• Wärend DNA a RNA Scheren, ginn DNA Moleküle a méi kleng Stécker gebrach. DNA / RNA Fragmentéierung ass ee vun de wichtege Probe Virbereedung Schrëtt erfuerderlech fir Bibliothéike fir d'nächst Generatioun Sequencing (NGS) ze kreéieren.
• Ultraschall DNA Scherrung benotzt d'Kräfte vu akustesche Kavitationen, fir d'DNA oder d'RNA an d'Stécker vun 100 ze bremsen – 5kb bp.
• Ultraschall Schere léisst fir präzis DNA Fragmentéierung an Adaptioun op d'gewënscht DNA ze maachen.

DNA Scheren mat Ultrasonication

Hielscher Ultrasonics bitt verschidde Ultraschall-baséiert Léisungen fir DNA, RNA an Chromatin Scherr. Wielt zwëschen engem Sondentyp-Ultraschallhaler (zB UP100H) fir direkten Echtzäit mat engem Mikrotip oder benotzt den VialTweeeter oder d'Ultraschallchuppel fir indirekte DNA-Virbereedung vun verschiddenen Proben gleichzeitig. Hielscher offréiert d'Ideal fir Äert Bedürfniss ugewannt: watt Dir 1 oder bis 10 Proben hutt, Bänn vu Microliter bis Liter Volumen – Hielscher Ultraschallveraarbechter gi fir Är Ufuerderungen gerecht ze ginn DNA, RNA a Chromatin Fragmenter op der richteger Längt ze preparéieren. Reproduzibility, einfach Operatioun a präzises Kontroll kontrolléiere fir eng verlässlech Bibliothéik fir d'nächst Generatioun Sequencing.
Am Géigesaz zu der enzymateschen DNA-Fragmentatioun applizéiert d'Ultraschall-Scherrung reinen mechanesch Scherr Trägere, ouni datt et keng Chemikalien gëtt. Duerch déi präzise Gestioun vun Prozezeparameter produzéiert d'Ultrascherscherschung vu grousser Molekulargewicht DNA Fragmente (Plasmid an Genom DNA).
Gëfteg Nukleinsäuren kënnen amplifizéiert ginn ier oder no enger Broutdrockschrëft.
Sonication Parameter (Muecht, Pulszyklus / Burst, Zäit a Temperatur) kënne sëch iwwer d'Software agefouert ginn.

Protokoller fir Ultraschall DNA Schere

Fir Chromatin Immunoprecipitation Tester

Kuerz ware Zellen a Platen mat 60mm Duerchmiesser (400.000 pro Dusch) plazéiert an transfizéiert mat RhoAr siRNA (wéi beschriwwen); No 72 Stonn si si mat Formaldehyd (Endkonzentratioun, 1%) 10 min bei 37 ° C fir Cross-Link Proteinen zu DNA inkubéiert. D'Vernetzungsreaktioun gouf gefeelt duerch d'Zuel vun engem Zéngtel Volume vun 1,25 Mol / L Glycin, dat 125 mmol / L Endkonzentratioun ze kréien. D'Zellen goufen zweemol mat kalt PBS gewascht, an Radioimmunoprecipitations assespeppe resuspendéiert [150 mmol / L NaCl, 1% NP40, 0,5% Desoxycholat, 0,1% SDS, 5 mmol / L EDTA, 50 mmol / L Tris-HCl (pH 8,0 )] enthalen 1 mmol / l Phenylmethylsulfonylfluorid, 1 Ag / mL Aprotinin a 1 Ag / mL Pepstatin A, an 30 Minutten op Eis ageholl. Dann goufen d'Zelllysate bei Eis iwwergespléckt Hielscher UP200S Ultraschallsunikateur (3 x 40 s, Amplitude 40%, Zyklus 1, Hielscher Ultrasonics GmbH) bis zu vernetzten Chromatinen ofgeschrauft ginn fir DNA Fragmente tëscht 200 an 1.000 bp ze bréngen. Ee Zéngtel vu ganzen Lysat gouf benotzt fir d'Quantitéit vun DNA presentéieren ze kënnen an ënnerschiddlech Proben an als als “totalen Duerchfang DNA”. D'Supernatanten goufe mat Lachspermium DNA / Protein Agarose-50% Schläim benotzt fir ongewolltene Background ze reduzéieren. D'Immunpräzipitation gouf dann iwwer Nuecht bei 4 ° C mat 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) oder ouni Antikörper (negativ Kontroll) gemaach. Dës Supernatanten goufen duerch 5 Mol / L NaCl ergänzt an iwwer 65 ° C erhëtzt, fir Protein-DNA-Cross-Links ze restauréieren. D'Immunokomplexe goufen weiderbehandelt mat DNase- a RNase-freier Proteinase K, an d'DNA gouf duerch Phenol / Chloroform Extraktioun a Ethanol Ausfällung gereinegt. De PCR gouf mat spezifesche Primeren mat enger Sequenz an der Promotorregioun vum menschlechen iNOS-Gen (p1 Primer: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 Primer: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶) korrespondéiert. (Doublier et al., 2008)

EGFP-Expressionstudien

Fir Ausdréckstudien huet de rekombinante Stamm L. tarentolae p10 :: F9Begfp1.4dBsat # 12 (Jena Bioscience, Däitschland) mat dem Gegrë fir EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), Chromosomal ssu integréiert, gouf an de verschiddene Medien kultivéiert wéi virdrun beschriwwen Zousätzlech ergänzt mam 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Däitschland). Während der Kultivatioun goufen 1 ml Prouf geholl, zentrifugéiert (2000 × g, 20 ° C, 10 min) a wäschen mat 0,9% NaCl -Lösung. De Pellet gouf an Puffer (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) resuspendéiert a gouf vu Sonifikatioun mat dem Ultraschallprozessor decidéiert UP400S (Applikatioun vun Energie ~ 400 Ws). D'Zockerbléiser goufen duerch Zentrifugatioun (6000 × g, 4 ° C, 5 min) ofgeschnidden an analyséiert duerch Natriumdodecylsulfat - Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE), ënnert der Reduktioun vu Konditioune mat der Laemmli-Methode (1970) mat 12,5% Polyacralamid-Gele . EGFP-Ausdrock gouf an agitéiert Kultur iwwerpréift. (Fritsche et al. 2007)

Chromatin immunoprecipitation

De Chromatin Immunpräzipitationsassay war duerch d'ChIP-IT gemaach^TM Express (aktives Motiv, Carlsbad, CA, USA) no dem Beschreiwung vum Hersteller mat e puer Ännerungen. Kuerz drop gi verschidde differenzéiert humanist Podocyten mat 10% bei Raumtemperatur mat 1% Formaldehyd vernetzt. D'Zellen goufen mam Eist kierzlech PBS gewaschen an d'Fixationsreaktioun ass gestoppt ginn duerch d'Addieren vun 0,125 M Glycin fir 5 min bei Raumtemperatur. D'Zellen goufen erem mat eiskaltem PBS gewascht an aus dem Iesse geschmaacht. Zellen goufen duerch Zentrifugatioun pelletéiert a resuspendéiert am Lysepuffer. No Zentrifugatioun gi pelletéiert Kären am Scherpuffer resuspendéiert, 30 min opkoppelt an d'Chromatin gouf duerch d'Ophänzung geschloen, zB UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Däitschland) bei 25% Muecht 5 Impulser vun 20 s an Eis op e Fragment vun ongeféier 200-600 bp. D'Schëffer Chromatin ass duerno zerstéiert an de Supernatant gesammelt. Fir Immunoprecipitationen sinn 60 μl Chromatin mat 1 μg Sp1 (Santa Cruz Biotechnologie, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) oder NF-κB p50 (Abcam) Antikörper oder mat Hënn IgG (Zymed Laboratorien, Süden San Francisco, CA, USA), als negativ Kontroll, iwwerluecht bei 4 ° C mat enger schwaacher Rotatioun. Immunokomplexe, déi zu magnetesche Pearen gebonnen goufen, goufen mat engem Magnéitstand gesammelt, ausgedehnt gewascht, an d'Protein / DNA-Vernetzer goufen ëmgedreift an d'DNA fir Echtzäit-PCR-Analyse eluéiert. (Ristola et al. 2009)

EHEC-DNA Präparatioun fir d'Array Analyse

Arrangement vu Zellelysaten an extrahéiert DNAs
Bakteriell Pellets, déi an PBS an der gewënschter Endkonzentratioun suspendéiert goufen, goufen behandelt Ultraschallunzerrt UP100H (Hielscher GmbH, Däitschland) mat engem Mikrotip MS1 (1mm Duerchmiesser) ausgestatt. D'Operatiounsfrequenz war 30 kHz an d'effektive Outputkraaft gouf 100 W. Während der Operatioun goufen d'Proben an engem Eiswasserbad gekippt, gemëscht an zentrifugéiert. D'Probeplazen goufen fir Stroumzytometrie Studien agesat, während fir spéider Handhabung d'Proben enger Wärter behandelt ginn (95 ° C, 5 min). D'Räiszell-Lysate goufen mat enger Mëschung aus Phenol verännert: Chloroform: Isoamylalkohol (25: 24: 1). E gläicht Volumen vun der Mëschung gouf zu der Lysatzprobe gefeiert, d'Léisung kritiséiert kräfteg fir 15 s an 15.000 xg fir 2 min bei Raumtemperatur (RT) ëm 22 ° C zentrifugéiert. Déi éischt wäissrëndlech Phase enthale mat der genomescher DNA gouf sëch opgetaucht a gesammelt an eng nei sterile Eppendorf-Tubus gesammelt.
Duerno goufen d'Proben deplacéiert fir d'DNA ze fragmen. De Stëftungsschrëtt gouf an den selweschten Ëmstänn realiséiert wéi déi hei beschriwwe ginn. Fir d'Fragmentéierungseffectioun vun der genomescher DNA auszeschätzen, goufen d'Proben analyséiert mat der Agarosegelelektrophorese.
(…) D'Préparate fir 2,5 min scho virgeschloen ginn no engem Extraktiounsschrëtt no Wärbehandlung a Zentrifugatioun ausgesat. D'DNA verëffentlecht gouf zweemol mam Phenol extrahéiert: Chloroform: Isoamylalkohol Mëschung, an no der zweeter Sonikatioun fir 0 - 15 min. D'Agarosegelelektrophoresis gouf benotzt fir d'Gréisst vun der DNA ze bestëmmen, déi der Nuklearerfragmentatioun vun der Posttraktioun subjektiv ausgesat gouf (Figur op der rietser Säit rechts). High-fragmentéiert DNA gouf evident vu der Präsenz vun engem DNA-Schimpe anstatt vu High-molecular Weight Bands, déi aus Proben eliminéiert goufen, déi 2,5 min oder méi laang sinn. Méi luesen Opliastung reduzéiert Fragmentlängen un ongeféier 150 bis 600 bp, an d'Opléisung fir 15 min weider de Fragmenter degradéiert huet, wéi et am meeschten vum Uewerpapp vum Smaragde gesinn ass. Domat ass d'duerchschnëttlech DNA-Fragment gréisstendeels grad mat der Ultraschung ze refinéiert an d'5 min Behandlungen erméiglecht d'Gréisst vun DNA-Fragmenter am meeschten ze maachen fir Schip-Array-Assays. Am Endeffekt ass d'DNA Analytpräparatioun Prozedur déi éischt 2 min vun der Ultraschallbehandlung, der DNA Extraktioun (2x) an der spéider 5 min Opléisung entwéckelt gouf. (Basselet et al. 2008)

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

HEK293 Zellen kultivéiert wéi virdrun et kultivéiert an 45 min bei Raumtemperatur mat 2 mM Disuccinimidyl-glutarat fixéiert. Duerno goufen d'Zellen zweemol mam PBS gewaschen. Chromatin gouf 10 min bei Raumtemperatur mat 1% (v / v) Formaldehyd vernetzt an zweemol mat kalt PBS gewaschen. D'Vernetzungsreaktioun gouf duerch Inkubatioun mat Glycin bei enger Endkonzentratioun vun 0,125 M fir 5 min bei Raumtemperatur gestoppt. No enger Inkubatioun mit Trypsin goufen d'Zellen aus der Zellkultur geschaaft an zweemol mat PBS gewäsch. D'Zellpellet ass resuspendéiert an Lysepuffer (5 mM Päifen, pH 8,0, 85 mM KCl a 0,5% (v / v) Nonidet P-40), 10 min am Waasser ukämpft an homogeniséiert mat engem Dounce Homogeniséierer. Duerno goufen d'Nuklei duerch Zentrifugatioun (3500 x g, 5 min, 4 ° C) pellettéiert a resuspendéiert an Nuklearpuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA a 1% (W / V) SDS). Nuclei goufen duerch d'Ophänkung mat dräi 20-Impulsen an a gestéiert UP50H sonicator (Hielscher Ultraschall Technologie) bei engem Ëmfeld vu Cycle 0,5 an Amplitude 30%, duerch déi genomme DNA-Fragmenter mat enger Gréisst vun 200 bis 1000 bp. Fir ChIP goufen 50 g DNA verdamppt 4-fach am Immunabrecipitation Buffer (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (V / V) Triton X-100 a 0,01% v) SDS). (Weiske et al., 2006)

Histone Modifikatioun Analyse duerch Chromatin Immunabrecipitation (ChIP)

Kuerz, 6 x 10⁶ Zellen goufen zweemol mat PBS gewäsch a vernetzten op der Kulturplaatz fir 15 min bei Raumtemperatur an der Präsenz vu 0,5% Formaldehyd. D'Crosslinking Reaktioun gouf gestoppt, andeems 0,125 M Glycin gegeben gouf. All weider Schrëtt goufen op 48 ° C ausgeführt. All Puffer waren virgeschloen an Protease-Inhibitoren enthale (komplette Mini, Roche). D'Zellen goufen zweemol mat PBS gewascht an duerno gekackt. Verschiedene Pellets goufen an 1 ml Lysepuffer (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) gelöst an an engem Kalt Ethanolbad fir 10 Zyklen bei 100% Amplitude mat engem UP50H sonicator (Hielscher, Teltow, Däitschland). D'Chromatinfragmentéierung gouf a 1% Agarosegel visualisiert. Erfaasst Fragmenter goufe am 200-500pb-Streck. Léislech Chromatin gouf duerch Zentrifugéieren vun de sonikéierte Prouf bei 14.000g fir 10 min bei 48 ° C. D'lukrativ Fraktioun ass 1/10 bei Verdënnungspuffer verdünnt (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), an duerno bis 80 ° C aliquéiert a gespäichert bis se gebraucht ginn. (Rodriguez et al. 2008)