Protokoll fir SARS-CoV-2 Coronavirus Inaktivéierung mat Sonication

Den Hielscher VialTweeter ass eng eenzegaarteg Ultraschall Multi-Probe Virbereedungseenheet, déi benotzt gëtt fir de Coronavirus SARS-COV-2 z'inaktivéieren. De VialTweeter erlaabt et bis zu 10 Probe Fläschen gläichzäiteg virzebereeden an ass domat déi ideal Eenheet fir Masseprozessveraarbechtung.

Inaktivéierung vum SARS-CoV-2 Coronavirus mam VialTweeter

Nom Ofhuelung vum Fixativ goufen d'Monolayer dräimol mat phosphat-gebufferte Salz (PBS) gewäsch ier Zellen an 1 ml MEM / 5% FBS geschrauft goufen a sonikéiert (3 × 10 Sekonn un, 10 Sekonnen aus op 100% Kraaft an Amplitude) mam Hielscher Ultraschall-Prozessor UP200St mat VialTweeter Unhang. Supernatants goufen duerch Zentrifugéiere bei 3000 × g fir 10 min gekläert. Liest de komplette Protokoll hei fir d'SARS-CoV-2 Coronavirus Inaktivéierung vum Welch et al. (2020) ënner:

Zellen a Virus

Vero E6 Zellen (Vero C1008; ATCC CRL-1586) goufen am modifizéierten Eagle's minimalen essentiellen Medium (MEM) kultivéiert ergänzt mat 10% (v / v) fetal Kalbsserum (FCS). Virus benotzt gouf SARS-CoV-2-Stamm hCOV-19 / England / 2/2020, isoléiert vum PHE aus dem éischte Patientekoup a Groussbritannien den 29/01/2020. Dëse Virus gouf um Passage 1 kritt a fir Inaktivéierungstudien um Passage 2 oder 3 benotzt.
Fir Reagentien a Chemikalien déi fir SARS-CoV-2 Inaktivéierung benotzt ginn, souwéi d'Ewechhuele vu Reagentzytotoxizitéit kuckt w.e.g. de wëssenschaftleche Bericht vu Welch et al. (2020).

Virus Inaktivéierung duerch Wäschmëttelen – SARS-CoV-2 Coronavirus Inaktivatiounsprotokoll vum Welch et al. 2020

SARS-CoV-2 Inaktivéierung

Fir kommerziell Produkter, Virbereedungen (Tissuekultur Flëssegkeet, Titercher variéiere vun 1 × 10⁶ op 1 × 10⁸ PFU / ml) goufen dräimol mat Reagentien a Konzentratioune behandelt a fir Kontaktzäiten, déi an den Hiersteller d'Instruktioune fir d'Benotzung empfohlen goufen, wou verfügbar, oder fir Konzentratiounen an Zäiten, déi speziell vun Testlaboratoiren ugefrot goufen. Wou eng Rei vu Konzentratioune vum Hiersteller gegeben gouf, gouf dat niddregst Verhältnis vu Produkt zu Prouf getest (dh nidderegst recommandéiert Konzentratioun vum Testprodukt). Exemplarentransport Rouer Reagentë goufe mat engem Verhältnis vun engem Volumen Tissuekultur Flëssegkeet bis zéng Bänn Reagens getest, ausser e Volumen Verhältnis vu Probe Flëssegkeet zu Reagens gouf vum Hiersteller spezifizéiert. Wäschmëttelen, Fixéierer a Léisungsmëttel goufen an den uginnene Konzentratioune fir déi uginn Zäiten getest. All Inaktivéierungsschrëtt goufen bei Raumtemperatur (18 - 25 ° C) gemaach. Fir Testen vun alternativen Prouftypen, gouf de Virus an déi uginn Proufmatrix an engem Verhältnes vun 1: 9 gespaut, duerno mat Testreagent wéi uewe behandelt. All Experimenter abegraff triplicate Kontroll mierkt-behandelt Echantillon mat engem gläichwäerteg Volume vun PBS am Plaz vun Test reagent. Direkt no der erfuerderter Kontaktzäit gouf 1 ml behandelt Probe mat der entspriechend ausgewielter Filtratiounsmatrix veraarbecht. Reagent Entfernung fir Inaktivéierungstest gouf an engem méi grousse Spin-Spaltformat duerchgefouert mat Pierce 4mL Detergent Entfernung Spin Kolonnen (Thermo Fisher), oder andeems eidel Pierce 10mL Kapazitéit Zentrifugekolonnen (Thermo Fisher) mat SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR oder Fëllung Sephadex LH-20 fir 4mL gepackt Perlen / Harz ze ginn. Fir Offäll mat Amicon Filteren, goufen 2 × 500μl Echantillon mat zwee Zentrifugalfilter mat der virdru beschriwwener Method gereinegt, duerno zesummegefaasst. Fir Formaldehyd a Formaldehyd mat Glutaraldehyd Entfernung gouf e Filter mat 1 × 500μl Probe Volumen benotzt, no der Veraarbechtung an 500μl PBS resuspendéiert, an zu 400ul MEM / 5% FBS derbäigesat. Fir Inaktivéierung vun infizéierten Monolayer, 12,5 cm² Fläschen vun Vero E6 Zellen (2,5 × 10⁶ Zellen / Fläsch an 2,5 ml Mem / 5% FBS) goufen um MOI 0,001 infizéiert a bei 37 ° C / 5% CO₂ fir 24 Stonnen. Supernatant gouf geläscht, an Zellen fixéiert mat 5 ml Formaldehyd, oder Formaldehyd a Glutaraldehyd fir Raumtemperatur fir 15 oder 60 Minutten. De Fixative gouf ofgeschaaft, a Monolayer dräimol mat PBS gewascht ier se Zellen an 1 ml MEM / 5% FBS geschrauft hunn a sonikéiert goufen (3 × 10 Sekonn un, 10 Sekonnen aus bei 100% Kraaft an Amplitude) mat engem UP200St mat VialTweeter Uschlëss (Hielscher Ultraschall) Technologie). Supernatants goufen duerch Zentrifugéiere bei 3000 × g fir 10 min gekläert.

Detailer vum Reagens fir SARS-CoV-2 Coronavirus Inaktivéierung mam Ultraschall VialTweeter no dem Protokoll vum Welch et al. 2020

De komplette Protokoll mat der Benotzung vum Hielscher VialTweeter fannt Dir hei:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Raffinéiert Ultraschall Demembratoren an Zell Disruptoren

De Multi-Probe Ultraschall VialTweeter ass just eng vu ville Ultraschall Léisunge fir Proufvirbereedung a biologeschen, biochemeschen a klineschen Laboratoiren. Hielscher Ultrasonics bitt den ideale Ultraschall-Démembrator fir Är Uwendung, zB Zelllysis, Zellextraktioun, Tissue Homogeniséierung, Lysat Solubiliséierung, Opléisung, Prouf Entgasung etc.
Loosst eis wësse wéi vill Proben Dir pro Stonn an Dag veraarbecht hutt, wann Dir direkt oder indirekt Opléisung léiwer hutt a wat d'Zil vun der Ultraschallbehandlung ass. Mir empfeelen Iech déi passend Ultraschall Eenheet fir Är deeglech Aarbechtsroutine!
Hielscher Ultrasonics 'digital Ultraschallveraarbechter si mat intelligenter Software ausgestatt, automatesch Datenaufnahme, einfach Virausbezuelungsoptioune fir Temperaturregelung, Opléisungsdauer, Zyklus / Puls-Modus souwéi Probe Beliichtung a Browser Fernsteuerung. Mir beméien eis Ultraschall-Geräter sou schlau wéi méiglech ze maachen, sou datt Är Fuerschung an Aarbechtsroutine sou bequem an erfollegräich wéi méiglech gëtt.
Klickt hei, fir méi Uwendungen ze fannen, dorënner Protokoller vun der Ultraschallproufvirbereedung mam VialTweeter!