Proteomesch Aarbechtsofleef mat Proteinverdauung mat héijem Proufduerchsaz

D’Proteomik ass e wesentlecht Fachgebitt fir biologesch Prozesser a Systemer ze verstoen, woubäi d’Proteinverdauung e kritesche Schrëtt an hiren Aarbechtsofleef duerstellt. Traditionell gëtt d’Proteinverdauung a Léisung mat proteolyteschen Enzyme wéi Trypsin duerchgefouert, dat spezifesch Peptidbindungen u Lysin- an Argininreschter hydrolyséiert. Dëse Prozess produzéiert Peptiden, déi sech gutt fir d’Ioniséierung an d’Fragmentéierung bei Uwendunge vun der Massespektrometrie (MS) eegnen. Konventionell Verdauungsmethoden brauchen awer 12–24 Stonnen, bis d’Verdauung ofgeschloss ass, wat bedeitend Enkpäss a proteomeschen Aarbechtsofleef verursaacht.
D’Ultraschallbehandlung bitt eng leeschtungsstaark Alternativ, déi d’Verdauungszäite vun e puer Stonnen op nëmmen e puer Minutten drastesch verkierzt. A Kombinatioun mat fortschrëttlechen Ultraschallapparater fir méi Prouwe wéi dem Hielscher CupHorn, dem VialTweeter an dem Ultraschallapparat UIP400MTP fir Placke mat 96 Vertiefungen erméiglecht d’Ultraschallbehandlung eng beschleunegt Proteomik mat héijem Proufduerchsaz. Dës Technologien vereinfachen d’Aarbechtsofleef, verkierzen d’Proufvirbereedungszäit an erhéijen d’Effizienz, ouni d’Reproduzéierbarkeet oder d’Datequalitéit ze beeinträchtegen.

D’Roll vun der Ultraschallenergie bei der Proteinverdauung

D’Ultraschallbehandlung benotzt fokusséiert Ultraschallwelle fir Kavitatioun ze erzeugen – lokal begrenzt Mikroblosen, déi zesummefalen an dobäi intensiv Schéierkräfte generéieren. Dëst Phenomeen verbessert de Massentransport, fërdert d’Vermëschung vun Enzyme mat Substrater an entf离t Proteinstrukturen, wouduerch Spaltungsplaze fir proteolytesch Enzyme wéi Trypsin zougänglech ginn.
D’Resultat? Eng bedeitend Verkierzung vun der Verdauungszäit, ouni d’Effizienz oder d’Reproduzéierbarkeet ze beeinträchtegen.

Duerch Ultraschall verstäerkt proteolytesch Verdauung: Methodik a Resultater

Protokoll fir eng beschleunegt Verdauung

Duerch Ultraschall ënnerstëtzt Verdauung kombinéiert proteolytesch Enzymen an Ultraschallenergie, fir d’Aarbechtsofleef ze beschleunegen. Beim Asaz vum Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz) leeft d’Verdauung zum Beispill follgendermoossen of:

1. Reduktioun: Proteinprouwen (0,5 mg/mL, 20 µL) gi mat DTT (2 µL, 110 mM) an engem Ammoniumhydrogencarbonatpuffer (12,5 mM) behandelt. D’Ultraschallbehandlung gëtt bei 50% Amplitud fir 5 Minutten duerchgefouert.
2. Alkyléierung: Nom Bäisetze vun IAA (2 µL, 400 mM) gëtt d’Ultraschallbehandlung ënner de selwechte Bedéngunge widderholl.
3. Verdauung: D’Prouwe gi verdënnt a mat Nanopartikelen, un deenen Trypsin immobiliséiert ass, inkubéiert. Eng lescht Ultraschallbehandlung (5 Minutten) schléisst d’Verdauung of. D’Peptide gi getrennt, gedréchent a fir d’MS-Analys gelagert.

Dës Ultraschallmethod reduzéiert d’Gesamtvirbereedungszäit vun 12 Stonnen op ënner 30 Minutten. Trotz dem beschleunegte Prozess bleiwen d’Peptidausbezuelung an d’Qualitéit mat deenen aus traditionelle Methoden iwwer Nuecht vergläichbar.

Effizienz vun der Proteinverdauung duerch Ultraschall

A vergläichende Studie mat E. coli-Proteomen:

• Proteinidentifikatioun: Mat duerch Ultraschall verdauten Prouwe goufen 777 Proteinnen a 5 Minutten identifizéiert, am Verglach zu 817 an 12 Stonnen. Den Undeel vun de Proteinidentifikatiounen, déi béid Methode gemeinsam haten, louch iwwer 70%.
• Reproduzéierbarkeet: Widderhuelungsanalysen hu bannent all Method Korrelatiounswäerter iwwer 98% gewisen, wat d’Zouverlässegkeet beleet.
• Selektivitéit: All Method huet bestëmmt Proteinne bevorzugt verdaut, woubäi d’Ultraschallverdauung 65 Proteinnen an d’Verdauung iwwer Nuecht 54 Proteinne favoriséiert huet. Esou nuancéiert Ënnerscheeder ënnersträichen dat eenzegaartegt Potenzial vun der Ultraschallbehandlung fir spezifesch Uwendungen.

Resultater vun der markéierungsfräier Proteinquantifizéierung vu siwe Proteinnen, déi enger E. coli
Prouf bäigesat goufen. Déi folgend Proteinne goufen op zwou ënnerschiddlechen Niveaue bäigesat, wéi an der Kolonn
mam Numm “Theo Ratio” uginn ass. Theo Ratio ass dat theoretescht Verhältnis tëscht deenen zwee Niveauen, déi an dësem
Experiment benotzt goufen. Rannerserumalbumin (ALBU), β-Laktoglobulin (LACB), α-S1-Kasein (CASA1),
α-S2-Kasein (CASA2), Cytochrom c (CYC), Ovalbumin (OVAL) a Kuelesaieranhydrase 2
(CAH2). D’Verhältnisser goufen op Basis vun de LFQ-Proteinintensitéite berechent, déi bei der Analys mat MaxQuant
ermëttelt goufen. Den t-Test nom Student gouf benotzt, fir d’Wäerter ze vergläichen, déi mat all Method ermëttelt goufen (p>0,01, n=3, t-theoretesch=4,6).
Studie a Grafik: © Martins et al., 2019)

Un Nanopartikelen immobiliséierten Trypsin

D’Kombinatioun vun Nanopartikele mat immobiliséiertem Trypsin (z. B. T-FMNPs) an Ultraschallbehandlung verbessert d’Aarbechtsofleef an der Proteomik weider. Dës Nanopartikele bidden eng grouss Uewerfläch fir Enzym-Substrat-Interaktiounen, wat d’Effizienz erhéicht. Bei der Uwendung op komplex Proteomer, wéi déi vun E. coli, erreecht déi kombinéiert Method:

• Vitess: Vollstänneg Verdauung bannent 5 Minutten.
• Genauegkeet: Eng Proteinquantifizéierung, déi mat där vun traditionelle Methode vergläichbar ass (p > 0,01, n=3).
• Skaléierbarkeet: D’Upassung u Multiwell-Plattforme wéi den UIP400MTP erméiglecht eng Veraarbechtung mat héijem Prouwenduerchsaz.

Klickt hei fir den detailléierte Protokoll mat Schrëtt-fir-Schrëtt-Uweisungen!
(kuckt Martins et al., 2019)

Proteolytesch Verdauung mat héijer Vitess an héijem Prouwenduerchsaz mat Hielscher Ultraschallapparater

Déi bescht Ultraschallmodeller fir d’Proteomik

Hielscher Ultrasonics bitt verschidden Ultraschallmodeller fir déi gläichzäiteg Preparatioun vu méi Prouwen un, déi Aarbechtsofleef mat héijem Prouwenduerchsaz erliichteren. Egal ob Dir mat Vialen, Reagenzglieser, Multiwell-Placken (z. B. Placke mat 6, 24 oder 96 Wells) oder Petrischaffe schafft – mir bidden Iech déi ideal Ultraschallapparater fir Är Experimenter.

UIP400MTP Ultraschallapparat fir Multiwell-Placken

Fir maximalen Prouwenduerchsaz bitt den UIP400MTP d’Méiglechkeet, Placke mat 96 Wells mat Ultraschall ze behandelen. Den UIP400MTP ass mat all Standard-Mikroplack kompatibel, brauch keng deier proprietär Ewechgeheitartikelen a gëtt Iech d’Fräiheet, déi bescht Multiwell-Plack fir Är Fuerschung ze wielen. Duerch eng gläichméisseg Energieiwwerdroung iwwer déi ganz Plack erméiglecht en eng séier Reduktioun, Alkyléierung a Verdauung vu bis zu 200 komplexe Proteomer an nëmmen 1 Stonn. Dëse Grad un Automatiséierung an Effizienz ass entscheedend fir Proteomik mat héijem Prouwenduerchsaz a fir klinesch Uwendungen. Léiert méi iwwer den Ultraschallapparat fir Multiwell-Placken!

VialTweeter

De VialTweeter ass op Laboratoiren zougeschnidden, déi bis zu 10 Vialen oder Reagenzglieser gläichzäiteg mat Ultraschall behandele mussen. Seng netinvasiv Approche eliminéiert d’Risike vu Kräizkontaminatioun a garantéiert gläichzäiteg eng reproduzéierbar Proteinverdauung. Dësen Apparat ass ideal fir Fuerscher, déi mat begrenzte Proufvolumen oder verschiddene Prouftyppe schaffen.
Léiert méi iwwer de VialTweeter Ultraschallapparat fir méi Réier!

Hielscher UP200St-CupHorn

De CupHorn Ultraschallapparat ass e leeschtungsstaarken Apparat fir déi gläichzäiteg Veraarbechtung vu méi Prouwen a versigelte Behälter. E garantéiert eng gläichméisseg Verdeelung vun der Ultraschallenergie an eng präzis Temperaturkontroll. D’Méiglechkeet, bis zu fënnef Prouwe gläichzäiteg ze verschaffen, zesumme mat senger Kompatibilitéit mat Aarbechtsofleef fir Reduktioun, Alkyléierung a Verdauung, mécht de CupHorn zu engem zouverlässegen Instrument fir MS-baséiert Proteomik.
Léiert méi iwwer de CupHorn SonoReactor!

Schrëtt-fir-Schrëtt-Protokoll fir ultraschallënnerstëtzt proteolytesch Verdauung mat Trypsin, dat op Nanopartikelen immobiliséiert ass

Dëse Protokoll vu Martins et al. (2019) ass fir eng séier Proteinverdauung mat Ultraschallenergie an Trypsin, dat op Nanopartikelen immobiliséiert ass (T-FMNPs), optiméiert. Déi beschriwwe Schrëtt garantéieren eng effizient Reduktioun, Alkyléierung a Proteolys, déi fir Uwendungen an der Massespektrometrie (MS) gëeegent sinn.
Protokollschrëtt

1. Reduktioun vun Disulfidbindungen
   • Gitt 2 µL DTT-Léisung (110 mM) bei d’20 µL Proteinprouf (0,5 mg/mL) am AmBic-Puffer.
   • Setzt d’Proufréier an de Sonoreakter UP200St-CupHorn.
   • Behandelt d’Prouf fir 2,5 Minutte bei 50% Amplitud mat Ultraschall (200 W, 26 kHz).
   • Maacht eng kuerz Paus, fir d’Ofkillen z’erméiglechen, a behandelt d’Prouf duerno fir weider 2,5 Minutten ënner de selwechte Bedéngunge mat Ultraschall.
2. Alkyléierung vu reduzéierte Cysteinreschter
   • Gitt 2 µL IAA-Léisung (400 mM) bei déi reduzéiert Proteinprouf.
   • Behandelt d’Prouf fir 2,5 Minutte bei 50% Amplitud mat Ultraschall, fir d’Alkyléierung ze erliichteren.
   • Maacht eng Paus fir d’Ofkillen a behandelt d’Prouf duerno fir weider 2,5 Minutte mat Ultraschall.

   Hiweis: Miniméiert d’Liichtexpositioun vun der alkyléierter Prouf, fir den Ofbau vun IAA ze verhënneren.

3. Verdënnung vun der Prouf
   • Verdënnt déi alkyléiert Proteinprouf mat 25 mM AmBic-Puffer, dee 4% Acetonitril (v/v) enthält, op e Schlussvolumen vun 100 µL.
   • Mëscht grëndlech duerch douce Pipettéieren.
4. Proteolytesch Verdauung mat Trypsin, dat op Nanopartikelen immobiliséiert ass
   • Gitt 20 µL T-FMNP-Léisung (3 mg/mL) bei déi verdënnt Proteinprouf.
   • Beschallt d’Mëschung am Sonoreakter fir 2,5 Minutte bei enger Amplitud vu 50% mat Ultraschall.
   • Maacht eng Paus fir d’Ofkillung a beschallt duerno nach eng Kéier fir 2,5 Minutten ënner de selwechte Bedéngunge mat Ultraschall.
5. Trennung vun den Trypsin-Nanopartikelen
   • Benotzt e Magnéit, fir d’T-FMNPs vum Iwwerstand ze trennen, deen déi verdaut Peptiden enthält.
   • Transfert den Iwwerstand an en neit Mikrozentrifugeréierchen.
6. Virbereedung vun de Peptide fir d’MS-Analys
   • Dréchent den Iwwerstand, deen d’Peptiden enthält, an enger Vakuumzentrifug.
   • Lagert déi gedréchent Peptide bei -20°C bis zur weiderer Analys duerch Massespektrometrie.