Drosophila melanogaster gëtt vill a Laboratoiren als Modellorganismus benotzt. Dofir musse pre-analytesch Virbereedungsschrëtter wéi Lysis, Zellstéierung, Protein Extraktioun an DNA Scheedung vun Drosophila Melanogaster Proben dacks ausgefouert ginn. Ultraschall Dismembréierer sinn zouverléisseg an effizient a kënne benotzt gi fir verschidden Aufgaben wéi Lysis, Protein Extraktioun oder DNA Fragmentéierung einfach ze maachen andeems nëmmen Ultraschall Prozess Parameteren ugepasst ginn. Ultraschall Homogeniséierer sinn doduerch flexibel Tools mat enger breet Palette vun Uwendungen.

Ultraschall Lysis a Protein Extraktioun

Lysis, Zell Solubiliséierung, Tissu Homogeniséierung a Protein Extraktioun sinn typesch Aufgabe fir Ultraschall-Démembratoren a biologesche Laboratoiren. Ultraschall-Démembratoren an Zellstéierer si gutt geegent fir Déieregewebe, Insekten (z. B. Drosophila melanogaster, C. elegans) oder Planzerexemplare ze homogeniséieren. Folgend Uwendungen vun Ultraschallatioun sinn d'Lysis vun Zell Suspensions a Pellets souwéi d'Extraktioun vun intrazellularer Proteinen.
Ultraschall Lysis a Protein Extraktioun sinn héich zouverléisseg a reproduzéierbar Prozesser, déi op Basis vun etabléierte Protokoller ausgefouert kënne ginn. Zënter Ultraschall-Prozessintensitéit kann exakt ugepasst ginn iwwer Sonikatiounsparameter wéi Amplitude, Zyklus / Puls-Modus, Temperatur a Probe Volumen, eemol bewisen Protokoller kënne mam selwechte Resultat ëmmer erëm widderholl ginn.

Ultraschall DNA a RNA Fragmentéierung

No Zelllysis a Proteinenextraktioun ass e gemeinsame erfuerderleche Schrëtt an der Proufvirbereedung d'Schéier an d'Fragmentéierung vun DNA, RNA a Chromatin, zB virum Chromatinimmunoprecipitatioun (ChIP). DNA a RNA Fragmentéierung kann zouverléisseg erreecht ginn andeems d'covalent Bindungen briechen déi d'DNA duerch kierperlech Kräften zesummenhalen. Mat kierperlecher Schéier wéi Sonikatioun, als éischt ginn d'DNA Strécke gebrach, duerno ass d'DNA a méi kleng Stécker fragmentéiert.
Ultraschall DNA Fragmentéierung ass zouverléisseg an effizient beim Ofschneiden vun DNA op eng geziilte Längt, zB 500bp (Basispuer). Déi grouss Virdeeler vun der Ultraschall-DNA Fragmentéierung enthalen déi präzis Kontroll vun den Ultraschall-Prozessparameteren an der Intensitéit. D'Ultraschallprozessparameter kënnen ugepasst ginn andeems d'Sonikatiounsintensitéit, d'Zyklen an d'Zäit präzis ofgestëmmt ginn. Dëst mécht et méiglech gewënschte DNA Gréissten ze kreéieren an déi gezielte DNA Längt kann zouverléisseg produzéiert wéi och reproduzéiert ginn. Ultraschall DNA Schéier ass och ideal fir DNA Fragmenter mat héijer Molekulargewiicht ze kreéieren.

Protokoller fir Ultraschall Lysis vun Drosophila melanogaster

Hei fannt Dir verschidde Protokoller fir d'Ultraschall assistéiert Lysis, d'Proteinextraktioun, an d'DNA oder Chromatinfragmentéierung vun Drosophila Proben.

Ultraschall Lysis fir Crosslinking Immunoprecipitation (CLIP) Assay

CLIP assay war wéi virdru mat e puer Ännerunge gemellt gesuergt. Ongeféier 20 mg Eierstécker vun 0- bis 1 Deeg alen Wildtyp Weibercher goufen UV verknëppelt (3 × 2000 μJ / cm2), homogeniséiert op Äis an 1 ml RCB Puffer (50 mm HEPES pH 7.4, 200 mm NaCl, 2.5 mm MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mm Saccharose, 1 mm DTT, 1 × EDTA-gratis Komplett Protease Inhibitoren, 1 mm PMSF) ergänzt mat 300 U RNAseOUT an op Äis geluecht fir 30 min. D'Homogenat gouf op Äis sonikéiert, mat 80% Kraaft, fënnef Mol an 20 s Burst mat engem 60 s Rescht zwëschen dem Hielscher Ultrasonic Prozessor UP100H (100 W, 30 kHz) an zentrifugéiert (16000 × g fir 5 min bei 4 ° C). Soluble Extrait war mat 20 μl Protein-G dynabeads fir 20 min bei 4 ° C preclearéiert. No Entféierung vun Echantillon fir immunoblotting an quantitation vun RNS Input (1%), war HP1 immunoprecipitated mat anti-HP1 9A9 antibody aus 450 μl precleared Extrait vun incubation fir 4 h mat 50 μl Protein-G dynabeads. Immunoprecipitate goufen 4 Mol mat RCB gewäsch. Fir d'immunoprecipitéiert RNAs z'elutéieren, goufen d'pellete Kuerer fir 100 min an 100 μL UltraPure DEPC-behandelt Waasser gekacht. 900 μL Qiazol Reagent gouf derbäi fir de RNS Virbereedung erëmgeworf. D'RNA gereinegt gouf als Schabloun benotzt fir cDNA mat Oligo DT, syntheteschen Hexameren an SuperScript Reverse Transkriptase III ze synthetiséieren mat dem Protokoll vum Hiersteller.
(Cassale et al. 2019)

Ultraschall Lysis fir Chromatin Immunoprecipitation Assay

Chromatin Immunoprecipitatioun gouf no der Method beschriwwen, déi vum Menet mat klengen Ännerungen beschriwwe gouf. Ongeféier 20 mg Eierstécker vun 0- bis 1-Dag-alen Wildtyp Weibercher goufen an 1 ml NEB-Puffer (10 mM HEPES-Na bei pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na bei pH 8, 0,5 mM homogeniséiert. EDTA-Na bei pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM Spermidin, 0,15 mM Spermine, 1 × EDTA- gratis Komplett Protease Inhibitoren) mat engem Homogeniséierer / Tauchdisperger 1 min (bei 3000 Z / min). D'Homogenat gouf op e virgekillt Glasdunce transferéiert a 15 Vollstréimunge goufe mat enger enker Pestle applizéiert. Fräi Käre goufen duerno bei 6000xg fir 10 min bei 4 ° C centrifugéiert. D'Käre-haltege Pellets goufen an 1 ml NEB resuspendéiert an 2000 × g fir 20 min op Saccharoseverlaf (0,65 ml vun 1,6 M Saccharose an NEB, 0,35 ml vun 0,8 M Saccharose an NEB) centrifugéiert. D'Pellet gouf an 1 ml NEB a Formaldehyd zu enger definitiver Konzentratioun vun 1% resuspendéiert. Käre ware fir 10 min bei Raumtemperatur vernetzt a geläscht andeems een 1/10 Vol vun 1.375 M Glycin bäigefüügt huet. D'Käre goufen duerch Zentrifugatioun bei 6000 × g fir 5 min gesammelt. Käre goufen zweemol an 1 ml NEB gewäsch an an 1 ml Lysis Buffer (15 mm HEPES-Na bei pH 7,6, 140 mm NaCl, 0,5 mm EGTA, 1 MM EDTA bei pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 resuspendéiert mM DTT, 0,1% Na Deoxycholat, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroylsarcosine an 1 × EDTA-gratis Komplett Protease Inhibitoren). Käre goufen mat engem Hielscher Ultraschall Prozessor sonikéiert UP100H (100 W, 30 kHz) sechs Mol fir 20 s op an 1 min op Äis. Sonikéiert Käre goufen op 13000 × g fir 4 min bei 4 ° C centrifugéiert. D'Majoritéit vum sonikéierte Chromatin war 500 bis 1000 Basispuer (BP) an der Längt. Fir all immunoprecipitation, 15 μg vun chromatin war an der Präsenz vun 10 μg vun HP1 9A9 monoclonal antibody (3 h bei 4 ° C an engem rotativ Rad) incubated. Dunn, 50 μl vun dynabeads FAQ G derbäi an d'Inkubatioun war iwwer Nuecht bei 4 ° C weidergefouert. D'supernatants sech verworf an Echantillon waren zweemol an Lysis Buffer (all wäschen 15 min bei 4 ° C) an zweemol an TE Buffer (1 mm héich, 10 mm TrisHCl um pH 8) gewäsch. Chromatin gouf aus Perlen an zwee Schrëtt elutéiert; éischt an 100 μl Eluition Buffer 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl bei pH 8) bei 65 ° C fir 15 min, gefollegt vun Zentrifugatioun an Erhuelung vum Supernatant. Beads Material gouf an 100 μl TE + 0,67% SDS nei extrahéiert. D'kombinéiert Eluat (200 μl) war Iwwernuechtung bei 65 ° C incubéiert fir Cross-Links ëmzegoen a behandelt vu 50 μg / ml RNaseA fir 15 min bei 65 ° C a vu 500 μg / ml Proteinase K fir 3 h bei 65 ° C. Beispiller goufe Phenol – Chloroform extrahéiert an Ethanol gefällt. DNA gouf a 25 μl Waasser resuspendéiert. Fir maximal molekulare Analysen mat DNA immunoprecipitéiert ze maximéieren, goufen Kandidatgenen a Puer duerch en optiméiert Duplex-Hinnen alleguer Protokoll verstäerkt andeems se zwou verschidde Sätz vu Primer hunn, déi ähnlech Schmelztemperaturen an enger eenzeger Reaktioun hunn.
(Casale et al. 2019)
 

High-Performance Ultraschall Zell Disruptoren fir Biologesch Proben

Hielscher Ultrasonics ass Äre laang erfuerene Partner wann et ëm performant Ultraschaller fir Zellstéierung, Lysis, Protein Extraktioun, DNA, RNA a Chromatinfragmentéierung wéi och aner pre-analytesch Proufvirbereedungsschrëtt kënnt. Bitt e komplette Portfolio vun Ultraschall Labo Homogeniséierer a Proufvirbereedungseenheeten, Hielscher huet den ideale Ultraschall-Apparat fir Är biologesch Uwendung an Ufuerderungen.
Klassesch Ultraschall-Sonde-Typ mat Mikrotipp wéi de UP200St (200W; kuck d'Foto lénks) oder eng vun den Ultraschall-Préparatiouns Eenheeten VialTweeter oder UP200ST_TD_CupHorn mat VialHolder sinn Liiblingsmodeller a Fuerschung an analytesche Laboratoiren. Déi klassesch Ultraschallsonde ass ideal, wa manner Prouwen ze preparéiere musse lyséiert, extrahéiert oder fragmentéiert ginn. D'Proufvirbereedungseenheeten VialTweeter an UP200St_TD_CupHorn erlaben eng simultan Opléisung vu bis zu 10 respektiv 5 Fläschen.
Wann héich Proufzuelen (z. B. 96-Wuel Placke, Mikrotiterplacken asw.) Musse veraarbecht ginn, ass UIP400MTP ass den ideale Sonikatiouns-Setup. Den UIP400MTP funktionnéiert wéi e méi grousse Cuphorn, dee mat Waasser gefëllt ass a genuch Plaz huet fir Mikro-Well Placken ze halen. Powered vun engem 400 Watts mächtege Ultraschallprozessor, liwwert den UIP400MTP eng ganz eenheetlech an intensiv Opléisung vu Multi-Well Placken fir Zellen ze stéieren, Lyse Proben, Pellets solubiliséieren, Proteine extrahéieren oder DNA scheren.

Präzise Kontroll iwwer Smart Software

All Hielscher Opléisungsléisunge vun 200 Watt uewen si mat engem digitalen Faarftouchscreen an enger intelligenter Software ausgestatt. Iwwer den intelligenten Daten Protokolléiere ginn all Ultraschallprozessparameter automatesch als CSV Datei op enger agebauter SD-Kaart gespäichert soubal den Ultraschall gestart gëtt. Dëst mécht Fuerschung a Protokolléiere sou vill méi bequem. No de Sonikatiounsversich oder der Proufvirbereedung kënnt Dir d'Sonikatiounsparameter vun all Opléisungslafen einfach iwwerpréiwen a vergläichen.
Via dem intuitive Menü ka vill Parameter viru sonication virgesi sinn: Zum Beispill, fir d'Temperatur an der Probe ze kontrolléieren an hir thermesch Degradatioun ze vermeiden, kann eng iewescht Limite vun der Probe-Temperatur gesat ginn. E pluggbare Temperatursensor, dee mat der Ultraschall-Eenheet kënnt, gëtt dem Ultraschall-Prozessor Feedback op déi aktuell Sonikatiounstemperatur. Wann déi iewescht Temperaturlimit erreecht ass, pauséiert den Ultraschallapparat bis déi ënnescht Limit vum Set ∆T erreecht gëtt a fänkt dann automatesch erëm un.
Wann d'Sonikatioun mat engem spezifeschen Energieinput erfuerderlech ass, kënnt Dir déi lescht Ultraschallenergie vum Sonikatiounslaf virsetzen. Natierlech kann d'Ultraschallpulsatioun an den Zyklusmodus och individuell gesat ginn.
Fir Är erfollegräichste Sonikatiounsparameteren nei ze benotzen, kënnt Dir verschidde Sonikatiounsmodi späicheren (z. B. Sonikatiounszäit, Intensitéit, Zyklusmodus etc.) als virausgesate Modi, sou datt se einfach sinn a séier erëm starten.
Fir méi operationell Komfort kënnen all digital Ultraschall Eenheeten iwwer Browser Fernsteuerung an all gemeinsame Browser bedriwwe ginn (zB InternetExplorer, Safari, Chrome etc.). D'LAN Verbindung ass en einfachen Plug-n-Play Setup a brauch keng zousätzlech Softwareinstallatioun.
Mir vun Hielscher wëssen datt déi erfollegräich Opléisung vu biologesche Proben Präzisioun a Widderhuelung erfuerdert. Dofir hu mir eis Ultraschaller als intelligente Geräter mat alle Funktiounen entwéckelt, déi eng effizient, zouverléisseg, reproduzéierbar a praktesch Proufvirbereedung aktivéieren.

Den Dësch hei ënnendrënner Iech eng Indikatioun iwwer déi ongeféier Veraarbechtungskapazitéit vun eise Ultraschallsystemer vun Ultraschall-Mikrotipps a klassesch Ultraschall-Homogeniséierer op MultiSample Ultraschaller fir déi bequem, zouverléisseg Virbereedung vu ville Proben: