Ultrasonic Lysis vun Drosophila Melanogaster Samples

Drosophila melanogaster gëtt vill an Laboratoiren als Modellorganismus benotzt. Dofir, pre-analytesch Virbereedung Schrëtt wéi Lysis, Zell Stéierungen, Protein Extraktioun an DNA Schéier vun Drosophila melanogaster Echantillon mussen dacks duerchgefouert ginn. Ultrasonic Dismembrater sinn zouverlässeg an effizient a kënne benotzt ginn fir verschidden Aufgaben wéi Lysis, Proteinextraktioun oder DNA Fragmentatioun einfach ze maachen andeems se nëmmen Ultraschallprozessparameter upassen. Ultrasonic Homogenisatoren sinn doduerch flexibel Tools mat enger breeder Palette vun Uwendungen.

Ultraschall Lysis a Protein Extraktioun

Lysis, Zellsolubiliséierung, Tissuehomogeniséierung a Proteinextraktioun sinn typesch Aufgaben fir Ultraschall-Dismembratoren a biologesche Laboratoiren. Ultrasonic Dismembrater an Zellstéierer si gutt ugepasst fir Déieregewebe, Insekten (zB Drosophila melanogaster, C. elegans) oder Planzenexemplaren ze homogeniséieren. Spéider Uwendungen vun Ultraschall sinn d'Lyse vun Zellsuspensioune a Pellets wéi och d'Extraktioun vun intrazelluläre Proteinen.
Ultrasonic Lysis a Protein Extraktioun sinn héich zouverlässeg a reproduzéierbar Prozesser, déi op Basis vu etabléierte Protokoller ausgefouert kënne ginn. Zënter Ultraschallprozessintensitéit ka genee ugepasst ginn iwwer Sonikatiounsparameter wéi Amplitude, Zyklus / Pulsmodus, Temperatur a Probevolumen, eemol bewisen Protokoller kënne mat deemselwechte Resultat ëmmer erëm widderholl ginn.

Ultraschall DNA a RNA Fragmentatioun

No Zelllysis a Proteinextraktioun ass e gemeinsame erfuerderleche Schrëtt an der Probepräparatioun d'Schéier a Fragmentatioun vun DNA, RNA a Chromatin, zB virun der Chromatin Immunoprecipitatioun (ChIP). DNA a RNA Fragmentatioun kann zouverlässeg erreecht ginn andeems d'kovalente Bindungen briechen, déi d'DNA duerch kierperlech Kräften zesummenhalen. Mat kierperlecher Schéier wéi Sonikatioun, am Ufank ginn d'DNA Strécke gebrach, da gëtt d'DNA a méi kleng Stécker fragmentéiert.
Ultraschall DNA Fragmentatioun ass zouverlässeg an effizient fir DNA op eng geziilte Längt ze schneiden, zB 500bp (Basispaar). Déi grouss Virdeeler vun der Ultraschall DNA Fragmentatioun enthalen déi präzis Kontroll vun den Ultraschallprozessparameter an Intensitéit. D'Ultraschallprozessparameter kënnen ugepasst ginn andeems d'Sonicatiounsintensitéit, Zyklen an Zäit präzis ofstëmmen. Dëst mécht et méiglech gewënschte DNA Gréissten ze kreéieren an déi gezielt DNA Längt kann zouverlässeg produzéiert a reproduzéiert ginn. Ultrasonic DNA Scheren ass och ideal fir DNA Fragmenter mat héijer molekulare Gewiicht ze kreéieren.

Protokoller fir Ultraschall Lysis vun Drosophila melanogaster

Hei ënnen fannt Dir verschidde Protokoller fir d'Ultraschall-assistéiert Lysis, Protein Extraktioun, an DNA oder Chromatin Fragmentatioun vun Drosophila Proben.

Ultrasonic Lysis fir Cross-linking Immunoprecipitation (CLIP) Assay

CLIP Assay gouf gemaach wéi virdru gemellt mat e puer Ännerungen. Ongeféier 20 mg Eierstock vun 0- bis 1-Dag-ale Wild-Typ Weibercher goufen UV vernetzt (3 × 2000 μJ /cm2), homogeniséiert op Äis an 1 ml RCB-Puffer (50 mm HEPES pH 7,4, 200 mm NaCl, 2,5 mm). MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM Saccharose, 1 mM DTT, 1 × EDTA-gratis Komplett Protease-Inhibitoren, 1 mM PMSF) ergänzt mat 300 U RNAseOUT an op Äis fir 30 min. Den Homogenat gouf op Äis sonicéiert, bei 80% Kraaft, fënnef Mol an 20 s Bursts mat engem 60 s Rescht tëscht dem Hielscher Ultrasonic Prozessor UP100H (100 W, 30 kHz) an centrifugéiert (16000 × g fir 5 min bei 4 ° C). Soluble Extrait gouf mat 20 μl Protein-G Dynabeads fir 20 min bei 4 ° C precleared. No Ewechhuele vun Echantillon fir immunoblotting an quantitation vun RNS Input (1%), HP1 war immunoprecipitated mat Anti-HP1 9A9 antibody aus 450 μl precleared Extrait vun incubation fir 4 h mat 50 μl Protein-G dynabeads. Immunoprecipitate goufen 4 Mol mat RCB gewäsch. Fir déi immunoprecipitéiert RNAs ze elueren, goufen d'pelletéiert Perlen an 100 μL UltraPure DEPC-behandelt Waasser fir 5 min gekacht. 900 μL Qiazol Reagens gouf an de Supernatant bäigefüügt, dee fir d'RNA Virbereedung erholl gouf. D'RNA gereinegt gouf als Schabloun benotzt fir cDNA ze synthetiséieren mat Oligo dT, zoufälleg Hexameren a SuperScript ëmgedréint Transkriptase III no dem Protokoll vum Hiersteller.
(Cassale et al. 2019)

Ultrasonic Lysis fir Chromatin Immunoprecipitation Assay

Chromatin immunoprecipitation war no der Method vun Menet beschriwwen mat kleng Ännerungen gesuergt. Ongeféier 20 mg Eierstock vun 0- bis 1-Dag-ale Wild-Typ Weibercher goufen an 1 ml NEB-Puffer homogeniséiert (10 mM HEPES-Na bei pH 8.0, 10 mM NaCl, 0.1 mM EGTA-Na bei pH 8, 0.5 mM) EDTA-Na bei pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM Spermidine, 0,15 mM Spermin, 1 × EDTA-fräi Komplett Protease Inhibitoren) mat engem Homogenisator / Tauchdisperger 1 min (bei 3000 rpm). De Homogenat gouf op e pre-gekillte Glasdoun transferéiert a 15 voll Striche goufen mat engem enge Pistel applizéiert. Free Käre goufen dann bei 6000xg fir 10 min bei 4 ° C centrifuged. D'Käre-enthale Pellets goufen an 1 ml NEB resuspendéiert a bei 20000 × g fir 20 min op Saccharosegradient centrifugéiert (0,65 ml vun 1,6 M Saccharose an NEB, 0,35 mL vun 0,8 M Saccharose an NEB). De Pellet gouf an 1 ml NEB a Formaldehyd op eng final Konzentratioun vun 1% suspendéiert. Käre goufen fir 10 min bei Raumtemperatur vernetzt a gestoppt andeems 1/10 Vol vun 1.375 M Glycin bäigefüügt gouf. D'Käre goufen duerch Zentrifugatioun bei 6000 × g fir 5 min gesammelt. Käre goufen zweemol an 1 ml NEB gewäsch an an 1 ml Lysis Buffer resuspendéiert (15 mM HEPES-Na bei pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA bei pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na Deoxycholate, 0,1% SDS, 0,5% N-Lauroylsarcosin an 1 × EDTA-fräi Komplett Protease-Inhibitoren). Nuclei goufen sonicated mat engem Hielscher Ultrasonic Prozessor UP100H (100 W, 30 kHz) sechs Mol fir 20 s op an 1 min op Äis. Sonicated Käre goufen op 13000 × g fir 4 min bei 4 ° C centrifuged. D'Majoritéit vum sonikéierte Chromatin war 500 bis 1000 Basepaar (bp) an der Längt. Fir all immunoprecipitation, 15 μg vun chromatin war an der Präsenz vun 10 μg vun HP1 9A9 monoclonal antibody incubated (3 h bei 4 ° C an engem rotativ Rad). Duerno gouf 50 μl Dynabeads Protein G bäigefüügt an d'Inkubatioun gouf iwwer Nuecht bei 4 ° C weidergefouert. D'supernatants goufen entsuergt an Echantillon waren zweemol am Lysis Buffer (all wäschen 15 min bei 4 ° C) an zweemol am TE Buffer (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl um pH 8) gewäsch. Chromatin gouf aus Perlen an zwee Schrëtt elued; éischt an 100 μl Eluition Buffer 1 (10 mm EDTA, 1% SDS, 50 mm TrisHCl um pH 8) bei 65 ° C fir 15 min, gefollegt vun centrifugation an Erhuelung vun der supernatant. Beads Material gouf an 100 μl TE + 0,67% SDS erëm extrahéiert. D'kombinéiert eluate (200 μl) war Iwwernuechtung bei 65 ° C incubated Kräiz-Linken ëmgedréint a vun 50 μg /ml RNaseA fir 15 min bei 65 ° C behandelt an duerch 500 μg /ml Proteinase K fir 3 h bei 65 ° C. Echantillon goufen Phenol-Chloroform extrahéiert an Ethanol ausgefall. DNA gouf an 25 μl Waasser resuspendéiert. Fir d'molekulare Analysen mat DNA immunoprecipitéierten ze maximéieren, goufen d'Kandidatgenen a Pairen duerch en optimiséierten Duplex-PCR Protokoll verstäerkt andeems zwee verschidde Sätz vu Primer benotzt mat ähnlechen Schmelztemperaturen an enger eenzeger Reaktioun.
(Casale et al. 2019)
 

High-Performance Ultrasonic Cell Disruptors fir Biologesch Proben

Hielscher Ultrasonics ass Äre laang erfuerene Partner wann et ëm High-Performance Ultrasonicatoren kënnt fir Zellstéierung, Lysis, Proteinextraktioun, DNA, RNA, a Chromatin Fragmentatioun wéi och aner pre-analytesch Probe Virbereedung Schrëtt. Bitt e komplette Portfolio vun Ultraschall Labo Homogenisatoren a Probepräparatiounsunitéiten, Hielscher huet den ideale Ultraschallapparat fir Är biologesch Applikatioun an Ufuerderungen.
Klassesch Sonde-Typ Ultrasonicator mat Mikro-Tipp wéi den UP 200 St (200W; kuckt Bild lénks) oder eng vun den Ultraschall-Probepreparatiounsunitéiten VialTweeter oder UP200ST_TD_CupHorn mat VialHolder sinn Léifsten Modeller an Fuerschung an analytesch Laboratoiren. Déi klassesch Ultraschallsonde ass ideal, wann Dir manner Proben virbereet muss lyséiert, extrahéiert oder fragmentéiert ginn. D'Probepräparatiouns Eenheeten VialTweeter an UP200St_TD_CupHorn erlaben d'simultan Sonikatioun vu bis zu 10 oder 5 Fläschen, respektiv.
Wann héich Probezuelen (zB 96-Well Placke, Mikrotiterplacke etc.) musse veraarbecht ginn, da muss de UIP400MTP ass déi ideal sonication Setup. D'UIP400MTP funktionéiert wéi e gréissere Cuphorn, dee mat Waasser gefüllt ass an genuch Plaz huet fir Mikrowellplacken ze halen. Powered vun engem 400 Watt mächtegen Ultraschallprozessor, liwwert den UIP400MTP eng ganz eenheetlech an intensiv Sonikatioun vu Multi-Well Placke fir Zellen ze stéieren, Proben ze lyséieren, Pellets ze solubiliséieren, Proteinen ze extrahieren oder DNA ze schneiden.

Präzis Kontroll iwwer Smart Software

All Hielscher Sonikatiounsléisungen vun 200 Watt erop si mat engem digitale Faarf Touchscreen an enger intelligenter Software ausgestatt. Duerch d'Smart Dateprotokolléierung ginn all Ultraschallprozessparameter automatesch als CSV-Datei op enger agebauter SD-Kaart gespäichert soubal den Ultrasonicator gestart gëtt. Dëst mécht Fuerschung a Protokolléierung sou vill méi bequem. Nom Sonication Trials oder Probe Virbereedung, kënnt Dir einfach d'Sonication Parameter vun all sonication lafen iwwerpréiwen a vergläichen.
Iwwert dem intuitive Menü kënne vill Parameter virausgesat ginn virun der Sonikatioun: Zum Beispill, fir d'Temperatur an der Probe ze kontrolléieren an hir thermesch Degradatioun ze vermeiden, kann eng iewescht Limit vun der Probetemperatur agestallt ginn. E pluggable Temperatursensor, dee mat der Ultraschall-Eenheet kënnt, gëtt den Ultraschallprozessor Feedback iwwer déi aktuell Sonikatiounstemperatur. Wann déi iewescht Temperaturlimit erreecht gëtt, stoppt den Ultraschall-Apparat bis déi ënnescht Limit vum Set ∆T erreecht gëtt a fänkt dann automatesch erëm un.
Wann d'Sonicatioun mat engem spezifeschen Energieinput erfuerderlech ass, kënnt Dir d'endgülteg Ultraschallenergie vum Sonikatiounslaf virstellen. Natierlech kënnen d'Ultraschallpulsatioun an den Zyklusmodus och individuell agestallt ginn.
Fir Är erfollegräichste Sonikatiounsparameter nei ze benotzen, kënnt Dir verschidde Sonikatiounsmodi späicheren (zB Sonikatiounszäit, Intensitéit, Zyklusmodus etc.) als Pre-set Modi, sou datt se einfach a séier erëm ufänken.
Fir méi operationell Komfort kënnen all digital Ultraschall Eenheeten iwwer Browser Fernbedienung an all gemeinsame Browser (zB InternetExplorer, Safari, Chrome etc.) bedriwwe ginn. D'LAN Verbindung ass en einfache Plug-n-Play Setup a erfuerdert keng zousätzlech Softwareinstallatioun.
Mir bei Hielscher wëssen datt déi erfollegräich Sonikatioun vu biologesche Proben Präzisioun a Widderhuelbarkeet erfuerdert. Dofir hu mir eis Ultraschaller als Smart Geräter mat all Funktiounen entworf, déi eng effizient, zouverléisseg, reproduzéierbar a praktesch Probepräparatioun erméiglechen.

D'Tabell hei drënner gëtt Iech eng Indikatioun iwwer d'ongeféier Veraarbechtungskapazitéit vun eisen Ultraschallsystemer vun Ultraschall Mikro-Tipps a klassesch Ultraschallhomogenisatoren bis MultiSample Ultraschaller fir déi bequem, zouverlässeg Virbereedung vu ville Proben: