Ultrasonic Lysis vun E. Colì

  • E. coli Bakterien sinn déi am meeschte verbreet Bakterien an der Mikrobiologie an der Biotechnologie.
  • D'Ultraschallzellenverzerrer léie serieuxen a reproduzierbare Resultater fir d'Lycis vun E. coli.
  • Intensi awer genau kontrolléierbar Kavitation a Scherr Kräften entstoen komplette Stéierungen an héich Ausnahmehuelen (zB Proteine, DNA).

Firwat ass Ultrasonic Zell Stéierung vun E. coli déi bevorzugt Method?

Ultrasonic Homogenisatoren oder Sonde-Typ Ultrasonicatoren bidden verschidde Virdeeler fir E. coli Lysis wéi intensiv Ultraschall effizient Zellmaueren a Membranen stéiert. Sonde-Typ Ultraschaller gi wäit benotzt fir E. coli Lysis aus de folgende Grënn:

  • Effizient Stéierung vun Zellmaueren: E. coli huet eng semi-steiwe Zellmauer aus Peptidoglykan, déi mat traditionelle Lysismethoden schwéier ka briechen. E Sonde-Typ Ultrasonicator generéiert intensiv Ultraschallwellen, déi Kavitatiounsblasen an der Flëssegkeet ronderëm d'Zellen kreéieren. Wann dës Bubbles kollapsen, generéiere se High-Speed-Flëssegstrahlen a Schockwellen, déi zu enger mechanescher Stéierung vun den Zellmaueren resultéieren, effektiv cellulär Inhalter wéi Biomoleküle fräiginn.
  • Verbesserte Pénétratioun: D'Ultraschallwellen, déi vun der Sond / Sonotrode generéiert ginn, kënnen déif an d'Probe penetréieren, eng méi grouss Zuel vun E. coli Zellen erreechen an se gläichméisseg behandelen. Dëst hëlleft sécherzestellen datt d'Lyse méi eenheetlech uechter d'Probe ass, wat zu enger méi héijer Zellstéierungseffizienz resultéiert.
  • Reduzéiert Veraarbechtungszäit: D'Energie, déi vum Sonde-Typ Ultraschall geliwwert gëtt, ass héich konzentréiert a lokaliséiert, wat zu enger schneller an effizienter Zelllysis féiert. Am Verglach mat anere Methoden wéi Perlen schloen oder enzymatesch Lysis, kann d'Sonicatioun E. coli Lysis bannent Minutten oder souguer Sekonnen erreechen. Wärend vill alternativ Techniken wéi Afréiere-Daching e puer Behandlungsronnen erfuerderen, mécht d'Ultraschalllysis Zellen an engem eenzege Prozessschrëtt op.
  • Temperaturregelung: State-of-the-art Ultrasonicators si mat Temperatursensoren a Smart Software ausgestatt, déi et erlaabt eng maximal Prozesstemperatur ze setzen. Den Ultrasonicator stoppt automatesch wann d'Temperaturlimit erreecht gëtt a fänkt den Sonikatiounsprozess un, wann e festgeluechte Temperaturpunkt erreecht gëtt. D'Proben an engem Äisbad ofkillen ass eng einfach Method fir d'Probetemperatur niddereg ze halen an d'Hëtzt-induzéiert Probedegradatioun ze vermeiden.
  • Skalierbarkeet: Probe-Typ Ultraschaller sinn a verschiddene Gréissten verfügbar, vun Handheld Geräter bis grouss industriell Modeller. Dëst mécht se gëeegent fir kleng Volumen am Laboratoire ze veraarbechten oder opzebauen fir méi grouss Bioveraarbechtungsapplikatiounen, zB Impfstoffproduktioun oder Biosynthese vu Molekülen.
  • Villsäitegkeet: Ultraschaller kënne fir verschidden Uwendungen iwwer Zell-Lysis benotzt ginn, sou wéi DNA-Schieren, Proteinextraktioun, Tissuhomogeniséierung, Nanopartikel-Dispersioun, an Emulsifikatioun. Dofir ass d'Investitioun an e Sonde-Typ Ultrasonicator eng Villsäitegkeet an der Fuerschung oder industriellen Astellungen.
  • Probe-Typ Ultraschaller wéi den UP200St sinn zouverlässeg Tissuehomogenisatoren an Zellkraaftwierker, dofir wäit benotzt fir Probepräparatioun an der Genetik, zB fir E.coli Lysis

    Proteinextraktioun aus E.coli Zellen gëtt effizient mat der Ultraschallsonde UP200St

    Probe-Typ Ultrasonicator bitt vill Virdeeler fir E. coli Lysis. Déi zouverlässeg a präzis Kontroll iwwer Ultraschallprozessparameter erlaabt d'Operatiounsparameter wéi Kraaft, Dauer a Probehandhabung ze optimiséieren fir déi gewënschte Resultater z'erreechen.
     

    Informatiounen ufroen




    Notéiert eis Privatsphär Politik.


     

    Dësen Tutorial erkläert wéi eng Zort Sonicator am Beschten ass fir Är Probepräparatiounsaufgaben wéi Lysis, Zellstéierung, Proteinisolatioun, DNA a RNA Fragmentatioun an Laboratoiren, Analyse a Fuerschung. Wielt déi ideal Sonicator-Typ fir Är Uwendung, Probevolumen, Probenummer an Duerchgang. Hielscher Ultrasonics huet den ideale Ultraschallhomogenisator fir Iech!

    Wéi fannt Dir de perfekte Sonicator fir Zellstéierung a Proteinextraktioun an der Wëssenschaft an der Analyse

    Video Thumbnail

    Ultrasonic DNA Fragmentatioun gëtt dacks als Probepräparatiounsschrëtt an Next Generation Sequencing (NGS) benotzt.

    Elektrophoretesch Analyse vun genomesch DNA vun E. coli EDL933 ënnerworf 0 - 15 min Ultraschall. L weist d'DNA Leeder un.
    (Etude a Bild: ©Basselet et al. 2008)

    Zell Stéierungen mat Ultraschall Kavitatioun

    Ultrasonic Sonde-Typ Homogenisatoren funktionnéieren mat ca. 20.000 Zyklen pro Sekonn (bei 20kHz) a verursaache Kavitatioun a Flëssegkeeten oder Suspensionen. Akustesch Kavitatioun mikroskopesch Gebidder vu Vakuumähnlechen Drock an héijen Temperaturen, déi Zellen auserneen räissen. Och wann d'Temperaturen e puer dausend Grad Celsius erreechen kënnen, sinn d'Kavitatiounsvolumen sou kleng datt se de Prozess net wesentlech erhëtzen. Ultraschall generéiert akustesch Kavitatioun a Schéierkräften perforéieren oder briechen d'Zellmembran vu bakteriellen Zellen wéi E.coli. Hielscher Ultraschaller erlaben déi präzis Kontroll iwwer Prozessparameter wéi Ultraschallintensitéit, Amplitude, Energieinput an Temperatur. Doduerch kann den Ultraschalllysisprozess optimal un d'Zelltyp, d'Zellkultur an d'Prozessziel ugepasst ginn.
     

    Virdeeler vun der Ultraschall Lysis

    • präzise Kontroll vu Lyse (Intensitéit, Amplitude, Temperatur)
    • zouverlässeg, reproduzéierbar Resultater
    • Optimal Adaptatioun op spezifesch Echantillon
    • Temperaturregelung
    • fir ganz kleng ze grouss Beispiller (μL bis Liter)
    • Reng mechanesch Behandlung
    • User-frëndlech, sécher Operatioun
    • linear Skala vu Laboratioun a Produktioun
    Den Ultraschall VialTweeter erméiglecht d'Simultane vun der Probenentstellung vu bis zu 10 Fläschtemperaturen ënner gläiche Prozessbedéngunge. (Klickt fir ze vergréisseren)

    VialTweeter fir Ultraschall Lysis

    Informatiounen ufroen




    Notéiert eis Privatsphär Politik.


    Ultraschall Homogenisator vs Aner Lysis Techniken

    Wärend chemesch an enzymatesch Lysis kann problematesch sinn – well méi chemesch Lysis kann Proteinstrukturen Äert Änneren an Äert Purifikatiounsproblemer entwéckelen an enzymatesch Lysis erfuerdert laang Inkubationzeechen a net reproduzéiert – Ultraschall Stéierung ass eng raffinéiert, rapid Zelle Stéierungsmethod.
    Ultrasonic Lysis baséiert nëmmen op mechanesche Kräfte. Kee Chemikalien ginn derbäigesat, d'Sonicatioun brécht d'Zellmauer duerch Schéierkräften. Chemesch Lysis kann d'Proteinstruktur änneren an d'Rengungsproblemer aféieren. Enzymatesch Stéierung erfuerdert laang Inkubatiounszäiten an ass net reproduzéierbar. Ultrasonic Zell Stéierungen vun E.coli Bakterien Zellen ass séier, einfach, zouverlässeg a reproduzéierbar. Dofir ginn Hielscher Ultraschaller an biologeschen a biochemesche Laboratoiren ronderëm d'Welt benotzt fir Probepräparatioun, Pre-Ananlytik, In-vitro-Diagonstik a villfälteg Assays.

    Allgemeng Empfehlungen fir Ultraschall Lysis

    Sonication ass déi populärst Technik fir Lysen ganz kleng, mëttler a grouss Quantitéiten vun Zellverloschter – vu Pico-Liter bis zu 100L / hr (mat enger Ultraschall-Flosszelle). D'Zellen gi vu flësse Scherr a Kavitation lyséiert. D'DNA ass och bei der Sonikatioun geschäerft, sou datt et net néideg ass DNase fir d'Zellsuspension ze addéieren.
     

    Temperaturkontroll während Ultraschall E.coli lysis
    Ultraschall Zell Stéierungen UP100H (100W) fir Zell Stéierungen an Extraktioun vun Planz Verbindungen.Duerch d'Prékoolung vun der Probe an d'Préift bei der Opléisung op Ie ze halen, kann d'Prouf-thermale Degradatioun vun der Probe ganz einfach verhënneren.
    Idealerweis sollten d'Proben äiskal gehal ginn wärend der Lysis, awer fir déi meescht Proben ass et genuch wann d'Temperatur net iwwer d'Temperatur vun der Kultur oder Tissuquell eropgeet. Dofir ass et recommandéiert d'Suspension op Äis ze halen a mat e puer kuerzen Ultraschallimpulsen vun 5-10 Sekonnen a Pausen vun 10-30 Sekonnen ze sonikéieren. An de Pausen kann sech d'Hëtzt opléisen, fir nees eng niddreg Temperatur opzebauen. Fir gréisser Zellproben si verschidde Flowzellreaktoren mat Killjacken verfügbar.
    Liest hei detailléiert Tipps a Empfehlung fir eng erfollegräich Ultraschalllysis!

    Protokoller fir d'Ultraschall Virbereedung vun E. Coli Lysates

    Fuerscher benotzen Hielscher Ultraschall Homogenisatoren fir E.coli Zell Stéierungen. Hei ënnen fannt Dir verschidde gepréift a bewährte Protokoller fir E.coli Lysis mat Hielscher Ultraschallhomogenisatoren fir verschidde E. coli-bezunnen Uwendungen.
     

    Dëse Videoclip weist den Hielscher Ultraschall Homogenisator UP100H, en Ultraschall, dee wäit benotzt gëtt fir Probepräparatioun an Laboratoiren.

    Ultraschall Homogenizer UP100H

    Video Thumbnail

    Zellwachstum, Crosslinking a Virbereedung vun E. coli Zellextrakter mat Ultraschall

    Fir SeqA- a RNA-Polymerase ChIP-Chip E. coli MG1655 oder MG1655 ΔseqA gouf bei 37 ° C zu engem OD600 vun ongeféier 0,15 a 50 ml LB (+ 0,2% Glukos) viru 27 μl Formaldehyd (37%) pro ml Medium ass ofgehal (Final Konzentratioun 1%). D'Verknëppung gouf bei ongeféier 20 min bei Zueltemperatur geluewt (100 U / min) gefaangen a duerno mat 10 ml 2,5 M Glycin (Ennkonzentratioun 0,5 M) ofgeschwächt. Fir Hëtzt-Shock Experimenter gouf d'E. coli MG1655 an 65 ml LB-Medium bei 30 ° C zu engem OD600 vun ongeféier 0,3. Duerno gouf 30 ml Kultur an eng virgewiermt Kolbe bei 43 ° C transferéiert an de Rescht bei 30 ° C gehal. Crosslinking a Quenching war wéi uewe beschriwwen ausser datt d'Zellen bei 30 oder 43 ° C fir 5 min gehale goufen ier se weider lues bei Raumtemperatur schüttelen. Zellen sech duerch centrifugation gesammelt an zweemol mat kal TBS (pH7.5) gewäsch. No resuspension an 1 ml lysis Prellbock (10 mM Tris (pH 8.0), 20% sucrose, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg / ml lysozyme) an incubation bei 37 ° C fir 30 min gefollegt vun Zousätzlech vun 4 ml IP Puffer goufen d'Zellen op Äis mat 12 Mol 30 Sekonnen an 30 Sekonnen Pausen mat dem Hielscher Ultraschallprozessor UP400St bei 100% Power Setting sonikéiert. No 10 min centrifugation bei 9000 g, 800 μl aliquotes vun der supernatant sech bei -20 ° C gespäichert. (Waldminghaus 2010)
     

    Iwwerproduktioun a Reinigung vun Enzymen mat enger Ultraschallsonde

    Ultrasonicator UP100H ass e Labo Homogenisator dacks fir Probepräparatioun vun Zellkulturplacke benotzt.Fir overproduction vun decahistidine (His10)-tagged Proteinen, E. coli BL21 (DE3) war mat pET19b baut transforméiert. Eng Iwwernuechtung Prekultur gouf duerch Zentrifugéierung gesammelt, an 1% gouf benotzt fir en Ausdrockkultur ze inoculéieren. Zellen, déi pET19mgtB droen, goufen bei 22 ° C ugebaut bis eng optesch Dicht bei 600 nm (OD600) vun 0,7. D'Kultur gouf op 17 ° C transferéiert an duerch 100 μM IPTG induzéiert. No 16 Stonnen gouf d'Kultur duerch Zentrifugéierung bei 7.500 × g bei 4 ° C gesammelt. Zellen goufen an 50 mM phosphat-gebufferter Salzlinn (PBS) mat 0,3 M NaCl bei pH 7,4 resuspendéiert an duerch Ultraschall mat enger S2 Mikro-Tipp Sonotrode am Hielscher Ultrasonicator UP200St bei engem Zyklus vun 0,5 an enger Amplitude vu 75% gestéiert.
    D'Iwwerproduktioun vu Decahistidin-markéiert GtfC gouf bei 37 ° C bei OD induzéiert600 0,6 mat 100 μM IPTG. D'Zellen goufen dann fir 4 Stonnen inkubéiert, gesammelt a lyséiert wéi et scho fir MgtB bekannt ass.
    Rau Zellextrakter goufen bei 15.000 × g a 4 ° C centrifugéiert fir d'Zellschutt ze sedimentéieren. Déi geklärten Extrakter goufen op 1-ml HisTrap FF Crude Sailen gelueden mat engem ÄKTAprime Plus System. D'Enzyme goufen no dem Hiersteller d'Protokoll fir Gradient elution vun His-tagged Proteinen gereinegt. Elutéiert Proteinléisungen goufen zweemol géint 1.000 Bänn vu 50 mM PBS, pH 7,4, mat 0,3 M NaCl bei 4 ° C dialyséiert. D'Preinung gouf vun 12% SDS-PAGE analyséiert. D'Konzentratioun vum Protein gouf duerch d'Bradford Method mat Roti-Quant bestëmmt. (Rabausch et al. 2013)
     

    Ultraschall Extraktioun vu Protein aus E. coli Bakterien
    E Bait-Protein vun Interesse (an dësem Fall, MTV1 vun Arabidopsis thaliana) ass fir e GST-Tag verschmolzelt an ausgedréckt an de BL21 Escherichia Coli (E. coli) Zellen.

    1. Huelt eng Pellet vu GST-MTV1 a GST (entspriechend 50 ml bakteriell Kultur) a resuspendéiert all an 2,5 ml äiskal Extraktiounsbuffer.
    2. Benotzt en Ultraschall UP100H (equipéiert mat MS3 Microtip-Sonotrode fir kleng Volumen vun ongeféier 2-5mL) fir d'Bakterienzellen ze stéieren bis se lyséiert sinn, wat duerch reduzéierter Opazitéit a verstäerkter Viskositéit bezeechent gëtt. Dëst muss op Äis duerchgefouert ginn, an et ass recommandéiert an Intervalle ze sonicéieren (zB 10 Sekonnen Sonikatioun gefollegt vun 10 Sekonnen Paus op Äis a sou weider). Opgepasst muss net mat ze héich Intensitéit sonicate ginn. Wann Schaum oder d'Bildung vun engem wäisse Nidderschlag festgestallt gëtt, muss d'Intensitéit erofgesat ginn.
    3. Transfert déi lyséiert Bakterienléisung op 1,5 ml Mikrocentrifuge-Tubes a centrifugéiert bei 4 ° C, 16.000 xg fir 20 min.

     

    Ultrasonic Sonden benotzen d'Kräfte vun der akustescher Kavitatioun fir Zelle ze stéieren an Molekülen an DNA aus E.coli ze extrahieren.

    Sonde-Typ Ultraschaller wéi den UP400St benotzt den Aarbechtsprinzip vun der akustescher Kavitatioun fir déi effizient Lysis vun E.coli.

    Ausdrock Analyse a Reinigung vum Rekombinant Protein mat Hëllef vu Sonication

    D'E. coli Pellet gouf mat dem Hielscher Ultraschall UP100H sonicéiert. Fir dësen Zweck gouf Zellpellet a gekillte Lysisbuffer (50 mM Tris-HCl pH = 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) resuspendéiert a fir 10 min op Äis gekillt. Duerno gouf d'Zellsuspension mat 10 kuerze Bursts vun 10 s sonicated gefollegt vun engem Intervall vun 30 s fir ze killen. Endlech gouf d'Zellschutt duerch Ultracentrifugatioun bei 4 ° C fir 15 min bei 14000 RPM geläscht. Fir Bestätegung vun rPR Ausdrock, war de supernatant op 12% polyacrylamide gelies lafen an duerch SDS-PAGE a Western blotting analyséiert. Offäll vun rPR war mat Ni2 gemaach + -NTA resin (Invitrogen, USA) laut den Hiersteller Guide. An dëser Etapp gouf gebierteg Reinigungsmethod benotzt. D'Rengheet vun der gereinegt Protein war mat electrophoresis op der 12% polyacrylamide gelies a spéider Coomassie blo staining bewäert. Purifizéiert Protein Konzentratioun gouf duerch Mikro BCA Protein Assay Kit (PIERCE, USA) gemooss. (Azarnezhad et al. 2016)
     

    Dëse Video weist den 200 Watt Ultrasonic Cuphorn fir d'Dispergéierung, Homogeniséierung, Extrait oder Entgasung vu Labo Proben.

    Ultrasonic Cuphorn (200 Watt)

    Video Thumbnail

    Ultraschall Homogeniséierer fir E. coli Lysis

    Hielscher Ultrasonics designt, fabrizéiert a liwwert High-Performance Ultrasonic Homogenisatoren fir déi zouverlässeg an effizient Lysis vun E. coli Bakterien an aner Zelltypen, Gewëss a Zellkulturen.
    De breede Portfolio vun Ultraschallsonden wéi och indirekt Sonikatiounssystemer erlaabt eis Iech den ideale Ultraschallgewebe Homogenisator fir Är Zellstéierung an Extraktiounsapplikatioun ze bidden.

    Design, Fabrikatioun a Berodung – Qualitéit Made in Germany

    Hielscher Ultraschaller kënnen op Fernseh kontrolléiert ginn iwwer Browser Kontroll. Sonication Parameteren kënnen iwwerwaacht a genee un de Prozess Ufuerderunge ugepasst ginn.Hielscher Ultraschaller si bekannt fir hir héchst Qualitéit an Designnormen. Smart Software, intuitiv Menü, programméierbar Astellungen an automatesch Dateprotokolléierung sinn nëmmen e puer Features vun Hielscher Ultraschaller. Robustheet an einfach Operatioun erlaben déi glat Integratioun vun eisen Ultraschaller an d'Fuerschung an d'Biotech Ariichtungen. Och rau Konditiounen an erfuerderlech Ëmfeld ginn einfach vun Hielscher Ultraschaller gehandhabt.

    Hielscher Ultrasonics ass eng ISO zertifizéiert Firma a setzt spezielle Wäert op High-Performance Ultrasonicatoren mat modernste Technologie a Benotzerfrëndlechkeet. Natierlech sinn Hielscher Ultraschaller CE konform an entspriechen d'Ufuerderunge vun UL, CSA a RoHs.

    D'Tabellner ënnert Iech en Indikatioun vun der ongeféieren Veraarbechtkapazitéit vun eisem Ultraschall:

    Konte gefouert QShortcutDuerchflossraterecommandéiert Comments
    Multi-Well / Mikrotiter PlackenaUIP400MTP
    CupHorn fir Fläschen oder BechernaUltraschall CupHorn
    Ultraschall Mikro-Flow ReaktornaGDmini2
    bis zu 10 Fläschen mat 0,5 bis 1,5 mlnaVialTweeter
    0.5 an 1,5mLnaVialTweeter
    1 bis 500mL10 bis 200mL / minUP100H
    10 bis 2000mL20 bis 400mL / minUP200Ht, An UP400St
    0.1 bis 20L0.2 bis 4L / minUIP2000hdT
    10 bis 100L2 bis 10L / minUIP4000
    na10 bis 100L / minUIP16000
    naméi groussStärekoup vun UIP16000

    Kontaktéiert eis! / Frot eis!

    Frot méi Informatiounen

    Benotzt w.e.g. de Formulaire hei drënner fir zousätzlech Informatioun iwwer Ultraschall Tissue Homogenisatoren an Zellbrecher, Lysisapplikatiounen a Präisser ze froen. Mir wäerte frou Äre Prozess mat Iech ze diskutéieren an Iech en Ultraschallhomogenisator ze bidden, deen Är Ufuerderungen entsprécht!










    De Video weist den Ultraschall-Probe-Preparatiounssystem UIP400MTP, wat d'verlässlech Probepräparatioun vun all Standard Multi-Well Platen erlaabt mat héijer Intensitéit Ultraschall. Typesch Uwendunge vum UIP400MTP enthalen Zelllysis, DNA, RNA, a Chromatin Scheren souwéi Proteinextraktioun.

    Ultrasonicator UIP400MTP fir Multi-Well Plack Sonikatioun

    Video Thumbnail

    Zousätzlech Protokoller fir Ultraschall E. coli Lysis

    Allicin-modifizéiert Proteinen an E. coli mat engem Ultrasonic VialTweeter

    VialTweeter am Ultraschallprozessor UP200STDeterminatioun vu Sulfhydryl Inhalt vu 5,5'-Dithiobis (2-Nitrobenzoesäure) (DTNB) Assay
    Eng E. coli MG1655 Iwwernuechtungskultur gouf benotzt fir MOPS minimal Medium (1:100) ze inoculéieren. D'Kultur gouf aerob gewuess bis en A600 vun 0,4 erreecht gouf. D'Kultur gouf an dräi 15-ml Kulturen fir Stressbehandlung opgedeelt. Eng onbehandelt Kultur huet als negativ Kontroll gedéngt. 0,79 mm Allicin (128 μg ml-1) oder 1 mm Diamid gouf zu enger vun de verbleiwen zwou Kulturen all dobäigesat. Kulturen goufen fir 15 min inkubéiert. 5 ml vun all Kultur goufen duerch Zentrifugéierung (8.525 × g, 4 ° C, 10 min) gesammelt. D'Zellen goufen zweemol mat 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, anaerobe gespäichert virum Gebrauch) gewäsch an centrifugéiert (13.000 × g, 4 ° C, 10 min). Zellen goufen am Lysis-Puffer (PBS mat 6 mM guanidinium HCl, pH 7.4) resuspendéiert virun der Stéierung bei 4 ° C duerch Ultraschall (VialTweeter Ultraschall, Hielscher GmbH, Däitschland) (3 × 1 min). Zell Debris gouf duerch Zentrifugéierung (13.000 × g, 4 ° C, 15 min) pelletéiert. De Supernatant gouf op eng 3,5 ml QS-Makro-Kuvette (10 mm) mat enger magnetescher Rührbar transferéiert a mat 1 ml Lysisbuffer gemëscht. D'Ausstierwen vun de Proben gouf bei 412 nm mat engem Jasco V-650 Spektrofotometer iwwerwaacht mat dem PSC-718 Temperaturkontrolléierten Zellhalter bei Raumtemperatur. 100μl vun enger 3 mM Dithiobis (2-Nitrobenzoic Seier) Léisung goufen dobäi. Ausstierwen gouf iwwerwaacht bis et Sättigung erreecht huet. D'Berechnung vun der Thiol Konzentratioun gouf mam Ausstierwenskoeffizient ϵ gemaach412 = 13.700 M-1 cm-1 fir Thio-2-Nitrobenzoesäure (TNB). Zelluläre Thiolkonzentraktioune baséiert op engem Volume vun E. coli Zellen vu 6,7 × 10-15 Liter an eng Zelldicht vun A600 = 0,5 (entsprécht 1 × 108 Zellen ml-1 Kultur). (Müller et al 2016)
     

    In Vivo Glutathion Bestëmmung mat Hëllef vun engem Ultrasonic Cell Crusher

    E.coli MG1655 gouf am MOPS Minimalmedium an engem Gesamtvolumen vun 200ml ugebaut bis en A600 vun 0,5 erreecht gouf. D'Kultur gouf a 50-ml Kulturen fir Stressbehandlung opgedeelt. No 15 min Inkubatioun mat 0,79 mm Allicin, 1 mm Diamid oder Dimethylsulfoxid (Kontroll), goufen d'Zellen bei 4.000g bei 4 ° C fir 10 min gesammelt. Zellen goufen zweemol mat KPE Puffer gewäsch virum Resuspension vu Pellets an 700μl KPE Puffer. Fir Deproteinéierung goufen 300l vun 10% (w / v) Sulfosalicylsäure bäigefüügt virum Stéierungen vun Zellen duerch Ultraschall (3 x 1 min; VialTweeter Ultraschall). D'Nieweroller goufen no Zentrifugatioun gesammelt (30 min, 13.000 g, 4 ° C). D'Sulfosalicylic Säurekonzentratioune waren op 1% eropgaang duerch d'Zousatz vun 3 Bänn vum KPE Buffer. D'Messungen vum totale Glutathion a GSSG goufen wéi et hei beschriwwe gëtt. Celluläre Glutathion-Konzentra- riounen baséiert op engem Volume vun E. coli Zellen vu 6,7×10-15 Liter an eng Zelldicht vun A600 0,5 (entsprécht 1×108 Zellen ml-1 Kultur). D'GSH Konzentraie rechnen duerch Subtraktioun vun 2 [GSSG] vun total Glutathion. (Müller et al 2016)

    Ausdrock vu Mënsch mAspAT an E. coli mat engem Ultraschall Homogenisator

    D'Ultraschallzellenverletzung UP400St (400 W) fir d'Extraktioun vun intrazellulärer Matière (zB Proteinen, Organelen, DNA, RNA etc.)Déi eenzel Kolonie vum E. coli BL21 (DE3), déi den Expressiounsvektor am 30 mL Luria-Bertani (LB) -Mittel enthalen, deen 100μg / mL Ampicillin enthielt, an duerno 37 ° C kierstlech bis déi optesch Dicht (OD600) erreecht 0.6. D'Zellen goufen 10 Zentimeter zentrifugéiert op 4000 × g a resuspendéiert an 3L frëschen LB-Medium, deen 100μg / mL Ampicillin enthalen.
    Duerno gouf Protein Ausdrock mat 1 mM Isopropyl β-ᴅ-1-thiogalactopyranoside (IPTG) fir 20 Stonnen bei 16ºC entschlof. D'Zelle goufen duerch Zentrifugéierung bei 8.000 × g fir 15 min gesammelt a mat Puffer A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4) gewascht. Ongeféier 45g (naass Gewiicht) Zellen goufen aus 3 L Kultur kritt. No der Zentrifugéierung goufen d'Zellpellets an 40 ml (fir 1 L Kultur) äiskal Extraktiounsbuffer A resuspendéiert, a lyséiert duerch Ultraschall bei äiskaler Temperatur mat Hëllef vum Hielscher Ultraschallzell Crusher UP400St. D'Zelllysis gouf bei 12.000 rpm fir 15 min centrifugéiert fir soluble (supernatant) a precipitéiert (Pellet) Fraktiounen ze trennen. (Jiang et al. 2015)
     



    Fakten Wësse wat weess

    E.coli

    Escherichia Coli (E. coli) ass e gram-negativ, fakultativ anaeroben, stabfërmegen, coliform Bakterium vun der Gattung Escherichia, déi allgemeng am nërderen Darm vun Warmbluddungen (Endothermen) fonnt gëtt. Et gi villen E. coli Stämme (oder Ënnertypen) mat verschiddene Charakteristiken. Déi meescht E. coli-Stämme sinn onerliewend fir Mënschen, zB B an K-12 Stämme déi allgemeng fir Rechercheanwendungen an Laboratoiren benotzen. Awer verschidde Stämme sinn schiedlech a kënnen e schlechte Krankheet verursaachen.
    E. coli spillt eng wichteg Roll am modernen biologesche Ingenieur- an Industriem mikrobiologie, well d'Bakterien einfach ze manipuléieren. Gemeinsame Laborapplikatiounen, déi oft d'Verwäertung vun der E. coli involvéiert sinn, zB fir Rekombinante-Desoxyribonucleinsäure (DNA) ze produzéieren oder als Modellorganismus ze handelen.
    E. coli ass e ganz versatile Wirt fir d'Produktioun vu heterologen Proteinen, an e wéivensfache Protein Expressiounssysteme sinn zur Produktioun vun rekombinante Proteinen an E. coli produzéiert. Mat Plasmiden, déi eng exzellente Expressioun vu Protein léisen, kënnen Genen an d'Bakterien agefouert ginn, déi et erméiglecht fir esou Proteine ze produzéieren an héigen Mengen bei industriellen Fermentatiounsprozess.
    E.coli ginn als Zellfabrike benotzt fir Insulin ze produzéieren. Weider Applikatiounen enthalen d'Benotzung vu modifizéierten E. coli Zellen fir Impfungen an immobiliséiert Enzymen z'entwéckelen an ze produzéieren, fir Biokraftstoffer ze produzéieren, wéi och fir d'Bioremediatioun.
    De Stamm K-12 ass eng mutant Form vun E. coli, déi d'Enzym Alkaline Phosphatase (ALP) iwwerdréit. Dës Mutatioun fällt wéinst engem Defekt am Gene deen ëmmer fënnt fir de Enzym. Wann e Gen produzéiert en Produkt ouni T Inhibitioun dat ass als konstitutive Aktivitéit bekannt. Dës spezifesch mutéiert Form gëtt fir d'Isolatioun an d'Purifikatioun vum ALP-Enzym benotzt.
    E. coli Bakterien ginn och vill als Zellfabriken benotzt. Konstruéiert Mikroben (zB Bakterien) a Planzenzelle kënnen als sougenannte Zellfabriken benotzt ginn. Dës genetesch modifizéiert Zellen produzéieren Molekülle, Chemikalien, Polymeren, Proteinen an aner Substanzen, déi zum Beispill an der Pharma-, Liewensmëttel- a chemescher Industrie benotzt ginn. Fir d'Moleküle, déi am Interieur vun esou bioengineeréierten Zellen produzéiert ginn, fräizeloossen, ass Ultraschalllysis eng allgemeng Method fir d'Zellmaueren ze stéieren an d'Zielstoffer an d'Flëssegkeet ëmginn ze transferéieren. Liest méi iwwer d'Lysis vu bioengineeréierten Zellen!

    Ultrasonic DNA Enzyklopedie gehéiert

    Ultrasonic Schéierkräfte sinn eng allgemeng benotzt Method fir Molekülen, Organellen a Proteinen aus dem Zellinterieur ze befreien an och DNA Strécke a Stécker ze briechen. Akustesch Kavitatioun brécht d'Zellmaueren a Membranen fir DNA aus Zellen ze extrahieren a Fragmenter vun ongeféier 600 ze generéieren – 800 bp laang, dat ass ideal fir d'Analyse.
    Klickt hei fir méi iwwer Ultraschallhomogeniseren fir DNA-Fragmenter ze léieren!

    Literatur / Referenzen


    Héich performant Ultraschall! D'Hielscher Produktpalette befaasst de ganze Spektrum vum kompakten Labo Ultraschall iwwer Bench-Top Eenheeten bis voll industriell Ultraschallsystemer.

    Hielscher Ultrasonics fabrizéiert performant Ultraschall Homogeniséierer aus Labo ze industriell Gréisst.


    Mir wäerte frou Äre Prozess ze diskutéieren.

    Loosst eis a Kontakt kommen.