Ultrasonic Lysis vun E. Colì

• E. coli Bakterien sinn déi am meeschte verbreet Bakterien an der Mikrobiologie an der Biotechnologie.
• D'Ultraschallzellenverzerrer léie serieuxen a reproduzierbare Resultater fir d'Lycis vun E. coli.
• Intensi awer genau kontrolléierbar Kavitation a Scherr Kräften entstoen komplette Stéierungen an héich Ausnahmehuelen (zB Proteine, DNA).

Zuel Stéierungen duerch Kavitationen

Ultraslon-probe-Typ Homogeniseren si mat ca. 20.000 Zyklen pro Sekonn (bei 20 kHz) a verursachen Kavitation an Flëssegkeeten oder Supersiounen. Akustesch Kavitationen mikroskopesch Gebidder vun vakuumäermt Drëck an héijer Temperaturen, déi d'Zellen auserneen sinn. Obwuel d'Temperaturen méi wéi 1000 Tonnen Celsius erreechen kënnen, Kavitationbänn sinn esou kleng datt se de Prozess net erwiermen. Den Ultraschall deen d'akustesch Kavitation generéiert an d'Scherr kräizer perforéiert oder d'Zellmembran vum E. coli – ofhängeg vun der Apparatestatioun vum Ultraschall Homogenisateur.

Virdeeler vun der Ultraschall Lysis

• präzise Kontroll vu Lyse (Intensitéit, Amplitude, Temperatur)
• Optimal Adaptatioun op spezifesch Echantillon
• Temperaturregelung
• fir ganz kleng ze grouss Beispiller (μL bis Liter)
• reng mechanesch Behandlung
• linear Skala vu Laboratioun a Produktioun

Och chemesch an enzymaktesch Lysis kann problematesch sinn – well méi chemesch Lysis kann Proteinstrukturen Äert Änneren an Äert Purifikatiounsproblemer entwéckelen an enzymatesch Lysis erfuerdert laang Inkubationzeechen a net reproduzéiert – Ultraschall Stéierung ass eng raffinéiert, rapid Zelle Stéierungsmethod.
Ultraschall Lyse baséiert nëmmen op mechanesch Kräfte. Kee Chemikalien ginn addéieren, d'Zännung brécht d'Zellmauer duerch Scherr Kräften. Chemesch Lyphis kann Änneren vun der Protein änneren an d'Préiftproblematik féieren. Enzymatesch Stéierungen erfuerdert laang Inkubatiounsait an ass net reproduzéiert.

Allgemeng Recommandatiounen

Sonication ass déi populärst Technik fir Lysen ganz kleng, mëttler a grouss Quantitéiten vun Zellverloschter – vu Pico-Liter bis zu 100L / hr (mat enger Ultraschall-Flosszelle). D'Zellen gi vu flësse Scherr a Kavitation lyséiert. D'DNA ass och bei der Sonikatioun geschäerft, sou datt et net néideg ass DNase fir d'Zellsuspension ze addéieren.
Temperaturregelung:
Duerch d'Prékoolung vun der Probe an d'Préift bei der Opléisung op Ie ze halen, kann d'Prouf-thermale Degradatioun vun der Probe ganz einfach verhënneren.
Ideal ass d'Probabilitéit bei der Lyse eis iéch Kälte gehal ginn, awer fir déi meescht Proben ass et genuch, wann d'Temperatur net méi héich wéi d'Temperatur vu Kultur oder Gewierzquell ass. Daat ass dofir recommandéiert fir d'Suspension op Eis ze halen a mat puer kierzlech Ultraschallimpulsen vu 5-10 Sekonnen a Pausen vun 10-30 Sekonnen ze halen. Während den Pausen ass d'Hëtzt verdrécke kënnen, fir eng niddereg Temperatur ze féieren. Fir méi grouss Zellproblemer, sinn verschidden Stroumzellenreaktoren mat Këftejacken verfügbar.

Protokoller fir d'Virbereedung vum E. Coli Lysates

Expressionanalyse a Purenung vum rekombinante Protein

De E. coli Pellet gouf mat engem Ultraschallsystem behandelt UP100H (Hielscher). Zu dësem Zweck gouf Zellpellet an enger gekillter Lysepuffer (50 mM Tris-HCl pH = 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF resuspendéiert) an 10 Minutten geklomm. Dann ass d'Zellsuspension mat 10 kurze Burstelen vun 10 s ugestallt ginn, gefollegt vun Intervall vun 30 s zum Ofkillen. Schlussendlech goufen d'Zerstéierung vun Zellen duerch Ultrazentrifugatioun bei 4 ° C fir 15 min bei 14000 U / min entfernt. Fir d'Confirmatioun vu RPR-Expressioun de Supernatant op 12% Polyacrylamidgelen gefeelt an analyséiert duerch SDS-PAGE an a Western blotting. D'Veraarbechtung vu RPR gouf mam Ni benotzt²⁺-NTA Harz (Invitrogen, USA) no dem Guillem des Guides. An dëser Etappe gouf natierlesch Verféierung Method gebraucht. D'Reinheet vum gereinegtene Protein gouf iwwer d'Elektrophorese vum 12% Polyacrylamidgel bezeechent a duerno de Coomassie bloe Flecken. Gëfteg Protein Konzentratioun ass mam Micro BCA Protein Assay Kit (PIERCE, USA) gemooss. (Azarnezhad et al 2016)

Zelle Wuesstem, Vernetzung a Virbereedung vun E. coli Cell Extracts

Fir SeqA- a RNA-Polymerase ChIP-Chip E. coli MG1655 oder MG1655 ΔseqA gouf bei 37 ° C zu engem OD₆₀₀ vun ongeféier 0,15 a 50 ml LB (+ 0,2% Glukos) viru 27 μl Formaldehyd (37%) pro ml Medium ass ofgehal (Final Konzentratioun 1%). D'Verknëppung gouf bei ongeféier 20 min bei Zueltemperatur geluewt (100 U / min) gefaangen a duerno mat 10 ml 2,5 M Glycin (Ennkonzentratioun 0,5 M) ofgeschwächt. Fir Hëtzt-Shock Experimenter gouf d'E. coli MG1655 an 65 ml LB-Medium bei 30 ° C zu engem OD₆₀₀ vun ongeféier 0,3. Duerno goufen 30 ml Kultur op e Warmolger bei 43 ° C transferéiert an de Rescht ënner 30 ° C gehaal. Vernetzung a Verstoppen ass wéi et scho beschriwwe ginn ass ausser datt d'Zellen op 30 oder 43 ° C fënnef Minuten laang gedauert hunn, virun weider Verléiere vu Raumtemperatur. D'Zellen goufen duerch Zentrifugatioun gesammelt an zweemol mat kalem TBS (pH7,5) gewäsch. Duerch Resuspensionen an 1 ml Lysepuffer (10 mM Tris (pH 8,0), 20% Sucrose, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg / ml Lysozym) an Inkubatioun bei 37 ° C fir 30 min, an duerno 4 ml IP Buffer, Zellen goufen op Eis mat 12x 30 Sekonnen a 30 Sekonnen Bremsen bei engem UP400St Ultraschall-Prozesser (Hielscher Ultrasonics GmbH) mat 100% Muecht. No Zentrifugatioun fir 10 min bei 9000 g, 800 μl Aliquoten vum Iwwerstand sinn bei -20 ° C gelagert. (Waldingerhaus 2010)

Iwwerproduktioun an d'Veréierung vun Enzymen.

Fir d'Iwwerproduktioun vu Decahistidin (His10) -tagged Proteinen, gouf d'E. coli BL21 (DE3) mat pET19b-Konstrukten transforméiert. Eng Iwwernuechtung gouf geheelt duerch Zentrifugatioun, an 1% gouf benotzt fir eng Expressionskultur z'evaluéieren. D'Zellen, déi pET19mgtB entstoen, goufen bei 22 ° C wuesse bis zu enger optescher Dicht op 600 nm (OD₆₀₀) vun 0,7. D'Kultur gouf op 17 ° C iwwerginn an duerch 100 μM IPTG induzéiert. No 16 Auer gouf d'Kultur duerch Zentrifugatioun bei 7.500 × g bei 4 ° C gefrot. D'Zellen goufen an 50 mM Phosphat-gepuffert Salzlinn (PBS) mat 0,3 M NaCl bei pH 7,4 resuspendéiert a gestrooft duerch Ultraschall mat engem S2 Mikrodip Sonotrode an der UP200St Ultraschall (Hielscher, Teltow, Däitschland) bei engem Zyklus vu 0,5 an eng Amplitude vun 75%.
D'Iwwerproduktioun vu Decahistidin-markéiert GtfC gouf bei 37 ° C bei OD induzéiert₆₀₀ 0,6 mat 100 μM IPTG. D'Zellen goufen dann fir 4 Stonnen inkubéiert, gesammelt a lyséiert wéi et scho fir MgtB bekannt ass.
Zu Crudelzell-Extrakter goufen 15.000 × g an 4 ° C zerstéiert. Déi gekuckt Extrakter goufen op 1-ml HisTrap FF Crude Späicher benotze mat engem ÄKTAprime Plus System (GE Healthcare). D'Enzyme goufen nach dem Protokoll vum Hersteller fir d'Gradienteluktioun vun His-tagged Proteins gereinegt. Elutéiert Proteinlösungen goufen zweemol mat 1.000 Bänn vun 50 mM PBS, pH 7,4, mat 0,3 M NaCl bei 4 ° C dialyséiert. D'Purifikatioun gouf analyséiert mat 12% SDS-PAGE. D'Konzentratioun vu Protein gouf vun der Bradford-Methode mat Roti-Quant festgeluecht (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Däitschland). (Rabausch et al 2013)

Extraktioun vum Protein aus E. coli Bakterien
E Bait-Protein vun Interesse (an dësem Fall, MTV1 vun Arabidopsis thaliana) ass fir e GST-Tag verschmolzelt an ausgedréckt an de BL21 Escherichia Coli (E. coli) Zellen.
1. Huelt een Pellet vu GST-MTV1 a GST (entspriechend 50 ml Bakterienkultur) an all weider an 2,5 mL Éiskëllchen-Extraitpuffer.
2. Mat Ultraschall benotzen UP100H (mat MS3 Mikrotip-Sonotrode fir kleng Volumen (2-5mL) ausgestatt ginn, fir d'Bakterienzellen ze stéieren bis si lyséiert sinn, wat duerch reduzéierter Opazitéit an erhéijere Viskositéit bezeechent gëtt. Dëst muss op Äis ausgezeechent ginn, an et ass recommandéiert ze sinn an Intervalle (zB 10 sec sonicating followed by 10 sec op Eis an sou weider). Pfleeg muss ze halen net ze sonicate mat ze héich Intensitéit. Wann d'Schamung oder d'Bildung vu wäissem Niederschlag festgestallt gouf, muss d'Intensitéit gesenkt ginn.
3. D'lyséiert Bakterien-Léisung fir 1,5 mL Mikrozentrifugenruppen a Zentrifuge bei 4 ° C, 16.000 xg fir 20 min.

Allicin-modifizéiert Proteinen an E. coli

Determinatioun vu Sulfhydryl Inhalt vu 5,5'-Dithiobis (2-Nitrobenzoesäure) (DTNB) Assay
E M. coli MG1655 Nuechtend Kultur gouf benotzt fir MOPS Minimalmedezin (1: 100) ze vermëschen. D'Kultur gouf aerob gewachsen bis en A600 vun 0,4 erreecht gouf. D'Kultur gouf an dräi 15-ml Kulturen zur Stressbehandlung gespaut. Eng onbehandelte Kult war eng negativ Kontroll. 0,79 mM allicin (128 ug ml^-1) oder 1 mM Diamid ass dobäi zu enger vun de Rescht zwee Kulturen addéieren. Kulturen hu sech 15 min. 5 ml vun all Kultur ginn duerch Zentrifugatioun (8.525 × g, 4 ° C, 10 min) gefaasst. D'Zellen goufen zweemol mat 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄, pH 7,4, geséchert an anaerobe Verstoppen) a zentrifugéiert (13.000 × g, 4 ° C, 10 min). D'Zellen goufen an de Lysepuffer (PBS mat 6 mM Guanidinium HCl, pH 7,4) resuspendéiert, virun enger Stéierung bei 4 ° C duerch Ultraschall (VialTweeter Ultraschall, Hielscher GmbH, Däitschland) (3 × 1 min). Zort Ofriis gouf pelletéiert duerch Zentrifugatioun (13.000 × g, 4 ° C, 15 min). De Supernatant gouf op eng 3,5-ml QS-Makro Kuvette (10 mm) mat enger Magnéitrührer iwwergeléist an gemëscht mat 1 ml Lysis-Puffer. D'Ausstiwwerschreitung vun de Proben gouf mat 412 nm mat engem Spektrofotometer Jasco V-650 iwwerwaacht, mat der temperaturreguléierter Zellhalter (Jasco) PSC-718 bei Raumtemperatur ausgestatt. 100μl vun enger 3 mM Dithiobis (2-Nitrobenzoesäure) Léisung goufen addéiert. Ausstiichtung gouf iwwerwaacht bis se d'Sätti erreecht huet. D'Berechnung vu Thiolkonzentratioun gouf duerch den Ausstiessungskoeffizienten ε gemaach₄₁₂ = 13.700 M^-1 cm^-1 fir Thio-2-Nitrobenzoesäure (TNB). Zelluläre Thiolkonzentraktioune baséiert op engem Volume vun E. coli Zellen vu 6,7 × 10^-15 Liter an enger Zelldichte vun A₆₀₀ = 0,5 (gläichwäerteg mat 1 × 10⁸ Zellen ml^-1 Kultur). (Müller et al 2016)

In Vivo Glutathione Determinatioun

E.coli MG1655 gouf am MOPS minimal Medium a Gesamtvolumen vun 200ml zu engem A gewachst₆₀₀ vun 0,5 erreecht gouf. D'Kultur gouf an 50-ml Kulturen zur Stressbehandlung opgespléckt. No 15 min Inkubatioun mat 0,79 mM Allicin, 1 mM Diamid oder Dimethylsulfoxid (Kontroll), goufen Zellen op 4.000g bei 4 ° C fir 10 min gefruer. D'Zellen goufen zweemol mat KPE-Puffer viru Wiederverwénkelung vu Pellets an 700μl KPE Buffer gewaschen. Fir deproteinatioun goufen 300l vun 10% (w / v) Sulfosalicylsäure zu der Zerstéierung vun Zellen duerch Ultraschall (3 x 1 min; VialTweeter Ultraschall). D'Nieweroller goufen no Zentrifugatioun gesammelt (30 min, 13.000 g, 4 ° C). D'Sulfosalicylic Säurekonzentratioune waren op 1% eropgaang duerch d'Zousatz vun 3 Bänn vum KPE Buffer. D'Messungen vum totale Glutathion a GSSG goufen wéi et hei beschriwwe gëtt. Celluläre Glutathion-Konzentra- riounen baséiert op engem Volume vun E. coli Zellen vu 6,7×10^-15 Liter an enger Zelldichte vun A₆₀₀ 0.5 (entsprécht 1×10⁸ Zellen ml^-1 Kultur). D'GSH Konzentraie rechnen duerch Subtraktioun vun 2 [GSSG] vun total Glutathion. (Müller et al 2016)

Expression vum menschleche mAspat an E. coli

Déi eenzel Kolonie vum E. coli BL21 (DE3), déi den Expressiounsvektor am 30 mL Luria-Bertani (LB) -Mittel enthalen, deen 100μg / mL Ampicillin enthielt, an duerno 37 ° C kierstlech bis déi optesch Dicht (OD₆₀₀) erreecht 0.6. D'Zellen goufen 10 Zentimeter zentrifugéiert op 4000 × g a resuspendéiert an 3L frëschen LB-Medium, deen 100μg / mL Ampicillin enthalen.
Duerno gouf Protein Ausdruck induzéiert mat 1 mM Isopropyl-β-ᴅ-1-thiogalactopyranosid (IPTG) fir 20 h bei 16 ° C. D'Zellen goufen 15 min duerch Zentrifugatioun bei 8.000 × g ernéiert a wäscht mat Puffer A (20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, pH 7,4). Approximéiert 45g (naass Gewiicht) Zellen goufen aus 3 L Kultur. No Zentrifugatioun goufen d'Zellpellets 40 mol (fir 1 L Kultur) e Kalee-Equippe Puffer A resuspendéiert an an Ultraschall bei eiskaltem Temperatur lyséiert mat engem UP400St Instrument (Dr. Hielscher GmbH, Däitschland). D'Zelllysis gouf bei 12.000 U / min fir 15 min zougetrëppelt fir luesléis (iwwersinneg) a gefleet (Pellet) Fractions ze trennen. (Jiang et al., 2015)

D'Tabellner ënnert Iech en Indikatioun vun der ongeféieren Veraarbechtkapazitéit vun eisem Ultraschall: