Ultraschalllys vu Prouwe vun Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster gëtt a Laboratoirë vill als Modellorganismus agesat. Dofir musse virun der Analys dacks Virbereedungsschrëtt wéi Lys, Zellopbroch, Proteinextraktioun an DNA-Scherung vu Prouwe vun Drosophila melanogaster duerchgefouert ginn. Ultraschallzerleeër sinn zouverlässeg an effizient a kënne ganz einfach fir verschidden Aufgabe wéi Lys, Proteinextraktioun oder DNA-Fragmentéierung agesat ginn, andeems nëmmen d’Ultraschallprozessparameter ugepasst ginn. Ultraschallhomogenisateure sinn domat flexibel Instrumenter mat engem breeden Uwendungsspektrum.

Ultraschalllys a Proteinextraktioun

Lys, Zellsolubiliséierung, Tissu-Homogeniséierung a Proteinextraktioun sinn typesch Aufgabe fir Ultraschallzerleeër a biologesche Laboratoiren. Ultraschallzerleeër an Zellopbrochapparater si gutt gëeegent, fir Déierentissuen, Insekten (z. B. Drosophila melanogaster, C. elegans) oder Planzeprouwen ze homogeniséieren. Uschléissend Uwendunge vun der Ultraschallbehandlung sinn d’Lys vun Zellsuspensiounen a Pellets souwéi d’Extraktioun vun intrazelluläre Proteinnen.
Ultraschalllys a Proteinextraktioun sinn héich zouverlässeg a reproduzéierbar Prozesser, déi op Basis vun etabléierte Protokoller duerchgefouert kënne ginn. Well d’Intensitéit vum Ultraschallprozess iwwer Beschallungsparameter wéi Amplitüd, Zyklus- / Pulsmodus, Temperatur a Proufvolumen genee agestallt ka ginn, kënne Protokoller, déi sech bewäert hunn, ëmmer erëm mam selwechte Resultat widderholl ginn.

DNA- an RNA-Fragmentéierung mat Ultraschall

No der Zelllys an der Proteinextraktioun ass d’Scherung an d’Fragmentéierung vun DNA, RNA a Chromatin en dacks néidege Schrëtt bei der Proufvirbereedung, z. B. virun der Chromatin-Immunoprezipitatioun (ChIP). D’Fragmentéierung vun DNA an RNA kann zouverlässeg erreecht ginn, andeems déi kovalent Bindungen, déi d’DNA zesummenhalen, duerch physikalesch Kräfte gebrach ginn. Bei der physikalescher Scherung, wéi der Ultraschallbehandlung, ginn als éischt d’DNA-Sträng gebrach, duerno gëtt d’DNA a méi kleng Stécker fragmentéiert.
D’DNA-Fragmentéierung mat Ultraschall ass zouverlässeg an effizient, fir DNA op eng gezilt Längt ze scheren, z. B. 500bp (Basepueren). Zu de wichtegste Virdeeler vun der DNA-Fragmentéierung mat Ultraschall gehéiert déi präzis Kontroll vun den Ultraschallprozessparameter an der Intensitéit. D’Ultraschallprozessparameter kënnen duerch déi präzis Astellung vun der Beschallungsintensitéit, den Zyklen an der Zäit ugepasst ginn. Doduerch kënnen déi gewënschten DNA-Gréissten erstallt ginn, an déi gezilt DNA-Längt kann zouverlässeg produzéiert a reproduzéiert ginn. D’DNA-Scherung mat Ultraschall ass och ideal, fir DNA-Fragmenter mat héijem Molekulargewiicht ze produzéieren.

Protokoller fir d’Ultraschalllys vun Drosophila melanogaster

Hei drënner fannt Dir verschidde Protokoller fir d’ultraschallënnerstëtzt Lys, Proteinextraktioun an DNA- oder Chromatin-Fragmentéierung vun Drosophila-Prouwen.

Ultraschalllys fir de Vernetzungs-Immunoprezipitatiounsassay (CLIP)

De CLIP-Assay gouf wéi virdru beschriwwe mat e puer Ännerungen duerchgefouert. Ongeféier 20 mg Eierstécker vun 0 bis 1 Dag ale Weibche vum Wëldtyp goufe mat UV vernetzt (3 × 2000 μJ/cm2), op Äis an 1 mL RCB-Puffer (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM Saccharose, 1 mM DTT, 1× EDTA-fräi Complete Protease Inhibitors, 1 mM PMSF), dee mat 300 U RNAseOUT ergänzt gouf, homogeniséiert a fir 30 min op Äis gestallt. D’Homogenat gouf op Äis bei 80% Leeschtung fënnefmol an Impulser vun 20 s mat jeeweils 60 s Paus dertëscht beschallt, mam Hielscher Ultraschallprozessor UP100H (100 W, 30 kHz) an zentrifugéiert (16.000 × g fir 5 min bei 4°C). De léislechen Extrakt gouf mat 20 μl Protein-G dynabeads fir 20 min bei 4°C virgekläert. Nodeems Prouwe fir d’Immunoblotting an d’Quantifizéierung vun der agesater RNA (1%) entzu gi waren, gouf HP1 mat engem Anti-HP1-9A9-Antikierper aus 450 μl virgekläertem Extrakt duerch eng Inkubatioun vu 4 h mat 50 μl Protein-G dynabeads immunoprezipitéiert. D’Immunoprezipitate goufe 4-mol mat RCB gewäsch. Fir déi immunoprezipitéiert RNAen ze eluéieren, goufen déi als Pellet ofgesate Kugele fir 5 min an 100 μL UltraPure DEPC-behandeltem Waasser gekacht. Zum Iwwerstand, dee fir d’RNA-Preparatioun zeréckgewonne gouf, goufen 900 μL Qiazol Reagent bäigefüügt. Déi gereinegt RNA gouf als Matriz benotzt, fir mat Oligo-dT, zoufällegen Hexameren a SuperScript Reverse Transkriptase III no dem Protokoll vum Hiersteller cDNA ze synthetiséieren.
(Cassale et al. 2019)

Ultraschalllys fir e Chromatin-Immunoprezipitatiounsassay

D’Chromatin-Immunoprezipitatioun gouf no der vum Menet beschriwwener Method mat klengen Ännerungen duerchgefouert. Ongeféier 20 mg Eierstécker vun 0 bis 1 Dag ale Weibche vum Wëldtyp goufen an 1 mL NEB-Puffer (10 mM HEPES-Na bei pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na bei pH 8, 0,5 mM EDTA-Na bei pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM Spermidin, 0,15 mM Spermin, 1× EDTA-fräi Complete Protease Inhibitors) mat engem Homogenisator / Tauchdispergator fir 1 min (bei 3000 rpm) homogeniséiert. D’Homogenat gouf an e virgekillten Dounce-Homogenisator aus Glas iwwerdroen a mat engem enk passende Stempel mat 15 komplette Stéiss behandelt. Fräi Zellkäre goufen duerno bei 6000xg fir 10 min bei 4°C zentrifugéiert. D’Pellets, déi d’Zellkäre enthale hunn, goufen an 1 mL NEB resuspendéiert a bei 20.000 × g fir 20 min op engem Saccharosegradient (0,65 mL 1,6 M Saccharose an NEB, 0,35 mL 0,8 M Saccharose an NEB) zentrifugéiert. De Pellet gouf an 1 mL NEB resuspendéiert, a Formaldehyd gouf bis zu enger Endkonzentratioun vun 1% bäigefüügt. D’Zellkäre goufe fir 10 min bei Raumtemperatur quervernetzt, an d’Reaktioun gouf duerch d’Bäifüüge vun 1/10 vol 1,375 M Glycin gestoppt. D’Zellkäre goufen duerch Zentrifugatioun bei 6000 × g fir 5 min gesammelt. D’Zellkäre goufen zweemol an 1 mL NEB gewäsch an an 1 mL Lyspuffer (15 mM HEPES-Na bei pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA bei pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na-Deoxycholat, 0,1% SDS, 0,5% N-Lauroylsarcosin an 1× EDTA-fräi Complete Protease Inhibitors) resuspendéiert. D’Zellkäre goufe mat engem Hielscher Ultraschallprozessor UP100H (100 W, 30 kHz) sechsmol fir jee 20 s beschallt a jee 1 min op Äis gelooss. Déi beschallte Zellkäre goufe bei 13.000 × g fir 4 min bei 4°C zentrifugéiert. De gréissten Deel vum beschallte Chromatin hat eng Längt vu 500 bis 1000 Basepueren (bp). Fir all Immunoprezipitatioun goufe 15 μg Chromatin a Presenz vun 10 μg monoklonalem HP1-9A9-Antikierper inkubéiert (3 h bei 4°C an engem rotéierende Rad). Duerno goufe 50 μl dynabeads protein G bäigefüügt, an d’Inkubatioun gouf iwwer Nuecht bei 4°C weidergefouert. D’Iwwerstänn goufe verworf, an d’Prouwe goufen zweemol am Lyspuffer (all Wäschschrëtt 15 min bei 4 °C) an zweemol am TE-Puffer (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl bei pH 8) gewäsch. D’Chromatin gouf an zwee Schrëtt vun de Kugelen eluéiert; fir d’éischt an 100 μl Elutiounspuffer 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl bei pH 8) bei 65°C fir 15 min, duerno gouf zentrifugéiert an den Iwwerstand zeréckgewonnen. D’Kugelmaterial gouf nach eng Kéier an 100 μl TE + 0,67% SDS extrahéiert. Dat zesummegeféiert Eluat (200 μl) gouf iwwer Nuecht bei 65°C inkubéiert, fir d’Quervernetzungen opzeléisen, a mat 50 μg/ml RNaseA fir 15 min bei 65°C a mat 500 μg/ml Proteinase K fir 3 h bei 65°C behandelt. D’Prouwe goufe mat Phenol–Chloroform extrahéiert a mat Ethanol ausgefällt. D’DNA gouf an 25 μl Waasser resuspendéiert. Fir déi molekular Analyse mat der immunoprezipitéierter DNA ze maximéieren, goufe Kandidategenen zu zwee mat engem optiméierten Duplex-PCR-Protokoll amplifizéiert, andeems zwee verschidde Sätz vu Primere mat änleche Schmëlztemperaturen an enger eenzeger Reaktioun benotzt goufen.
(Casale et al. 2019)
 

Héichleeschtungs-Ultraschallzellopbriecher fir biologesch Prouwen

Hielscher Ultrasonics ass Äre Partner mat laangjäreger Erfarung, wann et ëm Ultraschallapparater mat héijer Leeschtung fir den Zellopschloss, d’Lys, d’Proteinextraktioun, d’Fragmentéierung vun DNA, RNA a Chromatin souwéi aner Schrëtt vun der preanalytescher Proufvirbereedung geet. Mat engem ëmfaassende Portfolio vun Ultraschallhomogenisateure fir de Laboratoire an Apparater fir d’Proufvirbereedung huet Hielscher den idealen Ultraschallapparat fir Är biologesch Uwendung an Är Ufuerderungen.
Klassesch Ultraschallapparater mat Sond a Mikrospëtzt wéi den UP200St (200W; kuckt d’Bild lénks) oder ee vun den Ultraschallapparater fir d’Proufvirbereedung VialTweeter oder UP200ST_TD_CupHorn mat VialHolder si beléift Modeller a Fuerschungs- an Analyselaboratoiren. Déi klassesch Ultraschallsond ass ideal, wa manner Prouwe lyséiert, extrahéiert oder fragmentéiert musse ginn. D’Apparater fir d’Proufvirbereedung VialTweeter an UP200St_TD_CupHorn erlaben déi gläichzäiteg Ultraschallbehandlung vu bis zu 10 respektiv 5 Prouweréiercher.
Wa grouss Zuele vu Prouwen (z. B. Placke mat 96 Vertiefungen, Mikrotiterplacken asw.) verschafft musse ginn, ass den UIP400MTP déi ideal Ariichtung fir d’Ultraschallbehandlung. Den UIP400MTP funktionéiert wéi e méi grousse CupHorn, dee mat Waasser gefëllt ass a genuch Plaz fir Placke mat Mikrovertiefungen huet. Ugedriwwe vun engem Ultraschallprozessor mat enger Leeschtung vu 400 Watt, liwwert den UIP400MTP eng ganz gläichméisseg an intensiv Ultraschallbehandlung vu Placke mat méi Vertiefungen, fir Zellen opzeschléissen, Prouwen ze lyséieren, Pellets ze solubiliséieren, Proteinen ze extrahéieren oder DNA duerch Schéierkräften ze fragmentéieren.

Prezise Kontroll duerch intelligent Software

All Hielscher-Léisunge fir d’Ultraschallbehandlung vun 200 Watt u si mat engem digitale Faarftouchscreen an enger intelligenter Software equipéiert. Duerch déi intelligent Dateprotokolléierung ginn all Ultraschallprozessparameter automatesch als CSV-Datei op enger agebauter SD-Kaart gespäichert, soubal den Ultraschallapparat gestart gëtt. Dat mécht d’Fuerschung an d’Protokolléierung vill méi bequem. No den Ultraschallversich oder der Proufvirbereedung kënnt Dir d’Parameter vun all eenzelem Ultraschallbehandlungsduerchlaf einfach nokucken a matenee vergläichen.
Iwwer den intuitive Menü kënne virun der Ultraschallbehandlung vill Parametere viraus agestallt ginn: Fir zum Beispill d’Temperatur an der Prouf ze kontrolléieren an hir thermesch Degradatioun ze verhënneren, kann eng iewescht Grenz fir d’Prouftemperatur festgeluecht ginn. En uschléissbaren Temperatursensor, dee mam Ultraschallapparat geliwwert gëtt, gëtt dem Ultraschallprozessor Réckmeldung iwwer déi aktuell Temperatur bei der Ultraschallbehandlung. Wann déi iewescht Temperaturgrenz erreecht ass, pauséiert den Ultraschallapparat, bis déi ënnescht Grenz vum agestallten ∆T erreecht ass, a fänkt dann automatesch nees mat der Ultraschallbehandlung un.
Wann eng Ultraschallbehandlung mat engem spezifeschen Energieandrag erfuerderlech ass, kënnt Dir déi um Enn vum Behandlungsduerchlaf anzebréngend Ultraschallenergie viraus astellen. Natierlech kënnen och d’Ultraschallpulsatioun an den Zyklusmodus individuell agestallt ginn.
Fir Är erfollegräichst Ultraschallbehandlungsparameter nach eng Kéier ze benotzen, kënnt Dir verschidde Behandlungsmodi (z. B. Behandlungsdauer, Intensitéit, Zyklusmodus asw.) als viraus agestallte Modi späicheren, sou datt se einfach a séier nees gestart kënne ginn.
Fir méi Bedienkomfort kënnen all digital Ultraschallapparater iwwer eng Browser-Fernsteierung an all gängegem Browser (z. B. InternetExplorer, Safari, Chrome asw.) bedéngt ginn. D’LAN-Verbindung ass eng einfach Plug-and-play-Ariichtung a verlaangt keng zousätzlech Softwareinstallatioun.
Mir bei Hielscher wëssen, datt eng erfollegräich Ultraschallbehandlung vu biologesche Prouwe Prezisioun a Widderhuelbarkeet erfuerdert. Dofir hu mir eis Ultraschallapparater als intelligent Apparater mat alle Funktiounen entworf, déi eng effizient, zouverlässeg, reproduzéierbar a bequem Proufvirbereedung erméiglechen.

D’Tabell hei ënne gëtt Iech en Unhaltspunkt fir déi ongeféier Veraarbechtungskapazitéit vun eisen Ultraschallsystemer, vun Ultraschallmikrospëtzten a klasseschen Ultraschallhomogenisateure bis bei MultiSample-Ultraschallapparater fir déi bequem, zouverlässeg Virbereedung vu ville Prouwen: