DNA-Schéierung mat Ultraschall

Bei der Schéierung vun DNA an RNA gi laang DNA-Moleküllen a méi kleng Stécker fragmentéiert, e wichtege Schrëtt bei der Virbereedung vu Prouwe fir d’Erstelle vu Bibliothéike fir Next-Generation-Sequenzéierung (NGS). D’DNA-Schéierung mat Ultraschall benotzt akustesch Kavitatiounskräften, fir DNA oder RNA a Fragmenter vun 100 bp bis 5 kb ze zerbriechen. Dës Method erméiglecht eng präzis Kontroll vun der Fragmentgréisst a vereinfacht domat d’Upassung un déi gewënschten DNA-Längt fir optimal Sequenzéierungsresultater.

DNA-Schéierung duerch Ultraschallbehandlung

Hielscher Ultrasonics bitt verschidde Léisungen op Ultraschallbasis fir d’Schéierung vun DNA, RNA a Chromatin. Wielt e Sonden-Ultraschallapparat (z. B. UP100H) fir eng direkt Ultraschallbehandlung mat enger Mikrospëtzt, oder benotzt de VialTweeeter oder den Ultraschall-Cuphorn fir déi indirekt DNA-Virbereedung vu verschiddene Prouwe gläichzäiteg. Hielscher bitt den idealen Apparat fir Är Besoinen: egal ob Dir 1 oder bis zu 10 Prouwen hutt, mat Volumme vu Mikroliter bis Liter – Hielscher Ultraschallapparater erfëllen Är Ufuerderunge fir d’Virbereedung vun DNA-, RNA- a Chromatinfragmenter mat der richteger Längt. Reproduzéierbarkeet, einfach Bedéngung a präzis Kontroll erméiglechen eng zouverlässeg Bibliothéik fir Next-Generation-Sequenzéierung.
Am Géigesaz zur enzymatescher DNA-Fragmentéierung setzt d’Ultraschallschéierung reng mechanesch Schéierkräften an, ouni Chemikalien derbäizesetzen. Duerch déi präzis Astellung vun de Prozessparameter produzéiert d’Ultraschallschéierung DNA-Fragmenter mat héijem Molekulargewiicht (Plasmid-DNA a genomesch DNA).
Gerengegt Nukleinsaieren kënne virun oder no engem Fragmentéierungsschrëtt amplifizéiert ginn.
D’Parameter vun der Ultraschallbehandlung (Leeschtung, Pulszyklus / Pulsserien, Zäit an Temperatur) kënne sécher iwwer Softwareastellunge kontrolléiert ginn.

Protokoller fir d’DNA-Schéierung mat Ultraschall

Fir de Chromatin-Immunoprezipitatiounsassay

Kuerz zesummegefaasst goufen Zellen a Schuele mat engem Duerchmiesser vu 60mm ausgeséit (400.000 pro Schuel) a mat RhoA-siRNA transfizéiert (wéi beschriwwen); no 72 h goufe si fir 10 min bei 37°C mat Formaldehyd (Endkonzentratioun, 1%) inkubéiert, fir Proteinne mat DNA ze kräizvernetzen. D’Kräizvernetzungsreaktioun gouf duerch d’Zousaz vun engem Zéngtel vum Volumme vun 1,25 mol/L Glycin gestoppt, wouduerch eng Endkonzentratioun vun 125 mmol/L erreecht gouf. D’Zelle goufen zweemol mat äiskalem PBS gewäsch, a Radioimmunoprezipitatiounsassay-Puffer [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% Deoxycholat, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)] resuspendéiert, deen 1 mmol/L Phenylmethylsulfonylfluorid, 1 Ag/mL Aprotinin an 1 Ag/mL Pepstatin A enthale huet, a fir 30 min op Äis gehalen. Duerno goufen d’Zelllysater op Äis mat engem Hielscher UP200S Ultraschallsonikator (3 x 40 s, Amplitude 40%, Zyklus 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) beschallt, bis dat kräizvernetzte Chromatin esou geschéiert war, datt DNA-Fragmenter tëscht 200 an 1.000 bp entstane sinn. Een Zéngtel vum gesamte Lysat gouf benotzt, fir d’Quantitéit vun der DNA an de verschiddene Prouwen ze bestëmmen, a gouf als „gesamten Input-DNA“ ugesinn. D’Iwweränn goufe mat enger 50%-Suspensioun aus Lachsspermien-DNA/Protein-Agarose inkubéiert, fir den onspezifeschen Hannergrond ze reduzéieren. D’Immunoprezipitatioun gouf duerno iwwer Nuecht bei 4°C mat 5 Ag Anti-NF-nB p65 (Upstate) oder ouni Antikierper (negativ Kontroll) duerchgefouert. Dës Iwweränn goufe mat 5 mol/L NaCl versat an iwwer Nuecht bei 65°C erhëtzt, fir d’Protein-DNA-Kräizvernetzungen opzehiewen. D’Immunkomplexer goufen duerno mat DNase- a RNase-fräier Proteinase K behandelt, an d’DNA gouf duerch Phenol/Chloroform-Extraktioun an Ethanolprezipitatioun gerengegt. D’PCR gouf mat spezifesche Primeren duerchgefouert, déi enger Sequenz an der Promoterregioun vum mënschlechen iNOS-Gen entsprach hunn (p1-Primer: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2-Primer: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Studien iwwer d’EGFP-Expressioun

Fir Expressiounsstudie gouf de rekombinante Stamm L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Däitschland), bei deem de Gen fir EGFP (verstäerkt gréng fluoreszéierend Protein) am chromosomale ssu integréiert war, wéi virdru beschriwwen an de verschiddene Medie kultivéiert an zousätzlech mat 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Däitschland) ergänzt. Wärend der Kultivatioun goufen 1 ml Prouwe geholl, zentrifugéiert (2000 × g, 20°C, 10 min) a mat enger 0,9% NaCl-Léisung gewäsch. De Pellet gouf am Puffer (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) resuspendéiert an duerch Beschallung mat follgendem Ultraschallprozessor opgebrach: UP400S (Energieasaz ∼ 400 Ws). Zellreschter goufen duerch Zentrifugatioun (6000 × g, 4°C, 5 min) ewechgeholl an duerch Natriumdodecylsulfat–Polyacrylamid-Gelelektrophorees (SDS-PAGE) ënner reduzéierende Bedéngungen no der Method vum Laemmli (1970) mat 12,5% Polyacrylamid-Gelen analyséiert. D’EGFP-Expressioun gouf an enger beweegter Kultur ënnersicht. (Fritsche et al. 2007)

Chromatin-Immunoprezipitatioun

Den Assay fir d’Chromatin-Immunoprezipitatioun gouf mam ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) no den Instruktioune vum Hiersteller mat e puer Modifikatiounen duerchgefouert. Kuerz beschriwwe goufen differenzéiert mënschlech Podozytte mat 1% Formaldehyd fir 10 min bei Raumtemperatur quervernetzt. D’Zelle goufe mat äiskalem PBS gewäsch, an d’Fixéierungsreaktioun gouf duerch d’Zousaz vun 0,125 M Glycin fir 5 min bei Raumtemperatur gestoppt. D’Zelle goufen nach eng Kéier mat äiskalem PBS gewäsch a vun der Schuel ofgeschraapt. Duerch Zentrifugatioun goufen d’Zellen zu engem Pellet konzentréiert an am Lysepuffer resuspendéiert. No der Zentrifugatioun goufen d’Zellkären am Pellet am Scherpuffer resuspendéiert a fir 30 min op Äis inkubéiert. Duerno gouf de Chromatin duerch Beschallung geschert, z. B. mam UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Däitschland) bei 25% Leeschtung mat 5 Impulser vun all Kéier 20 sec op Äis a Fragmenter vun ongeféier 200–600 bp. De geschierte Chromatin gouf duerno zentrifugéiert an den Iwwerstand gouf gesammelt. Fir d’Immunoprezipitatioune goufen 60 μl Chromatin mat 1 μg Antikierper géint Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) oder NF-κB p50 (Abcam) oder mat Kanéngchen-IgG (Zymed Laboratories) als negativ Kontroll iwwer Nuecht bei 4°C ënner liichter Rotatioun inkubéiert. Immunokomplexer, déi u magnetesch Kugele gebonne waren, goufe mat engem Magnéitstativ gesammelt a grëndlech gewäsch. D’Protein/DNA-Quervernetzunge goufen opgeléist an d’DNA gouf fir d’Echtzäit-PCR-Analys eluéiert. (Ristola et al. 2009)

EHEC-DNA-Preparatioun fir d’Chiparray-Analys

Zesummestellung vun Zelllysater an extrahéierten DNAen
Bakteriepellets, déi a PBS bis zur gewënschter Endkonzentratioun suspendéiert waren, goufe behandelt mam Ultraschall-Zellopbriecher UP100H (Hielscher GmbH, Däitschland), equipéiert mat enger Mikrospëtzt MS1 (1mm Duerchmiesser). D’Betribsfrequenz war 30 kHz an déi effektiv Ausgangsleeschtung war 100 W. Wärend dem Betrib goufen d’Prouwen an engem Äiswaasserbad gekillt, gemëscht an zentrifugéiert. D’Prouwe goufe fir duerchflusszytometresch Ënnersichunge benotzt, wärend d’Prouwe fir déi spéider Veraarbechtung enger Hëtztbehandlung (95°C, 5 min) ënnerzu goufen. Déi réi Zelllysater goufe mat enger Mëschung aus Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) verschafft. E gläiche Volume vun dëser Mëschung gouf der Lysatprouf bäigefüügt, d’Léisung gouf fir 15 s kräfteg verwierbelt a bei 15.000 x g fir 2 min bei Raumtemperatur (RT) vu ronn 22°C zentrifugéiert. Déi iewescht wässerlech Phas, déi d’genomesch DNA enthale huet, gouf virsiichteg ofgetrennt an an engem neie sterile Eppendorf-Réierche gesammelt.
Duerno goufen d’Prouwe mat Ultraschall behandelt, fir d’DNA ze fragmentéieren. D’Ultraschallbehandlung gouf ënner de selwechte Bedéngunge wéi uewe beschriwwen duerchgefouert. Fir d’Auswierkunge vun der Fragmentéierung op d’genomesch DNA ze bewäerten, goufen d’Prouwe mat Agarosegel-Elektrophorees analyséiert.
(…) Déi Prouwen, déi virdru fir 2,5 min mat Ultraschall behandelt gi waren, goufen no der Hëtztbehandlung an der Zentrifugatioun engem Extraktiounsschrëtt ënnerzunn. Déi fräigesaten DNA gouf zweemol mat enger Mëschung aus Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol extrahéiert an duerno enger zweeter Ultraschallbehandlung fir 0 – 15 min ënnerzunn. Agarosegel-Elektrophorees gouf benotzt, fir d’Gréissteverdeelung vun der DNA ze bestëmmen, déi no der Extraktioun duerch Ultraschall fragmentéiert gi war (Fig. uewe riets). Déi staark fragmentéiert DNA war un engem DNA-Schmier amplaz vu Bande mat héijem Molekulargewiicht ze erkennen; dës Bande waren aus de Prouwen, déi fir 2,5 min oder méi laang mat Ultraschall behandelt gi waren, verschwonnen. Eng méi laang Ultraschallbehandlung huet d’Fragmentlängte lues a lues op ongeféier 150 – 600 bp reduzéiert, an eng Ultraschallbehandlung fir 15 min huet dës Fragmenter weider ofgebaut, wéi virun allem um ieweschten Deel vum Schmier ze gesinn ass. Domat huet déi duerchschnëttlech Gréisst vun den DNA-Fragmenter mat der Dauer vun der Ultraschallbehandlung lues a lues ofgeholl, an d’Behandlung fir 5 min huet et erméiglecht, DNA-Fragmenter mat deene Gréissten ze kréien, déi am beschte fir Chip-Array-Assaye gëeegent waren. Schlussendlech gouf d’Prozedur fir d’Preparatioun vum DNA-Analyt festgeluecht, déi fir d’éischt eng Ultraschallbehandlung fir 2 min, eng DNA-Extraktioun (2×) an duerno eng Ultraschallbehandlung fir 5 min ëmfaasst huet. (Basselet et al. 2008)

Chromatin-Immunpräzipitatioun (ChIP)

HEK293-Zelle goufe wéi uewe beschriwwe kultivéiert a mat 2 mM Disuccinimidylglutarat fir 45 min bei Raumtemperatur fixéiert. Duerno goufen d’Zellen zweemol mat PBS gewäsch. Chromatin gouf mat 1% (v/v) Formaldehyd fir 10 min bei Raumtemperatur vernetzt an zweemol mat äiskalem PBS gewäsch. D’Vernetzungsreaktioun gouf duerch Inkubatioun mat Glycin bei enger Endkonzentratioun vun 0,125 M fir 5 min bei Raumtemperatur gestoppt. No der Inkubatioun mat Trypsin goufen d’Zellen aus der Zellkulturschuel ofgeschraapt an zweemol mat PBS gewäsch. D’Zellpellet gouf a Lysepuffer (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl an 0,5% (v/v) Nonidet P-40) resuspendéiert, fir 10 min op Äis inkubéiert a mat engem Dounce-Homogenisator homogeniséiert. Duerno goufen d’Zellkäre duerch Zentrifugatioun (3500 x g, 5 min, 4 °C) pelletéiert an a Kärpuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA an 1% (w/v) SDS) resuspendéiert. D’Zellkäre goufen duerch Ultraschallbehandlung mat dräi Impulser vun all Kéiers 20 s an engem UP50H-Ultraschallapparat (Hielscher Ultraschall Technologie) bei enger Astellung vum Zyklus op 0,5 a vun der Amplitud op 30% opgebrach, wouduerch genomesch DNA-Fragmenter entstane sinn, déi gréisstendeels eng Gréisst vun 200 – 1000 bp haten. Fir ChIP goufe 50g DNA am Immunpräzipitatiounspuffer (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 an 0,01% (w/v) SDS) ëm de Faktor 4 verdënnt. (Weiske et al. 2006)

Analys vun Histonmodifikatiounen duerch Chromatin-Immunpräzipitatioun (ChIP)

Kuerz gesot goufen 6 x 10⁶ Zelle goufen zweemol mat PBS gewäsch an op der Kulturplack fir 15 min bei Raumtemperatur a Presenz vun 0,5% Formaldehyd kräizvernetzt. D’Kräizvernetzungsreaktioun gouf duerch d’Zousaz vun 0,125 M Glycin gestoppt. All uschléissend Schrëtt goufe bei 48°C duerchgefouert. All Puffere ware virgekillt an hunn Proteaseinhibitoren (Complete Mini, Roche) enthalen. D’Zelle goufen zweemol mat PBS gewäsch an duerno ofgeschraapt. Déi gesammelt Pellete goufen an 1 ml Lysepuffer (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) opgeléist an an engem kalen Ethanolbad fir 10 Zykle bei 100% Amplitüd mat Ultraschall behandelt, ënner Asaz vun engem UP50H-Ultraschallapparat (Hielscher, Teltow, Däitschland). D’Chromatinfragmentéierung gouf an engem 1% Agarosegel siichtbar gemaach. Déi erhale Fragmenter louchen am Beräich vun 200–500pb. Léistlecht Chromatin gouf duerch Zentrifugéiere vun de mat Ultraschall behandelte Prouwe bei 14.000g fir 10 min bei 48°C gewonnen. Déi léislech Fraktioun gouf 1/10 am Verdënnungspuffer (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) verdënnt, duerno a Portiounen opgedeelt a bis zum Gebrauch bei 80°C gelagert. (Rodriguez et al. 2008)