pulser
• Zuel vun de Zyklen: 4 Zyklen
• Total aktiv Sonikatiounszäit: 20 Sekonnen
• Total Prozesszäit inklusiv Ofkillung: ongeféier 8–10 Minutten

Sonikatiounsschrëtt

1. Transferéiert Lysat an eng Röhre, déi fir d'Sonikatioun gëeegent ass. Benotzt eng schmuel, dënnwandeg Röhre, déi e gudde Hëtztaustausch an eng sécher Sonde-Immersioun erméiglecht.
2. Setz d'Röhre an eng Äisbad. D'Aarbecht identifizéiert d'Ofkillung während der Sonikatioun als entscheedend fir Hëtztschied ze verhënneren.
3. Taucht d'Spëtzt vun der Sonde an d'Probe an. Halt d'Spëtzt genuch ënner Waasser fir stabil Kavitatioun, mee loosst se net d'Röhremauer oder de Buedem beréieren.
4. Laf eng 5 Sekonne Puls op der Startamplitude.
5. Setzt d'Probe direkt fir 2 Minutten zréck an d'Äis.
6. Widderhëlt bis 4 Zyklen ofgeschloss sinn.
7. Kontrolléier de Lysat nom Zyklus.
8. Weiderfueren nëmmen wann néideg, mat engem zousätzleche 5 Sekonne Puls op eemol, ëmmer gefollegt vun enger voller Ofkillung.
9. Halt op, wann de Lysat méi eenheetlech a manner sträifeg/viskos gëtt.
   Den Endpunkt ass e méi transluzente Lysat, dat Drëpsen formt amplaz vun engem kontinuéierleche viskose Floss.
10. Zentrifugéiert bei ongeféier 16.000g fir 15 Minutten bei 4°C.
11. Transferéiert de geklärte Supernatant an eng frësch Röhre a moosst d'Proteinkonzentratioun.

Verglach vun globale Proteomik a Phosphoproteomik tëscht sonikéierten an net-sonikéierte Proben.
a. Zuel vun identifizéierte Proteinen (global Proteomik) an allen PDX-Tumorgewebe mat oder ouni Sonikatioun. b. Zuel vun identifizéierte Phosphopeptiden (IMAC-Beräicherung) an allen PDX-Tumorgewebe mat oder ouni Sonikatioun. Nëmmen Proteinen a Phosphopeptiden mat engem Offangsverhältnis, dat méi grouss oder gläich dem 25. Perzentil war, goufen gezielt. D'Abundanzverhältnis gouf tëscht de selwechte Probentypen berechent.
Studie a Grafiken: ©Li et al., 2025

Downstream Verdauung an Analyse

No der Sonikatioun an der Klärung fuert Dir weider wéi am urspréngleche CPTAC-Stil Workflow beschriwwen:

1. Verdënnt Lysat 1:3 (v/v) mat 50 mM Tris-HCl pH 8,0 fir Harnstoff ze reduzéieren op <2 M.
2. Füügt LysC bei 1 mAU pro 50 μg Protein derbäi a inkubéiert 2 Stonnen bei 25°C.
3. Füügt Trypsin bei 1:49 Enzym:Substrat (w/w) derbäi a verdau et iwwer Nuecht bei 25°C.
4. Mat Formsäure op 1% Final ofschrecken.
5. Fuert weider mat Entsalzung, TMT-Markéierung, Fraktionéierung, Phosphopeptid-Beräicherung an LC-MS/MS wéi néideg.

Differenziell Expression vu Phosphopeptiden aus TMT-markéierter MS.
a. De basale Subtyp, deen e puer mënschlech Phosphopeptiden (Proteinsequenz-Ufank an -Enn) ervirhebt, déi an sonikéierte Proben am Verglach zu net-sonikéierte Proben upreguléiert goufen. b. De luminale Subtyp, deen e puer mënschlech Phosphopeptiden (protein_sequence Ufank an Enn) ervirhieft, déi an sonikéierte Proben am Verglach zu net-sonikéierte Proben upreguléiert sinn. c. Beräicherte KEGG-Weeër baséiert op de Proteinen vun upreguléierte Phosphopeptiden an sonikéierte basale Subtypen vun Tumoren. d. Beräicherte KEGG-Weeër baséiert op de Proteinen vun upreguléierte Phosphopeptiden an sonikéierte luminale Subtypen vun Tumoren.
Studie a Grafiken: ©Li et al., 2025

Design, Fabrikatioun a Berodung – Qualitéit Made in Germany

Hielscher Ultraschaller si bekannt fir hir héchst Qualitéit an Designnormen. Robustheet an einfach Operatioun erlaben déi glat Integratioun vun eisen Ultraschaller an industriellen Ariichtungen. Rau Konditiounen an erfuerderlech Ëmfeld ginn einfach vun Hielscher Ultraschaller gehandhabt.

Hielscher Ultrasonics ass eng ISO zertifizéiert Firma a setzt spezielle Wäert op High-Performance Ultrasonicatoren mat modernste Technologie a Benotzerfrëndlechkeet. Natierlech sinn Hielscher Ultraschaller CE konform an entspriechen d'Ufuerderunge vun UL, CSA a RoHs.

Literatur / Referenzen