Ultraschall DNA Scheren

Wärend DNA an RNA Scheren gi laang DNA Moleküle a méi kleng Stécker fragmentéiert, e entscheedende Schrëtt fir Proben ze preparéieren fir d'nächst Generatioun Sequencing (NGS) Bibliothéik Konstruktioun. Ultraschall DNA Scheren benotzt akustesch Kavitatiounskräften fir DNA oder RNA a Fragmenter ze briechen, rangéiert vun 100 bp bis 5 kb. Dës Method erméiglecht präzis Kontroll iwwer Fragmentgréisst, erliichtert d'Personaliséierung op déi gewënscht DNA Längt fir optimal Sequenzéierungsresultater.

DNA Schéier mat Ultraschall

Hielscher Ultrasonics bitt verschidde Ultraschall-baséiert Léisunge fir DNA, RNA a Chromatin Scheren. Wielt tëscht engem Sonde-Typ Ultraschaller (zB UP100H) fir direkt Sonikatioun mat engem Mikrotip, oder benotzt de VialTweeeter oder den Ultraschall-Kuphorn fir indirekt DNA Virbereedung vu verschiddene Proben gläichzäiteg. Hielscher bitt den idealen Apparat fir Är Bedierfnesser ze berücksichtegen: ob Dir 1 oder bis zu 10 Proben hutt, Volumen vu Mikroliter bis Litervolumen – Hielscher Sonicators erfëllen Är Ufuerderunge fir DNA, RNA a Chromatinfragmenter op der richteger Längt ze preparéieren. Reproducibilitéit, einfach Operatioun a präzis Kontroll erlaben eng zouverlässeg Bibliothéik fir d'nächst Generatioun Sequenzéierung.
Am Géigesaz zu der enzymatescher DNA Fragmentatioun applizéiert d'Ultraschallscheren reng mechanesch Scherrkräften ouni Chemikalien ze addéieren. Duerch déi präzis Astellung vu Prozessparameter produzéiert d'Ultraschallscheren DNA Fragmenter mat héijer molekulare Gewiicht (Plasmid a genomesch DNA).
Purifizéiert Nukleinsäure kënne virum oder no engem Fragmentatiounsschrëtt verstäerkt ginn.
Sonicatiounsparameter (Kraaft, Pulszyklus / Bursts, Zäit an Temperatur) kënne sécher iwwer Software-Astellunge kontrolléiert ginn.

Protokoller fir Ultraschall DNA Scheren

Fir Chromatin Immunoprecipitatioun Assay

Kuerz, goufen Zellen zu 60mm-Duerchmiesser Platen plated (400.000 pro Plat) a transfected mat RhoA siRNA (wéi beschriwwen); no 72 h, si sech mat formaldehyde (endlech Konzentratioun, 1%) fir 10 min bei 37 ° C incubated Proteinen ze DNA ze Kräiz-Link. D'Verknüpfungsreaktioun gouf gestoppt duerch d'Zousätzlech vun engem Zéngtel Volume vun 1,25 mol / L Glycin, wat 125 mmol / L Finale Konzentratioun gëtt. Zellen goufen zweemol mat äiskale PBS gewäsch, resuspendéiert am radioimmunoprecipitationsassaybuffer [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% Deoxycholat, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 80. )] enthält 1 mmol / L Phenylmethylsulfonylfluorid, 1 Ag / ml Aprotinin, an 1 Ag / ml Pepstatin A, a hält op Äis fir 30 min. Duerno goufen Zelllysate op Äis mat engem sonicated Hielscher UP200S Ultraschall-Sonicator (3 x 40 s, Amplitude 40%, Zyklus 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) bis vernetzt Chromatine geschnidden goufen fir DNA-Fragmenter tëscht 200 an 1.000 bp ze ginn. Een Zéngtel vum ganze Lysat gouf benotzt fir d'Quantitéit un DNA, déi a verschiddene Proben präsent ass, ze quantitéieren an als “Ganzen Input DNA”. Supernatanten goufen mat Saumon Spermien DNA /Protein agarose-50% Schläim inkubéiert fir nonspezifesch Hannergrond ze reduzéieren. Immunoprecipitation gouf dann iwwer Nuecht bei 4 ° C mat 5 Ag vun Anti-NF-nB p65 (Upstate) oder ouni Antikörper (negativ Kontroll) gemaach. Dës Supernatanten goufen mat 5 mol / L NaCl ergänzt an iwwer Nuecht bei 65 ° C erhëtzt fir Protein-DNA Cross-Links zréckzekréien. D'immunocomplexes sech weider mat DNase- an RNase-gratis proteinase K behandelt, an DNA war vun phenol /chloroform Extraktioun an Ethanol Nidderschlag gereinegt. PCR war mat spezifesche primers entspriechend zu enger Sequenz bannent der Promoteur Regioun vun der mënschlecher iNOS Gentherapie gemaach (p1 primer: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 primer: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

EGFP Ausdrock Studien

Fir Ausdrock Studien, der rekombinant Deformatioun L. tarentolae p10 :: F9Begfp1.4dBsat # 12 (Jena Bioscience, Däitschland) mam Gen fir EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), chromosomal ssu integréiert, war an de verschiddene Medien ugebaut wéi virdru beschriwwen an zousätzlech ergänzt mat 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Däitschland). Wärend der Kultivatioun goufen 1 ml Proben geholl, centrifugéiert (2000 × g, 20 ° C, 10 min) a mat 0,9% NaCl Léisung gewascht. Pellet gouf am Puffer (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) resuspendéiert an duerch Sonifikatioun mam Ultraschallprozessor zerstéiert UP400S (Uwendung vun Energie ~ 400 Ws). Zell Debris goufen duerch Zentrifugéierung (6000 × g, 4 ° C, 5 min) geläscht an analyséiert duerch Natriumdodecylsulfat - Polyacrylamidgel Elektrophorese (SDS-PAGE) ënner reduzéierende Bedéngungen no der Method vu Laemmli (1970) mat 12,5% Polyacralamidgelen . EGFP-Ausdrock gouf an agitéiert Kultur iwwerpréift. (Fritsche et al. 2007)

chromatin immunoprecipitation

D'chromatin immunoprecipitation assay war mat der ChIP-IT gesuergt^TM Express (Aktiv Motiv, Carlsbad, CA, USA) no den Hiersteller d'Instruktioune mat e puer Ännerungen. Kuerz, differenzéiert mënschlech Podocyten goufen mat 1% Formaldehyd fir 10 min bei Raumtemperatur vernetzt. Zellen goufen mat äiskale PBS gewäsch an d'Fixatiounsreaktioun gouf gestoppt andeems 0,125 M Glycin fir 5 min bei Raumtemperatur derbäigesat gouf. Zellen goufen erëm mat äiskale PBS gewäsch an aus dem Plat geschrauft. Zelle goufen duerch Zentrifugéierung gepellet an am Lysisbuffer resuspendéiert. No der Zentrifugéierung goufen pelletéiert Käre am Schéierbuffer resuspendéiert, 30 min op Äis inkubéiert an de Chromatin gouf duerch Sonikatioun geschnidden, z.B. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Däitschland) bei 25% Kraaft 5 Impulser vun 20 Sekonnen op Äis a Fragmenter vun ongeféier 200-600 bp. De geschniddene Chromatin gouf duerno centrifugéiert an de Supernatant gouf gesammelt. Fir Immunoprecipitatiounen gouf 60 μl Chromatin mat 1 μg Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) oder NF-κB p50 (Abcam) Antikörper oder mat Kanéngchen inkubéiert IgG (Zymed Laboratoiren), als negativ Kontroll, Iwwernuechtung um 4°C mat mëllen Rotatioun. Immunokomplexe gebonnen mat magnetesche Perlen goufen mat engem magnetesche Stand gesammelt, extensiv gewascht, an d'Protein /DNA Crosslinks goufen ëmgedréit an d'DNA eluéiert fir Echtzäit PCR Analyse. (Ristola et al. 2009)

EHEC DNA Virbereedung fir Chip Array Analyse

Arrangement vun Zell lysates an extrahéiert DNAs
Bakteriell Pellets suspendéiert an PBS zu der gewënschter final Konzentratioun goufen behandelt mat Ultraschallstéierer UP100H (Hielscher GmbH, Däitschland) equipéiert mat engem Microtip MS1 (1 mm Duerchmiesser). D'Betribsfrequenz war 30 kHz an d'effektiv Ausgangskraaft war 100 W. Während der Operatioun goufen d'Proben an engem Äiswasserbad gekillt, gemëscht an centrifugéiert. D'Proben goufen fir Flowzytometriestudien benotzt, wärend fir spéider Handhabung Proben eng Wärmebehandlung (95 ° C, 5 min) ënnerworf goufen. Déi rau Zelllysate goufen mat enger Mëschung aus Phenol:chloroform:Isoamyl Alkohol (25:24:1) veraarbecht. E gläiche Volume vun dëser Mëschung gouf an d'Lysatprobe bäigefüügt, d'Léisung gouf kräfteg fir 15 Sekonnen geworf an centrifugéiert bei 15.000 xg fir 2 Minutten bei Raumtemperatur (RT) ëm 22 ° C. Déi iewescht wässerlech Phase mat der genomesch DNA gouf suergfälteg getrennt a gesammelt an engem neie sterile Eppendorfer Rouer.
Duerno goufen Proben sonicéiert fir d'DNA ze fragmentéieren. D'Sonication Schrëtt gouf an de selwechte Konditiounen realiséiert wéi uewen beschriwwen. Fir d'Fragmentatiounseffekter op der genomesch DNA ze evaluéieren, goufen Echantillon analyséiert mat Hëllef vun Agarosegel Elektrophorese.
(…) D'Proben, déi virdru fir 2,5 min sonicated goufen, goufen no enger Wärmebehandlung an der Zentrifugéierung un engem Extraktiounsschrëtt ënnerworf. D'DNA verëffentlecht gouf zweemol mat engem Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol Mëschung extrahéiert, an duerno fir eng zweet Sonikatioun fir 0 - 15 min ënnerworf. Agarose Gel Elektrophorese gouf benotzt fir d'Gréisst Verdeelung vun DNA ze bestëmmen, déi no der Ultraschallfragmentatioun no Extraktioun ënnerworf gouf (Fig. uewe riets). Héich fragmentéiert DNA war evident aus der Präsenz vun engem DNA Schmier anstatt héichmolekulare Gewiichtsbanden déi aus Proben eliminéiert goufen, déi fir 2,5 min oder méi sonikéiert goufen. Méi laang Sonikatioun reduzéiert d'Fragmentlängen graduell op ongeféier 150 - 600 bp, an d'Sonicatioun fir 15 min huet dës Fragmenter weider ofgebaut, wéi et meeschtens duerch den ieweschten Deel vum Schmier gesi ka ginn. Also ass déi duerchschnëttlech DNA Fragmentgréisst graduell mat der Ultraschallzäit zréckgaang an d'5 min Behandlung erlaabt d'Gréissten vun DNA Fragmenter am meeschte passend fir Chip Array Assays ze kréien. Schlussendlech gouf d'DNA Analytpräparatiounsprozedur déi éischt 2 min Ultraschallbehandlung, DNA Extraktioun (2 ×), a spéider 5 min sonication, etabléiert. (Basselet et al. 2008)

Chromatin Immunoprecipitatioun (ChIP)

HEK293 Zellen goufen kultivéiert wéi uewen beschriwwen a fixéiert mat 2 mM Disuccinimidyl-Glutarat fir 45 min bei Raumtemperatur. Duerno goufen d'Zellen zweemol mat PBS gewäsch. Chromatin gouf fir 10 min bei Raumtemperatur vernetzt mat 1% (v /v) Formaldehyd an zweemol mat äiskalem PBS gewäsch. D'Verknüpfungsreaktioun gouf duerch Inkubatioun mat Glycin bei enger final Konzentratioun vun 0,125 M fir 5 min bei Raumtemperatur gestoppt. No Inkubatioun mat Trypsin goufen d'Zellen aus der Zellkulturgeschir geschrauft an zweemol mat PBS gewäsch. D'Zellpellet gouf am Lysisbuffer (5 mm Pipes, pH 8,0, 85 mm KCl, an 0,5% (v /v) Nonidet P-40) resuspendéiert, 10 min op Äis inkubéiert a mat engem Dounce Homogenisator homogeniséiert. Duerno goufen d'Käre duerch Zentrifugéierung (3500 xg, 5 min, 4 ° C) gepellet an an Kärebuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.1, 10 mM EDTA, an 1% (w/v) SDS) resuspendéiert. Käre goufen duerch Sonikatioun mat dräi 20-s Impulser an engem UP50H sonicator (Hielscher Ultraschall Technologie) bei engem Astellung vum Zyklus 0.5 an Amplitude 30%, déi genomesch DNA Fragmenter mat enger Gréisst vun 200 - 1000 bp erginn. Fir ChIP, gouf 50g vun DNA 4-fach an immunoprecipitation Prellbock verdënntem (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100, an 0,01% (w/w/v) v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Histone Modifikatioun Analyse duerch Chromatin Immunoprecipitatioun (ChIP)

Kuerz gesot, 6 x 10⁶ Zellen goufen zweemol mat PBS gewäsch an op der Kulturplack fir 15 min bei Raumtemperatur an der Präsenz vun 0,5% Formaldehyd vernetzt. Cross-linking Reaktioun gouf gestoppt andeems 0,125 M Glycin bäigefüügt gouf. All spéider Schrëtt goufen bei 48 ° C duerchgefouert. All Puffer ware virgekillt a enthale Protease-Inhibitoren (Complete Mini, Roche). Zellen goufen zweemol mat PBS gewäsch an duerno geschrauft. Gesammelte Pellets goufen an 1 ml Lysisbuffer (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) opgeléist a goufen an engem kale Ethanolbad fir 10 Zyklen bei 100% Amplitude mat Hëllef vun engem UP50H sonicator (Hielscher, Teltow, Däitschland). Chromatin Fragmentatioun gouf an 1% Agarosegel visualiséiert. Erhalen Fragmenter waren am 200-500pb Beräich. Soluble Chromatin gouf kritt andeems d'sonicated Proben bei 14.000g fir 10 min bei 48 ° C centrifugéiert ginn. D'soluble Fraktioun war verdënntem 1/10 an dilution Prellbock (1% Triton X-100, 2 mm EDTA, 20 mm Tris pH 8, 150 mm NaCl) dann aliquoted a bei 80 ° C bis benotzen gespäichert. (Rodriguez et al. 2008)