Ultraschalllys vun E. Coli

E. coli-Bakterie sinn déi am heefegste benotzte Bakterien an der Mikrobiologie an der Biotechnologie.
Ultraschallapparater fir den Zellopbroch liwweren zouverlässeg a reproduzéierbar Resultater fir d’Lys vun E. coli.
Intensiv, awer prezis steierbar Kavitatioun a Schéierkräfte féieren zu engem kompletten Zellopbroch an héijen Extraktiounsausbezuelen (z. B. Proteinnen, DNA).

Firwat ass den Zellopbroch vun E. coli mat Ultraschall déi bevorzugt Method?

Ultraschallhomogenisateuren oder Ultraschallapparater mat Sond bidden e puer Virdeeler fir d’Lys vun E. coli, well intensiven Ultraschall d’Zellwänn an d’Membranen effizient opbrécht. Ultraschallapparater mat Sond gi wéinst de folgende Grënn dacks fir d’Lys vun E. coli benotzt:

Effizienten Opbroch vun den Zellwänn: E. coli huet eng hallefsteif Zellwand aus Peptidoglykan, déi mat traditionelle Lysmethoden nëmme schwéier opzebrieche ka sinn. En Ultraschallapparat mat Sond erzeugt intensiv Ultraschallwellen, déi Kavitatiounsblosen an der Flëssegkeet ronderëm d’Zelle bilden. Wann dës Blosen zesummefalen, entstinn Héichvitessflëssegkeetsstralen a Stousswellen, déi d’Zellwänn mechanesch opbriechen an doduerch Zellinhalter wéi Biomoleküllen effektiv fräisetzen.

Verbessert Andréngen: D’Ultraschallwellen, déi vun der Sond / Sonotrod erzeugt ginn, kënnen déif an d’Prouf andréngen, eng méi grouss Zuel vun E. coli-Zellen erreechen a se gläichméisseg behandelen. Dëst dréit dozou bäi, datt d’Lys an der ganzer Prouf méi gläichméisseg ass, wat zu enger méi héijer Effizienz beim Zellopbroch féiert.

Verkierzte Veraarbechtungszäit: D’Energie, déi den Ultraschallapparat mat Sond liwwert, ass staark konzentréiert a raimlech begrenzt, wat zu enger séierer an effizienter Zelllys féiert. Am Verglach mat anere Methode wéi dem mechaneschen Opbroch mat Kärecher oder der enzymatescher Lys kann d’Ultraschallbehandlung d’Lys vun E. coli bannent Minutten oder souguer Sekonnen erreechen. Wärend vill alternativ Technike wéi d’Afréieren an d’Entdeee méi Behandlungsronne brauchen, mécht d’Ultraschalllys d’Zellen an engem eenzege Prozessschrëtt op.

Temperaturkontroll: Modernst Ultraschallapparater si mat Temperatursensoren an intelligenter Software equipéiert, déi et erméiglecht, eng maximal Prozesstemperatur anzestellen. Den Ultraschallapparat pauséiert automatesch, wann d’Temperaturgrenz erreecht ass, a start d’Ultraschallbehandlung, wann eng agestallten Temperatur erreecht ass. D’Ofkille vun de Prouwen an engem Äisbad ass eng einfach Method, fir d’Temperatur vun de Prouwen niddereg ze halen an eng duerch Hëtzt verursaacht Degradatioun vun de Prouwen ze verhënneren.

Skaléierbarkeet: Ultraschallapparater mat Sond sinn a verschiddene Gréissten disponibel, vun Handapparater bis zu grousse Modeller fir den industriellen Asaz. Doduerch si se fir d’Veraarbechtung vu klenge Volummen am Laboratoire oder fir d’Skaléierung op méi grouss Bioveraarbechtungsapplikatioune gëeegent, z. B. d’Produktioun vun Impfstoffer oder d’Biosynthes vu Moleküllen.

Villsäitegkeet: Ultraschallapparater kënnen nieft der Zelllys fir verschidden aner Applikatioune benotzt ginn, wéi d’Fragmentéierung vun DNA duerch Schéierkräften, d’Proteinextraktioun, d’Homogeniséierung vu Gewëss, d’Dispersioun vun Nanopartikelen an d’Emulgéierung. Dofir bitt eng Investitioun an en Ultraschallapparat mat Sond villsäiteg Asazméiglechkeeten an der Fuerschung oder an der Industrie.

Ultraschallapparater mat Sond wéi den UP200St sinn zouverlässeg Geweebshomogenisateuren an Zellzerbriecher a ginn dofir vill fir d'Proufvirbereedung an der Genetik agesat, z. B. fir d'Lys vun E.coli

D’Proteinextraktioun aus E.coli-Zelle geschitt effizient mat der Ultraschallsond UP200St

En Ultraschallapparat mat Sond bitt vill Virdeeler fir d’Lys vun E. coli. Déi zouverlässeg a prezis Kontroll vun den Ultraschallprozessparameteren erméiglecht et, d’Betribsparameteren, wéi d’Leeschtung, d’Dauer an d’Handhabung vun de Prouwen, ze optiméieren, fir déi gewënschte Resultater ze erreechen.

Dës Uleedung erkläert, wéi eng Zort Ultraschallapparat sech am beschte fir Är Aufgabe bei der Prouwevirbereedung eegent, wéi Lys, Zellopschloss, Proteinisolatioun an d'Fragmentéierung vun DNA a RNA am Laboratoire, an der Analytik an an der Fuerschung. Wielt déi ideal Zort Ultraschallapparat fir Är Uwendung, Äre Prouwevolume, Är Prouwenzuel an Ären Duerchsaz. Hielscher Ultrasonics huet den idealen Ultraschallhomogenisator fir Iech!

D'DNA-Fragmentéierung mat Ultraschall gëtt heefeg als Schrëtt bei der Proufvirbereedung fir Next Generation Sequencing (NGS) agesat

Elektrophoreetesch Analyse vun der genomescher DNA vun E. coli EDL933 no enger Ultraschallbehandlung vun 0 – 15 min. L bezeechent d’DNA-Leeder.
(Etüd a Bild: ©Basselet et al. 2008)

Zellopbroch duerch Ultraschallkavitatioun

Ultraschallhomogenisatore mat Sond schaffen mat ongeféier 20.000 Zykle pro Sekonn (bei 20kHz) a verursaache Kavitatioun a Flëssegkeeten oder Suspensiounen. Bei der akustescher Kavitatioun entsti mikroskopesch Beräicher mat vakuumänlechen Drécker an héijen Temperaturen, déi Zellen auserneer rappen. Obwuel d’Temperature méiglecherweis e puer dausend Grad Celsius erreechen, sinn d’Kavitatiounsvolumenen esou kleng, datt si de Prozess net wesentlech erhëtzen. Déi duerch Ultraschall entstanen akustesch Kavitatioun a Schéierkräfte perforéieren oder zerstéieren d’Zellmembran vu Bakterienzelle wéi E.coli. Hielscher Ultraschallapparater erlaben eng präzis Kontroll vu Prozessparametere wéi Ultraschallintensitéit, Amplitud, Energieaféierung an Temperatur. Doduerch kann de Prozess vun der Ultraschalllys optimal un den Zelltyp, d’Zellkultur an d’Prozesszil ugepasst ginn.

Virdeeler vun der Ultraschalllys

präzis Kontroll vun der Lys (Intensitéit, Amplitud, Temperatur)
zouverlässeg, reproduzéierbar Resultater
optimal Upassung u spezifesch Prouwen
Temperaturkontroll
fir ganz kleng bis ganz grouss Prouwen (µL bis Liter)
reng mechanesch Behandlung
benotzerfrëndlechen, séchere Betrib
linear Vergréisserung vum Moossstaf vum Laboratoire bis an d’Produktioun

Den Ultraschallapparat VialTweeter erlaabt déi gläichzäiteg Proufvirbereedung vu bis zu 10 Prouffläsch ënner de selwechte Prozessbedéngungen. (Klickt fir ze vergréisseren!)

VialTweeter fir d’Ultraschalllys

Ultraschallhomogenisator am Verglach mat anere Lystechniken

Wärend déi cheemesch an déi enzymatesch Lys problematesch kënne sinn – well déi cheemesch Lys Proteinstrukture verännere kann a Problemer bei der Rengegung verursaache kann an déi enzymatesch Lys laang Inkubatiounszäiten erfuerdert an net reproduzéierbar ass – ass den Zellopschloss mat Ultraschall eng ausgefeilt, séier Method fir den Zellopschloss.
D’Ultraschalllys baséiert nëmmen op mechanesche Kräften. Et gi keng Chemikalien derbäigesat; d’Ultraschallbehandlung brécht d’Zellwand duerch Schéierkräften op. Déi cheemesch Lys kann d’Proteinstruktur veränneren a Problemer bei der Rengegung verursaachen. Den enzymateschen Zellopschloss erfuerdert laang Inkubatiounszäiten an ass net reproduzéierbar. Den Zellopschloss vun E.coli-Bakterienzelle mat Ultraschall ass séier, einfach, zouverlässeg a reproduzéierbar. Dofir ginn Hielscher Ultraschallapparater a biologeschen a biocheemesche Laboratoiren op der ganzer Welt fir d’Prouwevirbereedung, d’Preanalytik, d’In-vitro-Diagnostik a villfälteg Assaye benotzt.

Allgemeng Recommandatioune fir d’Ultraschalllys

D’Ultraschallbehandlung ass déi beléiftsten Technik fir d’Lys vu ganz klengen, mëttelgroussen a grousse Quantitéiten un Zellsuspensiounen – vu Pikoliter bis zu 100L/hr (mat enger Ultraschallduerchflosszell). D’Zelle ginn duerch Schéierkräften an der Flëssegkeet a Kavitatioun lyséiert. Och d’DNA gëtt wärend der Ultraschallbehandlung duerch Schéierkräfte fragmentéiert, soudatt et net néideg ass, DNase an d’Zellsuspensioun derbäizesetzen.

Temperaturkontroll wärend der Ultraschalllys vun E.coli
Andeems d’Prouf virgekillt a wärend der Ultraschallbehandlung op Äis gehale gëtt, kann den thermeschen Ofbau vun der Prouf einfach verhënnert ginn.
Idealerweis sollten d’Prouwe wärend der Lys äiskal gehale ginn, mee fir déi meescht Prouwen geet et duer, wann d’Temperatur net iwwer d’Temperatur vun der Kultur oder vum Ursprongsgeweebe klëmmt. Dofir gëtt recommandéiert, d’Suspensioun op Äis ze halen a mat e puer kuerzen Ultraschallimpulser vu 5–10 sec a Pause vun 10–30 sec ze behandelen. Wärend de Pause kann d’Hëtzt ofgefouert ginn, fir erëm eng niddreg Temperatur z’erreechen. Fir méi grouss Zellprouwe sti verschidden Duerchflossreaktere mat Killmantel zur Verfügung.
Liest hei detailléiert Tipps a Recommandatioune fir eng erfollegräich Ultraschalllys!

Protokoller fir d’Virbereedung vun E. Coli-Lysater mat Ultraschall

Fuerscher benotzen Hielscher Ultraschallhomogenisatore fir den Zellopschloss vun E.coli. Hei drënner fannt Dir verschidden getest a bewäert Protokoller fir d’Lys vun E.coli mat Hielscher Ultraschallhomogenisatore fir verschidden Uwendungen am Zesummenhang mat E. coli.

Zellwuesstem, Quervernetzung a Virbereedung vun E. coli-Zellextrakter mat Ultraschall

Fir SeqA- an RNA-Polymerase-ChIP-Chip gouf E. coli MG1655 oder MG1655 ΔseqA bei 37°C kultivéiert bis op eng OD₆₀₀ vun ongeféier 0,15 a 50 ml LB (+ 0,2% Glukos) kultivéiert, ier 27 μl Formaldehyd (37%) pro ml Medium bäigefüügt goufen (Endkonzentratioun 1%). D’Quervernetzung gouf ënner luesem Schëddelen (100 rpm) bei Raumtemperatur fir 20 min duerchgefouert an duerno duerch d’Zousaz vun 10 ml 2,5 M Glycin gestoppt (Endkonzentratioun 0,5 M). Fir Hëtztschockexperimenter gouf E. coli MG1655 a 65 ml LB-Medium bei 30°C bis zu enger OD₆₀₀ vun ongeféier 0,3 kultivéiert. Duerno goufen 30 ml vun der Kultur an e virgewiermte Kolwe bei 43°C iwwerdroen an de Rescht bei 30°C gehalen. D’Quervernetzung an d’Stoppe vun der Reaktioun goufe wéi uewe beschriwwen duerchgefouert, ausser datt d’Zelle fir 5 min bei 30 oder 43°C gehale goufen, ier se bei Raumtemperatur weider lues geschëddelt goufen. D’Zelle goufen duerch Zentrifugatioun gesammelt an zweemol mat kalem TBS (pH7.5) gewäsch. No der Resuspensioun an 1 ml Lysepuffer (10 mM Tris (pH 8,0), 20% Saccharos, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml Lysozym), der Inkubatioun bei 37°C fir 30 min an der uschléissender Zousaz vu 4 ml IP-Puffer goufen d’Zellen op Äis 12-mol fir jee 30 sec mat Pausë vun 30 sec mam Hielscher Ultraschallprozessor UP400St bei enger Leeschtungsastellung vun 100% beschallt. No enger Zentrifugatioun fir 10 min bei 9000 g goufen Aliquote vun 800 μl vum Iwwerstand bei -20°C gelagert. (Waldminghaus 2010)

Iwwerproduktioun a Rengegung vun Enzyme mat enger Ultraschallsond

Fir d’Iwwerproduktioun vu Proteinne mat engem Decahistidin-Markéierer (His10) gouf E. coli BL21(DE3) mat pET19b-Konstrukter transforméiert. Eng Virkultur, déi iwwer Nuecht kultivéiert gi war, gouf duerch Zentrifugatioun gesammelt, an 1% gouf benotzt, fir eng Expressiounskultur ze inokuléieren. Zellen, déi pET19mgtB droen, goufe bei 22°C bis zu enger optescher Dicht bei 600 nm (OD600) vun 0,7 kultivéiert. D’Kultur gouf op 17°C bruecht a mat 100 μM IPTG induzéiert. No 16 h gouf d’Kultur duerch Zentrifugatioun bei 7.500 × g a 4°C gesammelt. D’Zelle goufen a 50 mM phosphatgepufferter Salzléisung (PBS) mat 0,3 M NaCl bei pH 7,4 resuspendéiert an duerch Ultraschallbeschallung mat enger S2-Mikrospëtzesonotrod um Hielscher Ultraschallapparat UP200St bei engem Zyklus vun 0,5 an enger Amplitüd vu 75% opgespaart.
D’Iwwerproduktioun vu GtfC mat engem Decahistidin-Markéierer gouf bei 37°C bei enger OD₆₀₀ vun 0,6 mat 100 μM IPTG induzéiert. D’Zelle goufen duerno fir 4 h inkubéiert, gesammelt a lyséiert, wéi uewe fir MgtB beschriwwen.
Réizellextrakter goufe bei 15.000 × g a 4°C zentrifugéiert, fir d’Zellreschter ze sedimentéieren. Déi gekläert Extrakter goufe mat engem ÄKTAprime Plus-System op 1-ml HisTrap FF Crude-Saile gelueden. D’Enzyme goufen no dem Hiersteller sengem Protokoll fir d’Gradientelutioun vu Proteinne mat engem His-Markéierer gerengegt. Eluéiert Proteinléisunge goufen zweemol géint 1.000 Volumë vu 50 mM PBS, pH 7,4, mat 0,3 M NaCl bei 4°C dialyséiert. D’Rengegung gouf mat 12% SDS-PAGE analyséiert. D’Proteinkonzentratioun gouf mat der Bradford-Method mat Roti-Quant bestëmmt. (Rabausch et al. 2013)

Extraktioun vu Protein aus E. coli-Bakterie mat Ultraschall
E Köderprotein vun Interessi (an dësem Fall MTV1 vun Arabidopsis thaliana) gëtt mat engem GST-Markéierer fusionéiert an a BL21 Escherichia coli (E. coli)-Zellen expriméiert.

Huelt jee ee Pellet vu GST-MTV1 a GST (entspriechend 50 ml Bakteriekultur) a resuspendéiert all Pellet an 2,5 mL äiskalem Extraktiounspuffer.
Benotzt en Ultraschallapparat UP100H (mat enger MS3-Mikrospëtzesonotrod fir kleng Volumë vun ongeféier 2–5mL), fir d’Bakterienzellen opzespären, bis se lyséiert sinn, wat un enger reduzéierter Trübung an enger erhéichter Viskositéit ze erkennen ass. Dëst muss op Äis duerchgefouert ginn, an et gëtt recommandéiert, an Intervaller ze beschallen (z. B. 10 sec Beschallung, gefollegt vun enger Paus vun 10 sec op Äis an esou weider). Et muss drop opgepasst ginn, datt net mat enger ze héijer Intensitéit beschallt gëtt. Wa Schaumbildung oder d’Bildung vun engem wäissen Nidderschlag festgestallt gëtt, muss d’Intensitéit reduzéiert ginn.
Iwwerdrot d’Léisung mat de lyséierte Bakterien an 1,5 mL Mikrozentrifugeréiercher an zentrifugéiert bei 4°C a 16.000 x g fir 20 min.

Ultraschallsonde benotzen d'Kräfte vun der akustescher Kavitatioun, fir Zellen opzeschléissen a Moleküllen an DNA aus E.coli ze extrahéieren.

Ultraschallapparater mat Sond wéi den UP400St benotzen de Wierkungsprinzip vun der akustescher Kavitatioun fir déi effizient Lys vun E.coli.

Expressiounsanalys a Rengegung vu rekombinantem Protein mat Ultraschallbeschallung

Den E. coli-Pellet gouf mam Hielscher-Ultraschallapparat UP100H sonikéiert. Dofir gouf den Zellpellet a gekilltem Lysepuffer (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) resuspendéiert an 10 min op Äis gekillt. Duerno gouf d’Zellsuspensioun mat 10 kuerzen Impulser vu jee 10 s sonikéiert, mat engem Intervall vun 30 s fir ze killen no all Impuls. Zum Schluss goufen d’Zellreschter duerch Ultrazentrifugatioun bei 4°C fir 15 min bei 14.000 rpm ewechgeholl. Fir d’rPR-Expressioun ze bestätegen, gouf den Iwwerstand op engem 12% Polyacrylamidgel getrennt a mat SDS-PAGE a Western Blotting analyséiert. D’Rengegung vum rPR gouf mat Ni2+-NTA-Harz (Invitrogen, USA) no der Uleedung vum Hiersteller duerchgefouert. An dëser Etapp gouf eng nativ Rengegungsmethod benotzt. D’Rengheet vum gerengegte Protein gouf duerch Elektrophorees um 12% Polyacrylamidgel an uschléissend Fierwe mat Coomassie-Blo bewäert. D’Konzentratioun vum gerengegte Protein gouf mat engem Micro BCA-Proteinassay-Kit (PIERCE, USA) gemooss. (Azarnezhad et al. 2016)

Dëse Video weist den Ultraschall-Cuphorn mat 200 Watt fir d'Dispergéierung, d'Homogeniséierung, d'Extraktioun oder d'Entgasung vu Laborprouwen.

Ultraschallhomogenisateure fir d’Lyse vun E. coli

Hielscher Ultrasonics entwéckelt, fabrizéiert a liwwert héichleeschtungsfäeg Ultraschallhomogenisateure fir déi zouverlässeg an effizient Lyse vun E. coli-Bakterien an aneren Zellzorten, Stoffer an Zellkulturen.
Déi breet Produktpalette vun Ultraschallsonden a Systemer fir indirekt Sonikatioun erlaabt eis, Iech den idealen Ultraschall-Stoffhomogenisator fir Är Uwendung beim Zellopbroch a bei der Extraktioun unzebidden.

Entwécklung, Fabrikatioun a Berodung – Qualitéit aus Däitschland

Hielscher-Ultraschallapparater si fir hir héchst Qualitéits- an Designstandarde bekannt. Intelligent Software, en intuitive Menü, programméierbar Astellungen an automatesch Dateprotokolléierung si just e puer Eegenschafte vun den Hielscher-Ultraschallapparater. Robustheet an einfach Bedéngung erméiglechen déi reiwungslos Integratioun vun eisen Ultraschallapparater a Fuerschungs- a Biotechnologieariichtungen. Och mat haarde Bedéngungen an usprochsvollen Ëmfelder kommen Hielscher-Ultraschallapparater ouni Schwieregkeeten eens.

Hielscher Ultrasonics ass en ISO-zertifizéiert Betrib a leet besonnesche Wäert op héichleeschtungsfäeg Ultraschallapparater mat modernster Technologie a Benotzerfrëndlechkeet. Selbstverständlech sinn Hielscher-Ultraschallapparater CE-konform an erfëllen d’Ufuerderunge vun UL, CSA a RoHs.

Déi folgend Tabell gëtt Iech en Unhaltspunkt iwwer déi ongeféier Veraarbechtungskapazitéit vun eisen Ultraschallapparater:

Chargevolumen	Duerchflossrate	Recommandéiert Apparater
Multiwell- / Mikrotiterplacken	n.a.	UIP400MTP
CupHorn fir Prouwefläschen oder e Becherglas	n.a.	Ultraschall-CupHorn
Ultraschall-Mikroduerchflossreakter	n.a.	GDmini2
bis zu 10 Prouwefläsche mat 0,5 bis 1,5mL	n.a.	VialTweeter
0,5 bis 1,5mL	n.a.	VialTweeter
1 bis 500mL	10 bis 200mL/min	UP100H
10 bis 2000mL	20 bis 400mL/min	UP200Ht, UP400St
0,1 bis 20L	0,2 bis 4L/min	UIP2000hdT
10 bis 100L	2 bis 10L/min	UIP4000
n.a.	10 bis 100L/min	UIP16000
n.a.	méi héich	Verbund vun UIP16000

Kontaktéiert eis! / Frot eis!

De Video weist den Ultraschallsystem UIP400MTP fir d'Prouwevirbereedung, mat deem all Standard-Mikrotiterplacke mat héichintensivem Ultraschall zouverlässeg kënne preparéiert ginn. Typesch Uwendunge vum UIP400MTP sinn d'Zelllys, d'Schéiere vun DNA, RNA a Chromatin souwéi d'Proteinextraktioun.

Zousätzlech Protokoller fir d’Ultraschalllyse vun E. coli

Mat Allicin modifizéiert Proteinnen an E. coli mat engem Ultraschall-VialTweeter

Bestëmmung vum Sulfhydrylgehalt mam 5,5′-Dithiobis(2-Nitrobenzoesaier)-Assay (DTNB)
Eng iwwer Nuecht ugezu E. coli MG1655-Kultur gouf benotzt, fir MOPS-Minimalmedium ze inokuléieren (1:100). D’Kultur gouf aerob ugezunn, bis en A600 vun 0,4 erreecht war. D’Kultur gouf fir d’Stressbehandlung an dräi 15-ml-Kulturen opgedeelt. Eng onbehandelt Kultur huet als Negativkontroll gedéngt. Zu deenen aneren zwou Kulture gouf jeeweils entweder 0,79 mM Allicin (128 μg ml-1) oder 1 mM Diamid bäigefüügt. D’Kulture goufe fir 15 min inkubéiert. 5 ml vun all Kultur goufen duerch Zentrifugatioun (8.525 × g, 4°C, 10 min) recoltéiert. D’Zelle goufen zweemol mat 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, virum Gebrauch anaerob gelagert) gewäsch an zentrifugéiert (13.000 × g, 4°C, 10 min). D’Zelle goufen a Lysepuffer (PBS mat 6 mM Guanidinium-HCl, pH 7,4) resuspendéiert, ier se bei 4°C duerch Sonikatioun opgebrach goufen (VialTweeter Ultraschallapparat, Hielscher GmbH, Däitschland) (3 × 1 min). Zellreschter goufen duerch Zentrifugatioun (13.000 × g, 4 °C, 15 min) zu engem Pellet ofgesat. Den Iwwerstand gouf an eng 3,5-ml QS-Makroküvett (10 mm) mat engem magnetesche Réierstäbchen iwwerdroen a mat 1 ml Lysepuffer gemëscht. D’Extinktioun vun de Prouwe gouf bei Raumtemperatur bei 412 nm mat engem Jasco V-650 Spektrophotometer iwwerwaacht, dee mam temperaturgereegelte Küvettenhalter PSC-718 equipéiert war. 100μl vun enger 3 mM Dithiobis(2-Nitrobenzoesaier)-Léisung goufen derbäigesat. D’Extinktioun gouf iwwerwaacht, bis si d’Sättegung erreecht hat. D’Thiolkonzentratioun gouf mam Extinktiounskoeffizient ϵ₄₁₂ = 13.700 M^-1 cm^-1 fir Thio-2-Nitrobenzoesaier (TNB) berechent. Déi zellulär Thiolkonzentratioune goufen op Basis vun engem Volume vun den E. coli-Zelle vu 6,7 × 10^-15 Liter an enger Zelldicht vun A600 = 0,5 (entsprécht 1 × 10⁸ Zellen ml^-1 Kultur) berechent. (Müller et al. 2016)

In-vivo-Bestëmmung vu Glutathion mat engem Ultraschall-Zellopbriecher

E.coli MG1655 gouf a MOPS-Minimalmedium an engem Gesamtvolume vun 200ml kultivéiert, bis en A600 vun 0,5 erreecht war. D’Kultur gouf fir d’Stressbehandlung a 50-ml-Kulturen opgedeelt. No 15 min Inkubatioun mat 0,79 mM Allicin, 1 mM Diamid oder Dimethylsulfoxid (Kontroll) goufen d’Zellen duerch Zentrifugatioun bei 4.000g a 4°C fir 10 min gesammelt. D’Zelle goufen zweemol mat KPE-Puffer gewäsch, éier d’Pellets a 700µl KPE-Puffer resuspendéiert goufen. Fir d’Entproteiniséierung goufen 300l 10% (w/v) Sulfosalicylsaier derbäigesat, éier d’Zellen duerch Ultraschall opgebrach goufen (3 x 1 min; VialTweeter Ultraschallapparat). D’Iwwerstänn goufen no der Zentrifugatioun (30 min, 13.000g, 4°C) gesammelt. D’Sulfosalicylsaierkonzentratioune goufen duerch d’Derbäisetze vun 3 Volumë KPE-Puffer op 1% reduzéiert. D’Miessunge vum Gesamtglutathion a vum GSSG goufe wéi uewe beschriwwen duerchgefouert. Déi zellulär Glutathionkonzentratioune goufen op Basis vun engem Volume vun den E. coli-Zelle vu 6,7×10^-15 Liter an enger Zelldicht vun A600 0,5 (entsprécht 1×10⁸ Zellen ml^-1 Kultur) berechent. D’GSH-Konzentratioune goufe berechent, andeems 2[GSSG] vum Gesamtglutathion ofgezu goufen. (Müller et al. 2016)

Expressioun vu mënschlechem mAspAT an E. coli mat engem Ultraschallhomogenisator

Déi eenzel Kolonie vun E. coli BL21 (DE3), déi den Expressiounsvektor gedroen huet, gouf an 30 mL Luria-Bertani-Medium (LB) mat 100μg/mL Ampicillin duerno bei 37ºC kultivéiert, bis déi optesch Dicht (OD₆₀₀) 0,6 erreecht hat. D’Zelle goufen duerch Zentrifugatioun bei 4.000 × g fir 10 min gesammelt an an 3L frëschem LB-Medium mat 100μg/mL Ampicillin resuspendéiert.
Uschléissend gouf d’Proteinexpressioun mat 1 mM Isopropyl-β-ᴅ-1-thiogalactopyranosid (IPTG) fir 20 h bei 16ºC induzéiert. D’Zelle goufen duerch Zentrifugatioun bei 8.000 × g fir 15 min gesammelt a mat Puffer A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4) gewäsch. Aus 3 L Kultur goufen ongeféier 45g Zellen (Naassgewiicht) gewonnen. No der Zentrifugatioun goufen d’Zellpellets a 40 mL (fir 1 L Kultur) äiskalem Extraktiounspuffer A resuspendéiert a bei äiskaler Temperatur mat dem Hielscher Ultraschall-Zellopbriecher UP400St duerch Ultraschall lyséiert. D’Zelllysat gouf bei 12.000 rpm fir 15 min zentrifugéiert, fir déi léislech Fraktiounen (Iwwerstand) vun den ausgefällte Fraktiounen (Pellet) ze trennen. (Jiang et al. 2015)

Wëssenswäertes

E.coli

Escherichia coli (E. coli) ass e gramnegatiivt, fakultativ anaerobt, stäbchefërmegt, koliformt Bakterium aus der Gattung Escherichia, dat heefeg am ënneschten Daarm vu waarmbluddegen Organismen (Endothermen) virkënnt. Et gëtt eng grouss Zuel vun E. coli-Stämm (oder Ënnertyppe) mat ënnerschiddlechen Eegenschaften. Déi meescht E. coli-Stämm si fir Mënschen harmlos, z. B. d’B- a K-12-Stämm, déi heefeg fir Fuerschungsapplikatiounen a Laboratoirë benotzt ginn. Verschidde Stämm sinn awer schiedlech a kënne schwéier Krankheete verursaachen.
E. coli spillt eng wichteg Roll an der moderner biologescher Ingenieurstechnik an an der industrieller Mikrobiologie, well d’Bakterium sech einfach manipuléiere léisst. Zu den heefege Laborapplikatiounen, bei deenen E. coli dacks agesat gëtt, gehéieren z. B. d’Hierstellung vu rekombinanter Desoxyribonukleinsaier (DNA) oder den Asaz als Modellorganismus.
E. coli ass e ganz villsäitege Wiert fir d’Produktioun vun heterologe Proteinnen, an et sti vill verschidde Proteinexpressiounssystemer zur Verfügung, fir rekombinant Proteinnen an E. coli ze produzéieren. Mat Plasmiden, déi eng héich Proteinexpressioun erlaben, kënne Genen an d’Bakterien agefouert ginn, wouduerch esou Proteinnen a grousse Quantitéiten an industrielle Fermentatiounsprozesser produzéiert kënne ginn.
E.coli ginn als Zellfabricke benotzt, fir Insulin ze produzéieren. Weider Applikatiounen ëmfaassen den Asaz vu modifizéierten E. coli-Zelle fir d’Entwécklung an d’Produktioun vun Impfstoffer an immobiliséierten Enzymmen, fir d’Produktioun vu Biokraaftstoffer an och fir d’Bioremediatioun.
De Stamm K-12 ass eng mutant Form vun E. coli, déi den Enzym alkalesch Phosphatase (ALP) iwwerexpresséiert. Dës Mutatioun entsteet duerch en Defekt am Gen, dat stänneg fir den Enzym kodéiert. Wann e Gen e Produkt ouni iergendeng Hemmung produzéiert, gëtt dat als konstitutiv Aktivitéit bezeechent. Dës spezifesch mutant Form gëtt fir d’Isolatioun an d’Rengegung vum ALP-Enzym benotzt.
E. coli-Bakterie ginn och vill als Zellfabricken agesat. Technesch verännert Mikroben (z. B. Bakterien) a Planzេzelle kënnen als sougenannt Zellfabricke benotzt ginn. Dës genetesch verännert Zelle produzéiere Moleküllen, Chemikalien, Polymeren, Proteinnen an aner Substanzen, déi beispillsweis an der Pharma-, Liewensmëttel- a cheemescher Industrie agesat ginn. Fir d’Moleküllen, déi am Banneschte vun esou biotechnesch verännerten Zelle produzéiert ginn, fräizesetzen, ass d’Ultraschalllys eng heefeg benotzt Method, fir d’Zellwänn opzebriechen an d’Zilsubstanzen an déi ëmginnend Flëssegkeet ze iwwerdroen. Liest méi iwwer d’Lys vu biotechnesch verännerten Zellen!

DNA-Schéierung mat Ultraschall

Ultraschallschéierkräfte sinn eng heefeg benotzt Method, fir Moleküllen, Organellen a Proteinnen aus dem Zellbanneschte fräizesetzen an och DNA-Sträng a Stécker ze zerbriechen. Akustesch Kavitatioun brécht d’Zellwänn an d’Membranen op, fir DNA aus Zellen ze extrahéieren a Fragmenter mat enger Längt vun ongeféier 600 – 800 bp ze generéieren, wat ideal fir d’Analys ass.
Klickt hei, fir méi iwwer Ultraschallhomogenisateure fir d’DNA-Fragmentéierung gewuer ze ginn!

Literatur / Referenzen

Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.

Héichleeschtungsultraschall! D'Produktpalette vun Hielscher deckt de ganze Spektrum of, vum kompakten Ultraschallapparat fir de Labo iwwer Dëschapparater bis zu vollindustriellen Ultraschallsystemer.

Hielscher Ultrasonics stellt héichleeschtungsfäeg Ultraschallhomogenisateuren hier, vun Laborgréisst bis Industriegréisst.