Proteomesch Workflows mat High-Throughput Protein Verdauung

Proteomics ass e wesentlecht Feld fir biologesch Prozesser a Systemer ze verstoen, mat Protein Verdauung e kritesche Schrëtt a senge Workflows. Traditionell gëtt Protein Verdauung a Léisung duerchgefouert mat proteolyteschen Enzyme wéi Trypsin, déi speziell Peptidbindunge bei Lysin an Argininreschter hydrolyséiert. Dëse Prozess generéiert Peptiden gutt gëeegent fir Ioniséierung a Fragmentatioun a Massespektrometrie (MS) Uwendungen. Wéi och ëmmer, konventionell Verdauungsmethoden erfuerderen 12-24 Stonnen fir d'Vervollstännegung z'erreechen, wat bedeitend Flaschenhalsen an proteomesche Workflows erstellt.
Ultrasonication bitt eng mächteg Alternativ, dramatesch verkierzt Verdauungszäite vu Stonnen op nëmmen e puer Minutten. Wann kombinéiert mat fortgeschratt Multi-Sample-Sonicatoren wéi den Hielscher CupHorn, VialTweeter, an den 96-Well Platte-Sonicator UIP400MTP, erlaabt d'Ultraschall eng beschleunegt, High-Throughput-Proteomik. Dës Technologien streamline Workflows, reduzéieren d'Probe Virbereedungszäit an d'Effizienz erhéijen ouni d'Reproducibilitéit oder d'Datequalitéit ze kompromittéieren.

D'Roll vun der Ultraschallenergie bei der Protein Verdauung

Ultrasonication beschäftegt fokusséiert Ultraschallwellen fir Kavitatioun ze kreéieren - lokaliséiert Mikrobubbles déi zesummeklappen fir intensiv Schéierkräften ze generéieren. Dëst Phänomen verbessert d'Masstransfer, fördert d'Vermëschung vun Enzymen mat Substrate, an entfalen Proteinstrukturen, exponéiert Spaltplazen op proteolytesch Enzyme wéi Trypsin.
D'Resultat? Eng bedeitend Reduktioun vun der Verdauungszäit ouni d'Effizienz oder d'Reproduktioun ze kompromittéieren.

Ultrasonic-Enhanced Proteolytic Digestion: Methodologie a Resultater

Accelerated Digestion Protokoll

Ultraschall-assistéiert Verdauung kombinéiert proteolytesch Enzyme an Ultraschallenergie fir Workflows ze beschleunegen. Zum Beispill, mam Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz) benotzt de Verdauungsworkflow wéi follegt:

1. Reduktioun: Protein Echantillon (0,5 mg / ml, 20 μL) gi mat DTT (2 μL, 110 mM) an Ammoniumbikarbonat-Puffer (12,5 mM) behandelt. Sonication gëtt bei 50% Amplitude fir 5 Minutten applizéiert.
2. Alkylatioun: Nodeems Dir IAA (2 μL, 400 mM) bäigefüügt huet, gëtt d'Sonicatioun ënner de selwechte Konditioune widderholl.
3. Verdauung: Echantillon gi verdënntem an inkubéiert mat immobiliséierten Trypsin Nanopartikelen. Eng lescht Ronn vun der Sonikatioun (5 Minutten) fäerdeg d'Verdauung. Peptiden ginn getrennt, gedréchent a gespäichert fir MS Analyse.

Dës Ultraschallmethod reduzéiert d'Gesamtpräparatiounszäit vun 12 Stonnen op ënner 30 Minutten. Trotz dem beschleunegten Prozess bleiwen d'Peptid-Ausbezuelung an d'Qualitéit konsequent mat traditionelle Iwwernuechtungsmethoden.

Effizienz vun Ultraschall Protein Verdauung

An komparative Studien mat E. coli Proteome:

• Protein Identifikatioun: Ultraschall verdaut Proben identifizéiert 777 Proteinen a 5 Minutten, am Verglach zu 817 an 12 Stonnen. Shared Protein Identifikatiounen iwwerschratt 70%.
• Reproduktioun: Replikatanalysen hunn Korrelatiounswäerter iwwer 98% bannent all Method gewisen, wat Zouverlässegkeet beweist.
• Selektivitéit: Verschidde Proteine goufen préférentiell vun all Method verdaut, mat Ultraschall Verdauung favoriséiert 65 Proteinen an Iwwernuechtung Verdauung 54 Proteinen. Esou nuancéiert Differenzen ënnersträichen den eenzegaartege Potenzial vun der Ultraschall fir spezifesch Uwendungen.

Label-gratis Protein Quantifikatioun Resultater vu siwen spiked Proteinen an en E. coli
Echantillon. Déi folgend Proteine goufen op zwee verschiddene Niveauen bäigefüügt wéi an der Kolonn bemierkt
"Theo Ratio" genannt. Theo Ratio ass den theoretesche Verhältnis tëscht den zwee Niveauen, déi an dësem benotzt ginn
experimentéieren. Bovine Serum Albumin (ALBU), β-Laktoglobulin (LACB), α-S1 Kasein (CASA1),
α-S2 Kasein (CASA2), Cytochrom c (CYC), ovalbumin (OVAL) a Kuelestoffanhydrase 2
(CAH2). Verhältnisser goufen berechent mat LFQ Proteinintensitéiten aus MaxQuant kritt
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
Etude a Grafik: © Martins et al., 2019)

Nanopartikel-Immobiliséiert Trypsin

D'Integratioun vun immobiliséierten Trypsin Nanopartikelen (zB T-FMNPs) mat Ultraschall verbessert d'Proteomik Workflows weider. Dës Nanopartikele bidden eng héich Uewerfläch fir Enzym-Substrat Interaktiounen, erhéijen d'Effizienz. Wann op komplexe Proteome applizéiert gëtt, wéi E. coli, erreecht déi kombinéiert Method:

• Geschwindegkeet: Komplett Verdauung bannent 5 Minutten.
• Genauegkeet: Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• Skalierbarkeet: Adaptatioun op Multi-Well Plattformen wéi den UIP400MTP erméiglecht High-Throughput Veraarbechtung.

Klickt hei fir den detailléierte Protokoll mat Schrëtt-fir-Schrëtt Instruktiounen!
(cf. Martins et al., 2019)

Proteolytesch Verdauung mat héijer Geschwindegkeet an High-Throughput mat Hielscher-Sonicatoren

Déi Bescht Sonicator Modeller fir Proteomics

Hielscher Ultrasonics bitt verschidde Sonicator Modeller fir simultan Multi-Sample Virbereedung, déi High-Throughput Workflows erliichteren. Egal ob Dir mat Fläschen, Reagenzglieser, Multi-Well Placken (zB 6-, 24-, 96-Well Placken) oder Petri Platen schafft – mir bidden Iech déi ideal sonicators fir Är Experimenter.

UIP400MTP Multi-Well Platen Sonicator

Fir den ultimativen Duerchgang bitt den UIP400MTP d'Fäegkeet fir 96-Well Placke Ultraschall ze veraarbecht. Kompatibel mat all Standard Mikroplack, erfuerdert den UIP400MTP keng deier propriétaire Wegwerfer a gëtt Iech d'Fräiheet fir déi bescht Multi-Well Plack fir Är Fuerschung ze wielen. Andeems Dir eenheetlech Energie iwwer d'Plack liwwert, erméiglecht et séier Reduktioun, Alkyléierung a Verdauung vu bis zu 200 komplexe Proteome an nëmmen 1 Stonn. Dësen Niveau vun der Automatiséierung an Effizienz ass entscheedend fir High-Throughput Proteomics a klinesch Uwendungen. Léiert méi iwwer de Multi-Well Platte Sonicator!

VialTweeter

De VialTweeter ass fir Laboratoiren ugepasst, déi d'simultan Sonikatioun vu bis zu 10 Fläschen oder Reagenzglies erfuerderen. Seng net-invasiv Approche eliminéiert Kräizkontaminatiounsrisiken wärend reproduzéierbar Protein Verdauung assuréiert. Dësen Apparat ass ideal fir Fuerscher, déi mat limitéierten Probevolumen oder verschiddenste Probetypen schaffen.
Léiert méi iwwer de VialTweeter Multi-Tube Sonicator!

Hielscher UP200 St-CupHorn

De CupHorn Sonicator ass e mächtege Gerät entworf fir gläichzäiteg Veraarbechtung vu verschidde Proben a versiegelte Container. Et garantéiert eenheetlech Ultraschallenergieverdeelung a präzis Temperaturkontrolle. D'Kapazitéit fir bis zu fënnef Proben gläichzäiteg ze veraarbecht, gekoppelt mat senger Kompatibilitéit mat reduzéierten, alkyléierten a verdaute Workflows, mécht de CupHorn en zouverléisseg Tool fir MS-baséiert Proteomik.
Léiert méi iwwer de CupHorn SonoReactor!

Schrëtt-fir-Schrëtt Protokoll fir Ultraschall-Assistéiert Proteolytesch Verdauung Mat Nanopartikel-Immobiliséierter Trypsin

Dëse Protokoll vum Martins et al. (2019) ass optimiséiert fir séier Protein Verdauung mat Ultraschallenergie an Nanopartikel-immobiliséiert Trypsin (T-FMNPs). Déi skizzéiert Schrëtt garantéieren effizient Reduktioun, Alkyléierung a Proteolyse gëeegent fir Massespektrometrie (MS) Uwendungen.
Protokoll Schrëtt

1. Reduktioun vun Disulfide Bonds
   • Füügt 2 μL DTT Léisung (110 mM) an d'20 μL Proteinprobe (0.5 mg / mL) am AmBic Puffer.
   • Setzt de Proberöhre am Sonoreactor UP200St-CupHorn.
   • Sonicate d'Probe fir 2,5 Minutten bei 50% Amplituden (200 W, 26 kHz).
   • Paus fir e kuerzen Intervall fir ze killen, dann sonicate fir eng aner 2,5 Minutten ënner de selwechte Konditiounen.
2. Alkylatioun vu reduzéierten Cysteinresiduen
   • Füügt 2 μL IAA Léisung (400 mM) op déi reduzéiert Proteinprobe.
   • Sonicate fir 2,5 Minutten bei 50% Amplitude fir d'Alkylatioun ze erliichteren.
   • Paus fir ze killen, dann sonicate fir eng zousätzlech 2,5 Minutten.

   Notiz: Miniméiert d'Belaaschtung vun der alkyléierter Probe u Liicht fir IAA-Degradatioun ze vermeiden.

3. Probe Verdünnung
   • Verdünnt d'alkyléiert Proteinprobe op e Finalvolumen vun 100 μL mat 25 mM AmBic Puffer mat 4% Acetonitril (v/v).
   • Mix grëndlech duerch sanft Pipetting.
4. Proteolytesch Verdauung mat Nanopartikel-Immobiliséierter Trypsin
   • Füügt 20 μL T-FMNP Léisung (3 mg / ml) an d'verdünnte Proteinprobe.
   • Sonicate d'Mëschung am Sonoreactor fir 2,5 Minutten bei 50% Amplitude.
   • Paus fir ze killen, dann sonicate fir eng aner 2,5 Minutten ënner de selwechte Konditiounen.
5. Trennung vun Trypsin Nanopartikelen
   • Benotzt e Magnéit fir d'T-FMNPs vum Supernatant ze trennen deen verdaut Peptiden enthält.
   • Transfert de Supernatant an en neit Mikrocentrifuge-Röhre.
6. Peptid Virbereedung fir MS Analyse
   • Dréchent de Supernatant mat Peptiden an enger Vakuum Zentrifuge.
   • Späichert déi gedréchent Peptiden bei -20 ° C bis weider Analyse duerch Massespektrometrie.