Ultraschallgestëtzte filtergestëtzte Proufvirbereedung (FASP): Verbesserung vu proteomeschen Aarbechtsofleef duerch fortgeschratt Ultraschallbeschallung
Déi ultraschallgestëtzte filtergestëtzte Proufvirbereedung (FASP) etabléiert sech als eng héich effizient a reproduzéierbar Method an der moderner Proteomik. Duerch d’Integratioun vu kontrolléierter Ultraschallbeschallung an etabléiert FASP-Aarbechtsofleef kënne Fuerscher d’Proteinextraktioun, d’Verdauungseffizienz an d’allgemeng Datequalitéit däitlech verbesseren. Mat der wuessender Nofro no reproduzéierbarer Proufvirbereedung mat héijem Proufduerchsaz gewannen Apparater fir fokusséiert Ultraschallbeschallung, wéi de Mikroplacken-Ultraschallapparat UIP400MTP, u wëssenschaftlecher a praktescher Relevanz.
Wëssenschaftleche Kontext: Firwat FASP an der Proteomik wichteg ass
Déi filtergestëtzte Proufvirbereedung (FASP) huet sech an der Bottom-up-Proteomik als Goldstandard etabléiert, well si Detergenzien, Salzer an aner Veronrengegunge ewechhuele kann a gläichzäiteg eng effizient enzymatesch Verdauung erméiglecht. Klassesch FASP-Protokoller stoussen awer dacks op Grenzen duerch onvollstänneg Lys, ongläichméisseg Verdauung a Variabilitéit vun de Prouwen – besonnesch bei komplexen oder resistente biologeschen Zellen oder Gewëss.
Hei bitt fokusséiert Ultraschallenergie (Ultraschallbeschallung) en entscheedende Virdeel. Duerch d’Erzeuge vu mechanesche Schéierkräften a Kavitatioun verbessert d’Ultraschallbeschallung verschidde kritesch Schrëtt am FASP-Aarbechtsoflaf, ouni d’Integritéit vun de Proteinnen ze beanträchtegen.
Ultraschallapparat UIP400MTP fir Multiwell-Placken erliichtert d’filtergestëtzte Proufvirbereedung (FASP)
Déi positiv Auswierkunge vun der Ultraschallbeschallung bei ultraschallgestëtzter FASP
D’Ultraschallbeschallung erzeugt kontrolléiert akustesch Kavitatioun – d’Bildung an de Kollaps vu mikroskopesche Blosen –, déi lokal Schéierkräften a Mikrostréimungen ervirrifft.
D’Ultraschallbeschallung verbessert souwuel d’Alkyléierungs- wéi och d’Verdauungsschrëtt bei ultraschallgestëtzter FASP, andeems si de Stofftransport verbessert an d’Reaktiounskinetik beschleunegt. D’Uwende vun Ultraschallenergie erzeugt Kavitatioun, déi zu lokale Mikrostréimungen a kuerzzäitege Schéierkräfte féiert, déi eng séier Vermëschung an en effikast Andrénge vun de Reagenzien an d’Proteinmatrix oder an d’Ëmgéigend vum Filter fërderen. Wärend der Alkyléierung féiert dëst zu enger méi gläichméisseger a méi séierer Modifikatioun vun de Cysteinreschter duerch Iodacetamid. Beim Verdauungsschrëtt erhéicht d’Ultraschallbeschallung d’Zougänglechkeet vun de proteolytesche Spaltungsplazen a verbessert d’Enzym–Substrat-Interaktiounen, wouduerch si d’Trypsinaktivitéit beschleunegt an d’Verdauungseffizienz verbessert. Insgesamt verkierzt d’Ultraschallbehandlung d’Veraarbechtungszäit, wärend d’Vollstännegkeet vun der Reaktioun an d’Reproduzéierbarkeet erhale bleiwen oder verbessert ginn.
Bei der Proufvirbereedung fir d’Proteomik féiert ultraschallgestëtzte FASP zu:
- Méi effizientem Zellopbroch a méi effizienter Proteinextraktioun, och a widderstandsfäege Gewëss oder mikrobielle Prouwen
- Verbesserter Solubiliséierung vu Proteinnen
- Verbesserter Zougänglechkeet fir Enzymer wärend der Verdauung
- Verkierzter Veraarbechtungszäit a méi héijer Reproduzéierbarkeet
Am Géigesaz zu konventionelle mechaneschen oder cheemesche Lysmethoden ass d’Ultraschallveraarbechtung a ganz héijem Mooss kontrolléierbar a skaléierbar, wat si besonnesch gëeegent fir standardiséiert Aarbechtsofleef an der Proteomik mécht.
Virdeeler vun ultraschallgestëtzter FASP géintiwwer konventionellen Usätz
D’Integratioun vun der Ultraschallbeschallung a FASP-Protokoller bitt moossbar Virdeeler, déi sech direkt op d’Resultater vun der uschléissender Massespektrometrie auswierken.
Ultraschallgestëtzte FASP erméiglecht eng méi vollstänneg Réckgewënnung vu Proteinnen, besonnesch aus usprochsvolle Prouwe wéi faserhaltege Gewëss oder Biofilmer. Déi gläichméisseg Energieverdeelung garantéiert eng eenheetlech Behandlung vun de Replikater a reduzéiert domat d’Variabilitéit – eng wesentlech Viraussetzung fir quantitativ Proteomik.
Zousätzlech beschleunegt d’Ultraschallbeschallung d’Verdauungskinetik, andeems si d’Enzym–Substrat-Interaktioun verbessert. Dëst féiert dacks zu méi kuerze Verdauungszäiten an enger méi héijer Peptidausbezuelung, wärend d’Sequenzofdeckung erhale bleift.
Wat den Aarbechtsoflaf ugeet, reduzéieren Ultraschallsystemer manuell Agrëffer a maachen aggressiv cheemesch Behandlungen iwwerflësseg, wouduerch d’Integritéit vun de Prouwen erhale bleift an d’Standardiséierung vun de Protokoller vereinfacht gëtt.
Venn-Diagramm, dat déi méi héich Zuel vun identifizéierte Proteinnen duerch ultraschallgestëtzte FASP am Verglach mat FASP iwwer Nuecht weist
Bild a Studie: ©Carvalho et al., 2020
Ultraschallapparat UIP400MTP fir Multiwell-Placke fir déi filtergestëtzte Proufvirbereedung (FASP)
Protokoll: Ultraschall-FASP mat héijem Proufduerchsaz mam UIP400MTP
Fir Laboratoiren, déi grouss Proufkohorte verschaffen, erméiglecht den Ultraschallapparat UIP400MTP fir Mikroplacken déi gläichzäiteg Ultraschallbehandlung vu Standard-Multiwell-Placken (z. B. 96-Well-Placken), wat de Proufduerchsaz an d’Reproduzéierbarkeet däitlech erhéicht.
An dësem Format ginn d’Prouwen (typesch 50–200 µL pro Well) direkt a Mikroplacke virbereet, déi mat Ultrafiltratioun oder der uschléissender Veraarbechtung kompatibel sinn. D’Lysepuffere sinn änlech wéi déi, déi a Standard-FASP-Protokoller benotzt ginn.
Den UIP400MTP bréngt gläichméisseg Ultraschallenergie an all d’Wells an. D’Ultraschallbehandlung gëtt typescherweis bei 60–80% Amplitüd fir 2–4 Minutten duerchgefouert, jee no Prouftyp. Iwwerwaacht d’Temperatur mam ustiechbaren Temperatursensor. Benotzt gepulsten Ultraschall an optional e Laborkillapparat.
Beispillprotokoll:
- Fir den Alkyléierungsschrëtt ginn d’Prouwe mam Ultraschallapparat fir Mikroplacken (UIP400MTP) bei 40% Amplitüd iwwer 7 Zykle mat Ultraschall behandelt (30 s UN, 15 s AUS; Gesamtzäit vun der Ultraschallbehandlung: 5 min 45 s).
- No der Ultraschallbehandlung gëtt d’Iodacetamid-Léisung (IAA) duerch Zentrifugatioun ewechgeholl. Virun der Trypsinverdauung mussen d’Prouwe gewäsch ginn, fir Reschter vun Harnstoff ze entfernen, engem staarke chaotrope Mëttel, dat d’enzymatesch Aktivitéit hemmt. Dofir ginn d’Prouwen zweemol mat 200 μL vu 25 mM Ammoniumhydrogencarbonat (AmBic) gewäsch.
- Uschléissend ginn 100 μL Trypsinléisung (Enzym-zu-Protein-Verhältnis vun 1:30), déi an 12,5 mM Ammoniumhydrogencarbonat preparéiert gouf, dobäiginn. D’Proteinverdauung gëtt duerno mam UIP400MTP ënner de selwechte Bedéngunge fir d’Ultraschallbehandlung duerchgefouert (40% Amplitüd, 7 Zyklen, 30 s UN / 15 s AUS; Gesamtzäit: 5 min 45 s).
- No der Ultraschallbehandlung ginn d’Prouwen op Filterplacken iwwerdroen oder mat plackebaséierte FASP-Systemer verschafft. D’Reduktiouns- an d’Alkyléierungsschrëtt ginn an der Plack duerchgefouert, wouduerch e rationellen Aarbechtsoflaf erhale bleift.
- D’Trypsinverdauung gëtt ënner kontrolléierte Bedéngungen duerchgefouert (z. B. 37°C, 4–16 Stonnen), mat der Méiglechkeet vun enger kuerzer Ultraschallstimulatioun, fir d’enzymatesch Aktivitéit ze beschleunegen an d’Peptidausbezuelung ze verbesseren.
- D’Peptide ginn duerch Zentrifugatioun zeréckgewonnen a si prett fir d’LC-MS/MS-Analys.
De wichtegste Virdeel vun dësem System läit a senger Fäegkeet, identesch Veraarbechtungsbedéngungen an alle Wells ze bidden, wat Chargeneffekter miniméiert a robust quantitativ Vergläicher a grouss ugeluechte Proteomikstudien erméiglecht.
De VialTweeter Ultraschallapparat fir méi Proufréier beschleunegt a verbessert déi filtergestëtzte Proufvirbereedung (FASP) an der Proteomik
Wëssenschaftlech Relevanz
D’Integratioun vun der Ultraschallbehandlung a FASP-Aarbechtsofleef ass méi wéi nëmmen eng technesch Verfeinerung – si stellt e methodologesche Fortschrëtt an der Proufvirbereedung fir d’Proteomik duer. Well sech dëst Fachgebitt a Richtung vun engem méi héije Proufduerchsaz, Automatiséierung a Reproduzéierbarkeet entwéckelt, ginn Ultraschalltechnologië grondleeënd Enkpäss an der Proufveraarbechtung un.
Rezent Studien ënnersträichen ëmmer méi, wéi wichteg eng eenheetlech Proufvirbereedung fir déi zouverlässeg Entdeckung vu Biomarkeren an déi quantitativ Proteomik ass. Ultraschall-FASP dréit direkt zu dësem Zil bäi, andeems d’Extraktiounseffizienz, d’Eenheetlechkeet vun der Verdauung an d’Robustheet vum gesamten Aarbechtsoflaf verbessert ginn.
Ausserdeem entsprécht d’Skaléierbarkeet vun Ultraschallsystemer – vun eenzele Prouffläschere mam VialTweeter bis zu komplette Mikroplacke mam UIP400MTP – der wuessender Nofro souwuel no explorative Proteomikstudien ewéi och no Proteomikstudie mat grousse Kohorten.
Besuergt Iech en Ultraschallapparat, fir Äre FASP-Aarbechtsoflaf ze vereinfachen!
Déi ultraschallgestëtzte filtergestëtzte Proufvirbereedung verbënnt déi bewäert Stäerkte vu FASP mat de physikalesche Virdeeler vun der Ultraschallbehandlung. Duerch eng verstäerkt Lys, eng verbessert Verdauung an d’Standardiséierung vun Aarbechtsofleef bidden Ultraschallsystemer eng leeschtungsstaark Léisung fir déi modern Proteomik.
De VialTweeter Ultraschallapparat fir méi Proufréier an den UIP400MTP Ultraschallapparat fir Mikroplacke weisen exemplaresch, wéi fokusséiert Ultraschallenergie déi routineméisseg Proufvirbereedung an e méi effizienten, reproduzéierbaren a wëssenschaftlech robuste Prozess verwandele kann – wat schlussendlech zu Proteomikdate vu méi héijer Qualitéit a méi déiwe biologeschen Erkenntnesser féiert.
Wielt de passendsten Ultraschallapparat fir Är filterënnerstëtzt Proufpräparatioun
| Modell vum Ultraschallapparat | Virdeeler fir FASP | Beschten Asaz |
| UIP400MTP Ultraschallapparat fir Mikroplacken | Gläichméisseg Ultraschallbehandlung iwwer ganz Mikroplacken; héich reproduzéierbaren Energieantrag; beschleunegt d’Alkyléierung an d’enzymatesch Verdauung an Aarbechtsofleef mat héijem Proufduerchsaz; kompatibel mat automatiséierter Proufpräparatioun. | FASP-Aarbechtsofleef mat héijem Proufduerchsaz a Plackeformater mat 96 Vertiefungen oder änleche Formater, dorënner Screeningapplikatiounen an der Proteomik. |
| VialTweeter Ultraschallapparat fir méi Proufréier | Gläichzäiteg, gläichméisseg Ultraschallbehandlung vu méi zouene Proufréier; miniméiert d’Kräizkontaminatioun an de Proufverloscht; verbessert d’Andrénge vun de Reagenzien an d’Vermëschung, wouduerch d’Effizienz vun der Alkyléierung an der Verdauung verbessert gëtt. | Parallel Veraarbechtung vu méi FASP-Prouwe mat mëttlerem Proufduerchsaz an héijer Reproduzéierbarkeet. |
| CupHorn (indirekt Ultraschallbehandlung am “Bad mat héijer Intensitéit” fir dicht verschlosse Proufréier) | Indirekt Ultraschallbehandlung mat héijer Intensitéit fir dicht verschlosse Gefässer; exzellent Temperaturkontroll a kontaminatiounsfräi Veraarbechtung; fërdert en effiziente Stofftransport ouni direkte Kontakt mat der Sond. | Veraarbechtung vu Proufmaterial a verschiddene Proufbehälter / empfindlech oder geféierlech Prouwen, déi zoue Behälter an eng gläichméisseg Energieverdeelung erfuerderen. |
| Ultraschallapparater mat Sond fir de Laboratoire (direkt Ultraschallbehandlung) | Maximal Ultraschallintensitéit an Energieiwwerdroung; séieren Opschloss a Beschleunegung vu Reaktiounen; wierksam fir schwéier verdaubar oder héichkomplex Proteinprouwen. | Veraarbechtung vun eenzele Prouwen, méi grouss Prouwen oder usprochsvoll Matricen, bei deene maximal Leeschtung a Geschwindegkeet erfuerderlech sinn. |
Design, Fabrikatioun a Berodung – Qualitéit aus Däitschland
D’Ultraschallapparater vun Hielscher si fir hir héchst Qualitéits- an Designstandarde bekannt. Robustheet an einfach Bedéngung erméiglechen eng reiwungslos Integratioun vun eisen Ultraschallapparater an industriell Anlagen. D’Ultraschallapparater vun Hielscher gi liicht mat haarde Bedéngungen an usprochsvollen Ëmfelder eens.
Hielscher Ultrasonics ass en ISO-zertifizéiert Betrib a leet besonnesche Wäert op héichleeschtungsfäeg Ultraschallapparater mat modernster Technologie a Benotzerfrëndlechkeet. Selbstverständlech sinn d’Ultraschallapparater vun Hielscher CE-konform an erfëllen d’Ufuerderunge vun UL, CSA a RoHs.
Heefeg gestallte Froen
Fir wat gëtt d’filterënnerstëtzt Proufpräparatioun benotzt?
D’filterënnerstëtzt Proufpräparatioun (FASP) gëtt fir d’Präparatioun vu Proteinprouwe fir proteomesch Analysen op Basis vun der Massespektrometrie benotzt. Si erméiglecht eng effizient Entfernung vun Detergenzien, Salzer an anere Veronrengegunge mat niddregem Molekulargewiicht, wärend d’Proteinen op engem Filter mat enger Molekulargewiichtsgrenz zeréckgehale ginn, wou si denaturéiert, reduzéiert, alkyléiert an enzymatesch zu Peptide verdaut kënne ginn, déi fir d’LC–MS/MS-Analys gëeegent sinn.
Wat sinn d’Virdeeler vu FASP an der Proteomik?
D’Haaptvirdeeler vu FASP an der Proteomik sinn d’Fäegkeet, komplex an detergentieräich Prouwen ze verschaffen an dobäi héichreng Peptidmëschungen ze produzéieren, déi mat der Massespektrometrie kompatibel sinn. FASP verbessert d’Verdauungseffizienz an d’Reproduzéierbarkeet, andeems d’Reaktiounen an engem raimlech begrenzte Filterëmfeld duerchgefouert ginn, reduzéiert de Proufverloscht am Verglach mat Methoden op Basis vu Fällung an erméiglecht en effektive Pufferaustausch. Insgesamt verbessert FASP d’Peptidréckgewënnung, d’Datequalitéit an d’Proteomofdeckung, wouduerch et e robusten a wäit verbreeten Aarbechtsoflaf an der Bottom-up-Proteomik ass.
Literatur / Referenzen
-
FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
- Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
- Walter, J., Monthoux, C., Fortes, C. et al. (2020): The bovine cumulus proteome is influenced by maturation condition and maturational competence of the oocyte. Scientific Reports 10, 9880 (2020).
De kontaktfräien Ultraschallapparat UIP400MTP vereinfacht FASP a Placke mat 96 Vertiefungen
Hielscher Ultrasonics produzéiert héichleeschtungsfäeg Ultraschallhomogenisateure vun der Laborgréisst bis zur Industriegréisst.