Virbereedung vu C. elegans-Prouwe mat Ultraschall

C. elegans, e Fuedemwuerm, ass e Modellorganismus, deen an der Biologie vill benotzt gëtt. D’Virbereedung vun de Prouwe virun der Analys erfuerdert eng Lys, eng Protein- a Lipidextraktioun souwéi eng RNA-Fragmentéierung, déi zouverlässeg mat Ultraschall duerchgefouert kënne ginn. Ultraschall-Zellopbrochgeräter sinn zouverlässeg, ausgeräift an einfach ze bedéngen Apparater fir déi séier Virbereedung vu C. elegans-Prouwen.

Virbereedung vu C. elegans-Prouwe mat Ultraschall

Caenorhabditis elegans si Fuedemwierm, déi a Fuerschungslaboratoirë vill benotzt ginn, fir Genomik, Entwécklungsbiologie a Krankheeten z’ënnersichen. Vill Genen am Genom vu C. elegans hu funktionell Entspriechunge beim Mënsch. Doduerch ass de Fuedemwuerm en extrem nëtzleche Modell fir mënschlech Krankheeten. Aner Virdeeler, déi zum verbreete Gebrauch vu C. elegans bäidroen, si seng einfach a bëlleg Kultivéierung op Placke mat Bakterien (z. B. E. coli), seng Transparenz, seng einfach Handhabung souwéi d’Méiglechkeet, d’Wierm anzefréieren a fir eng méi laang Zäit ze lageren.
Protein- a Lipidanalysen si reegelméisseg Prozeduren a Laboratoiren, an d’Prouwevirbereedung mat Ultraschall ass déi etabléiert Method, fir C. elegans-Nematoden an all Entwécklungsstadium (d. h. Embryonen, Larven L1–L4, erwuessen Déieren) ze lyséieren. Well C. elegans och als Proteinexpressiounssystem benotzt gëtt, fir Zilproteinen ze iwwerexpriméieren, ass eng zouverlässeg, reproduzéierbar Method fir d’Lys an d’Proteinextraktioun néideg, déi héich Proteinausbeute liwwert. Ultraschallsystemer fir den Zellopbroch an d’Extraktioun sinn als Sondehomogenisatoren an als Ultraschallgeräter fir méi Prouwe verfügbar. Fir eng einfach Prouwevirbereedung a fir all Prouwegréissten a Prouwenzuelen huet Hielscher Ultrasonics dat ideaalt Ultraschall-Zellopbrochgerät fir Är Laboprozedur.

Ultraschall-Lys vu C. elegans fir

d’Virbereedung vu Wiermhomogenater
d’Proteinextraktioun
d’Lipidextraktioun
d’Proteink Quantifizéierung
d’Immunpräzipitatioun
de Western Blot
d’RNA-Extraktioun
enzymatesch Assayen

VialTweeter um Ultraschallprozessor UP200ST

VialTweeter Ultraschallapparat fir méi Prouwe fir déi gläichzäiteg Virbereedung vun 10 Reagenzréiercher.

Ultraschallprotokoller fir den Opbroch an d’Lys vu C. elegans

D’Homogeniséierung an d’Lys vu C. elegans mat Ultraschall an déi uschléissend Protein- a Lipidextraktioun kënne mat ënnerschiddleche Prozeduren duerchgefouert ginn, bei deenen ënnerschiddlech Homogeniséierungs- a Lyspuffer asw. benotzt ginn. All Lysprotokoller hunn dat gemeinsam, datt d’Prouwe kontinuéierlech op Äis gehale musse ginn, fir de Proteinofbau ze verhënneren. Hei drënner stelle mir Iech e puer zouverlässeg a séier Ultraschall-Lys- an Extraktiounsprotokoller fir d’Virbereedung vu qualitativ héichwäertege C. elegans-Prouwe mat Proteinen oder Lipide vir.

Virdeeler vun der Ultraschall-Lys vu C. elegans

zouverlässeg
reproduzéierbar
mat prezis kontrolléierter Temperatur
zouverlässeg Prozesskontroll
schounend Method
einfach unzewenden
sécher

Proteinextraktioun aus C. elegans-Prouwe mat Ultraschall

D’Lys an d’Proteinextraktioun vu C. elegans-Wierm mat Ultraschall kënne mat verschiddene Protokoller duerchgefouert ginn. Hei drënner stelle mir Iech e puer zouverlässeg a séier Lysprotokoller fir reproduzéierbar Resultater bei der Proteinextraktioun vir.

Séier Virbereedung vun engem zytosoleschen Extrait aus C. elegans-Wierm mat Ultraschall

Mat dësem Protokoll kënnt Dir C. elegans-Lysater a manner wéi 30 Minutte preparéieren.
Sammele vu C. elegans
Iwwerdrot déi gewënscht C. elegans-Wierm an en 1,5ml-Réierche mat phosphatgepufferter Salzléisung (PBS) oder spullt se mat 1,5ml PBS vun enger Plack erof. Zentrifugéiert fir 1min bei 2000rpm, fir e Pellet ze bilden. Halt d’Prouwen déi ganzen Zäit op Äis.
Wäscht d’Wierm duerno zweemol mat PBS.
Wäscht d’Wierm uschléissend zweemol mat ddH₂O.
Resuspendéiert d’Wierm an op d’mannst 500ul Homogeniséierungspuffer (HB). D’Wiermprouwe sinn elo prett fir d’Ultraschall-Lys.
Fir eng méi héich Qualitéit vum Proteinextrait kënnt Dir d’bakteriell Kontaminatioun reduzéieren, andeems Dir d’Wierm jeeweils fir 5min a PBS an a sterilem, ultrarengem Waasser (ddH₂O) wäscht oder eng Saccharose-Flotatioun duerchféiert. Halt d’Wiermprouwe kontinuéierlech op Äis.

Protokoll fir d’Ultraschall-Lys vu C. elegans

Vergewëssert Iech, datt Dir d’Ultraschallgerät am Viraus preparéiert, sou datt den Ultraschallhomogenisator asazbereet ass (Sond montéiert, Ultraschallprogramm am Viraus agestallt).

Wann Ären Ultraschallapparat op engem Stativ montéiert ass, stellt d’Äisbad mat Äre Prouweréiercher ënner d’Ultraschallsond a féiert d’Ultraschallsond an d’1,5ml-Réierchen an.

Fir d’Lyse vu C. elegans mam UP200St oder UP200Ht soll d’Ultraschallbehandlung mat enger Mikrospëtzt (z. B. enger 2mm-Sond S26d2; kuckt d’Bild lénks) bei 40% Amplitud fir 1sec mat Pausë vun 30sec dertëscht duerchgefouert ginn. 5 Ultraschallzyklen vun all Kéier 1 Sekonn mat Pausë vun 30sec sinn ideal fir d’Lyse vu C. elegans. Wann Dir d’Lyse fir d’éischt Kéier duerchféiert, kënnt Dir de Fortschrëtt vun der Lyse no all Impuls a klengen Aliquote vun der Prouf mat engem Mikroskop iwwerpréiwen.
D’Lyse ass erfollegräich ofgeschloss, wann d’Wierm opgeschloss sinn. Eng ze staark Ultraschallbehandlung féiert zum Zerbrieche vun den Zellkären a gëtt siichtbar, wann d’Prouf viskos gëtt oder schaimt. Fir den Ofbau vun der Prouf ze verhënneren, benotzt bei Bedarf méi Impulser. Verlängert d’Dauer vun den eenzelen Ultraschallimpulszyklen net, fir héichwäerteg Proteinextrakter ze kréien.
Klärt den Zelllysat, andeems Dir déi duerch Ultraschall lyséiert Wierm bei 14.000rpm fir 10min bei 4ºC zentrifugéiert.
Transfert duerno den Iwwerstand an e frëscht Réierchen a bereet en op d’Immunpräzipitatioun oder aner Assaye vir.

Hiweis zum Homogeniséierungspuffer: Bereet den Homogeniséierungspuffer fir den uewe genannten Ultraschalllyseprotokoll wéi follegt vir:

15 mM Hepes pH 7,6 – 15 ml vun 0,5 M

10 mM KCl – 2,5 ml vun 2 M

1,5 mM MgCl2 – 0,75 ml vun 1 M

0,1 mM EDTA – 100 ul vun 0,5 M

0,5 mM EGTA – 2,5 ml vun 0,1 M

44 mM Saccharose – 14,7 ml vu 50 %

Direkt virum Gebrauch derbäiginn: 1mM DTT – 1000x vun 1M

plus e Proteaseinhibitor

Dës Uleedung erkläert, wéi eng Zort Ultraschallapparat sech am beschte fir Är Aufgabe bei der Prouwevirbereedung eegent, wéi Lys, Zellopschloss, Proteinisolatioun an d'Fragmentéierung vun DNA a RNA am Laboratoire, an der Analytik an an der Fuerschung. Wielt déi ideal Zort Ultraschallapparat fir Är Uwendung, Äre Prouwevolume, Är Prouwenzuel an Ären Duerchsaz. Hielscher Ultrasonics huet den idealen Ultraschallhomogenisator fir Iech!

Lyse vu C. elegans mat héijem Prouwenduerchsaz an 96-Well-Placke mam UIP400MTP-Plackenultraschallapparat

Lyse vu C. elegans (erwuesse Nematoden)
UIP400MTP 80% Amplitud, 20 Zyklen (all Ultraschallzyklus: 30 sec UN, 30 sec AUS)
Lysepuffer:

Optioun 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
Optioun 2) fir d’Koimmunpräzipitatioun (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (komplette Proteinaseinhibitorcocktail)

DNA-Fragmentéierung mat héijem Prouwenduerchsaz
C. elegans (erwuesse Nematoden) DNA 200–300bp: UIP400MTP-Plackenultraschallapparat – 80% Amplitud astellen, 30 Impulser – all Kéier 30sec un, 30sec aus

UIP400MTP Plackesonikator fir d'Proufpreparatioun mat héijem Proufduerchsaz: Den UIP400MTP beschallt Prouwen a Multiwell-, Mikrotiter- a 96-Well-Placke gläichméisseg mat Ultraschall, brécht dobäi Zellen op, extrahéiert Proteinnen a fragmentéiert DNA, RNA an Alpha-Synuclein-Fibrillen.

Den UIP400MTP-Plackenultraschallapparat fir d’Prouwevirbereedung mat héijem Prouwenduerchsaz behandelt Prouwen a Multiwell-, Mikrotiter- an 96-Well-Placke gläichméisseg mat Ultraschall

Ultraschalllyse vu C. elegans fir quantitativ Affinitéitsrengegungassayen

C. elegans-Embryonen (∼2 Millioune pro Replikat) goufe frësch an dräi biologesche Replikater duerch d’Behandlung vu jonken, eedroenden Hermaphroditte mat Bleechmëttel gesammelt an op Äis mat Ultraschall behandelt (Zyklus: 0,5 s, Amplitud: 40–45%, 5 Impulser/Sessioun, 5 Sessiounen, Intervall tëscht de Sessiounen: 30 s; Ultraschallprozessor UP200S mat Mikrospëtzt S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) am Lysepuffer (Gesamtvolumen: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% Glycerol, Proteaseinhibitormëschung, 0,1% Nonidet P-40 Substitute). No der Ultraschallbehandlung gouf Nonidet P-40 Substitute bis op 1% derbäiginn an d’Lysater goufe bei 4°C fir 30 min ënner Iwwerkapp-Rotatioun inkubéiert, duerno bei 20.000 × g fir 20 min bei 4°C zentrifugéiert. De gekläerte Lysat gouf duerno ofgesaugt, ouni déi iewescht Lipidschicht ze stéieren, an an Hallschenten op entweder d’Anti-GFP-Agarosekärecher oder déi blockéiert Kontrollkärecher (40–50 μl) verdeelt. No der Iwwerkapp-Rotatioun bei 4°C fir 60–90 min goufen d’Kärecher eemol mat Lysepuffer gewäsch, deen 0,1% Nonidet P-40 Substitute enthale huet, an duerno zweemol mat entweder Puffer I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) oder Puffer II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) oder mat béide gewäsch. Fir GFP:MBK-2-Pull-downs goufen zwee separat Experimenter mat ënnerschiddleche Wäschbedéngungen duerchgefouert. D’Proteinne goufen duerch orbitaalt Schëddelen a 50 μl vu 6 m Harnstoff/2 M Thioharnstoff bei Raumtemperatur eluéiert. Fir d’MBK-1::GFP-Pull-down-Experimenter goufen d’Proteinnen zweemol duerch Schëddelen a 50μl vun 8 m Guanidiniumchlorid bei 90°C eluéiert, duerno mat Ethanol ausgefällt. Déi eluéiert Proteinprouwe goufen duerno an der Léisung verdaut.
(vgl. Chen et al., 2016)

D'Sonotrod MTP-24-8-96 huet aacht Ultraschallsonde fir d'Beschallung vun de Vertiefunge vu Mikrotiterplacke mat Ultraschall.

D’Sonotrod MTP-24-8-96 huet aacht Ultraschallsonde fir d’Beschallung vun de Kavitéite vu Mikrotiterplacken.

Homogeniséierung a Lyse vu Wierm mat Ultraschall

Fir d’Lyse vu C.elegans an d’Proteinextraktioun goufe pro Prouf 30.000 Nematoden am jeeweilege Stadium gesammelt an an äiskalem S-basal gewäsch, duerch Zentrifugatioun bei 1500 rpm fir 2 min. konzentréiert, sechsmol mat äiskalem S-basal gewäsch, fir reschtlech Bakterien ze entfernen, an duerno bis zum Asaz op Äis gelagert. Fir d’Proteinextraktioun gouf zougelooss, datt erwuesse Wierm mat Eeër no der leschter Wäschung mat S-basal e kompakte Pellet bilden. D’Wiermpellete goufen duerno an 1 ml äiskalem Extraktiounspuffer [20 mM Kaliumphosphat, pH 7,4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, Proteaseinhibitoren (Sigma P2714)] resuspendéiert an direkt verschafft.
∼30.000 erwuesse Wierm mat Eeër (entspriechend ∼100 mg Fiichtgewiicht) goufen op Äis mat engem Ultraschallapparat mat Sond (z. B. UP50H mat Mikrospëtzt MS2) bei 40% Amplitud fir 10 Zykle vun 3 sec ageschalt, 30 sec ausgeschalt, an 1 ml äiskalem Extraktiounspuffer beschallt. (cf. Baskharan et al. 2012)

Lipidextraktioun aus C. elegans mat Ultraschall

An der Lipidomik, engem Deelberäich vun der Metabolomik, gëtt d’Gesamtheet vun de Lipide vu biologesche Systemer charakteriséiert an analyséiert. C. elegans gi vill an der Lipidomik benotzt, fir d’Zesummespill vu Lipiden am Stoffwiessel an hir Auswierkungen op d’Gesondheet an d’Liewensdauer z’ënnersichen.
Lyse an Extraktioun mat Ultraschall gi benotzt, fir Lipide wéi Sphingolipiden aus Embryonen, Larven an erwuessene Wierm vu C. elegans fräizesetzen. Ultraschallbeschallung gëtt benotzt, fir Wiermhomogenater hierzestellen an duerno d’Lipiden aus der Prouf ze extrahéieren.
Protokoll fir d’Lipidextraktioun aus C. elegans mat Ultraschall
Loosst de C. elegans-Pellet op Äis entdeeën a resuspendéiert e mat 0,5 ml ultrarengem Waasser.  Beschallt d’C. elegans-Prouwen an 1,5mL-Proufréiercher an haalt d’Prouwen dobäi permanent op Äis.
D’Beschallung ka mat engem Ultraschallapparat mat Sond wéi dem UP200Ht, der Ultraschallapparatur fir d’Proufvirbereedung VialTweeter (gläichzäiteg Beschallung vun 10 Prouwen) oder dem UIP400MTP (fir d’Beschallung vu Placke mat méi Kavitéiten, wéi 96-Kavitéite-Placken) duerchgefouert ginn. Benotzt fir d’Lyse mat Ultraschall mam UP200Ht d’Mikrospëtzt S26d2. Stellt den Ultraschallzyklusmodus am digitale Menü am Viraus an. Stellt d’Amplitud op 10% an de Beschallungszyklusmodus op 20 Zykle mat Impulser vun 2 sec an enger Paus vun 30 sec. tëscht den eenzelen Ultraschallimpulser an.
Transfert d’Supernatanten a Glasréiercher mat Schraufdeckel.  Maacht eng Folch-Extraktioun, andeems Dir an all Glasréierchen 1 ml ultrarengt Waasser bäigitt an duerno an all Glasréierchen 6 ml vun enger Chloroform/Methanol-Mëschung (Verhältnis = 2:1) bäigitt.
Vortexéiert all Glasréierche véiermol fir jee 30 sec.  Zentrifugéiert d’Réiercher bei 1.258 x g fir 15 min (Eppendorf, 5810 R), fir d’Phasentrennung weider ze verbesseren.  Transfert déi ënnescht hydrophob Fraktioun mat enger Pasteurpipett aus Glas an e proppert Glasréierchen.  Dréchent déi ënnescht hydrophob Fraktioun ënner engem Stéckstoffstroum an engem Stéckstoffverdonster.  Lagert de gedréchente Pellet bis zum Asaz an engem Tifkillschaf bei -80 °C.  

Virbereedung vu Wiermlysater mat Ultraschall

Wuermlysat: Wierm am L4-Stadium goufe gesammelt an dräimol mat M9-Puffer (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl an 0,87 mM MgSO₄), fir all Bakterien ze entfernen. Nodeems sou vill M9-Puffer wéi méiglech ewechgeholl gi war, goufen d’Wierm am Lysepuffer resuspendéiert: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM Phosphat β-Glycerol, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM Natriumfluorid, 1 mM Natriumorthovanadat, 5 mM Natriumpyrophosphat, 0,2 mM Phenylmethansulfonylfluorid an e Proteaseinhibitor. D’Wierm goufen dräimol a flëssegem Stéckstoff agefruer a bei 37°C opgedaut, duerno goufen d’Wierm op Dréchenäis mat enger VialTweeter-Ultraschalleenheet fir d’gläichzäiteg Preparatioun vun 10 Prouweréiercher beschallt. D’Beschallung gouf bei 50% Amplitud an 10 Zykle vun 2 sec. mat 30 sec Paus tëscht de Beschallungsimpulser duerchgefouert. Duerno goufen d’Prouwe bei 12.000 rpm a bei 4°C fir 15 min zentrifugéiert. Den Iwwerstand gouf gesammelt a bei -70°C gelagert. En Aliquot gouf fir d’Proteinqu antifizéierung mam Bradford-Assay benotzt.
Bestëmmung vum Gesamtglutathion, GSH a GSSG: Fir d’Glutathionquantifizéierung goufen d’Lysater an d’Bestëmmung de selwechten Dag gemaach. Mat Glukos gefiddert L4-Larven a Kontroll-L4-Larve goufe gesammelt an dräimol mat M9-Puffer gewäsch. Nodeems sou vill M9-Puffer wéi méiglech ewechgeholl gi war, goufen d’Wierm an äiskaler Metaphosphorsäier (5% w/v) resuspendéiert, duerno goufen d’Wierm am Äis mat engem VialTweeter-Ultraschallapparat bei 50% Amplitud an zéng Beschallungszykle vun 2 sec. mat 30 sec. Paus tëscht all Zyklus beschallt. Duerno bei 12.000 rpm a bei 4 ̊C fir 15 min zentrifugéiert.
(vgl. Alcántar-Fernández et al., 2018)

Preparatioun vu C. elegans-Prouwe virun der Immunoprezipitatioun a virum Western Blotting

Kuerz zesummegefaasst goufe fir embryonal Extrakter C. elegans-L1-Larven a grousse flëssege S-Medium-Kulture bis zum erwuessene Stadium gezillt. D’Embryone goufe mat der Standard-Bleechmethod gesammelt an am Lysepuffer (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% Glycerol, 0,05% NP-40, 1􏰅 Proteaseinhibitor-Cocktail an 1􏰅 Phosphataseinhibitor-Cocktail I an II) suspendéiert, séier a flëssegem Stéckstoff agefruer an duerch Ultraschall-Zellopschloss mat engem Ultraschallapparat mat Mikrospëtzt wéi dem UP200Ht mat S26d2 mat 10 Impulser iwwer 10 s bei 30% Amplitud lyséiert. Wann eng méi grouss Zuel vu Prouwe preparéiert muss ginn, ginn den Ultraschallapparat VialTweeter oder de MultiSample-Ultraschallapparat UIP400MTP fir Well-Placke recommandéiert. No der Beschallung goufen d’Extrakter duerch Zentrifugatioun bei 30.000g fir 20 min bei 4°C virgekläert. De virgekläerten Extrait (300µg Gesamtprotein) gouf mat 40µ􏰂g vun engem duerch Affinitéit gereinegten Anti-CDC-25.1-Antikierper (dës Etüd), dee mat Protein-A-Agarose kräizvernetzt war, inkubéiert, oder als Kontroll gouf eng änlech Quantitéit vun Huesenimmunoglobulin (Ig)G, dat mat Protein-A-Agarose kräizvernetzt war, benotzt, an engem Gesamtvolumme vun 200µl Lysepuffer mat 1% NP-40, deem säin Zousaz d’onspezifesch Bindung vu Proteinnen un d’Matrix reduzéiert huet. D’Prouwe goufe fir 1 h bei 4°C rotéiert, d’Kügelcher goufen dräimol mat Lysepuffer gewäsch a mat 30µl Glycin/HCl an 200 mM NaCl, pH 2,2, eluéiert. No der Immunoprezipitatioun goufen d’Eluater an 30µ􏰂l SDS-Prouwepuffer verdënnt, fir 4 min op 95°C erhëtzt, an typescherweis goufen 3% vum Gesamtmaterial fir den Input an 30% fir d’Eluater op d’SDS-PAGE opgedroen, gefollegt vu Western Blotting mat Anti-CDC-25.1- (1:400), Anti-LIN-23- (1:750), Anti-Ubiquitin- (1:1000), Anti-GSK3􏰁- (1:500) oder Anti-􏰁β-Aktin-Antikierper (1:2000). Wann d’Extrakter kenger Immunoprezipitatioun ënnerzu goufen, gouf déi selwecht Quantitéit u Gesamtprotein aus dësen Extrakter am SDS-Prouwepuffer resuspendéiert, op 95°C erhëtzt an duerno direkt op d’SDS-PAGE opgedroen an duerch Western Blotting analyséiert. (vgl. Segref et al. 2020)

Ultraschallapparat UP200St mat Sond fir d'Lyse

Ultraschall-Zellopschlossapparat UP200St mat Mikrospëtzt S26d2 fir d’Lyse an d’Proteinextraktioun

Ultraschalllyse ënner preziser Temperaturkontroll

Eng präzis an zouverlässeg Temperaturkontroll ass entscheedend beim Ëmgang mat biologesche Prouwen. Héich Temperature léisen en thermesch bedéngten Ofbau vu Proteinnen an de Prouwen aus.
Wéi all mechanesch Methode fir d’Proufvirbereedung erzeugt och d’Ultraschallbehandlung Hëtzt. Beim Asaz vum VialTweeter léisst sech d’Temperatur vun de Prouwen awer gutt kontrolléieren. Mir stellen Iech verschidde Méiglechkeete vir, fir d’Temperatur vun Äre Prouwen ze iwwerwaachen an ze kontrolléieren, wärend Dir se mam VialTweeter a VialPress fir d’Analys virbereet.

Iwwerwaachung vun der Prouftemperatur: Den Ultraschallprozessor UP200St, deen de VialTweeter undreift, ass mat enger intelligenter Software an engem uschléissbaren Temperatursensor ausgestatt. Schléisst den Temperatursensor un den UP200St un a setzt d’Spëtzt vum Temperatursensor an ee vun de Proufréiercher. Iwwer den digitale faarwegen Touchdisplay kënnt Dir am Menü vum UP200St e bestëmmten Temperaturberäich fir d’Ultraschallbehandlung vun Äre Prouwen astellen. Den Ultraschallapparat stoppt automatesch, wann déi maximal Temperatur erreecht ass, a pauséiert, bis d’Prouftemperatur op den ënneschte Wäert vum agestallten Temperaturberäich ∆ gefall ass. Da fänkt d’Ultraschallbehandlung automatesch erëm un. Dës intelligent Funktioun verhënnert en hëtztbedéngten Ofbau.
De VialTweeter-Block ka virgekillt ginn. Setzt de VialTweeter-Block (nëmmen d’Sonotrod ouni Schallwandler!) an de Frigo oder an den Tifküler, fir den Titanblock virzekillen an esou den Temperaturustig an der Prouf ze verzögeren. Wa méiglech, kann och d’Prouf selwer virgekillt ginn.
Benotzt Dréchenäis fir d’Killung wärend der Ultraschallbehandlung. Benotzt eng flaach Schuel mat Dréchenäis a stellt de VialTweeter op d’Dréchenäis, fir datt d’Hëtzt séier ofgeleet ka ginn.

Fannt den optimalen Ultraschall-Zellopschlossapparat fir Är Lyse-Uwendung

Hielscher Ultrasonics ass en Hiersteller mat laangjäreger Erfarung an der Produktioun vun héichleeschtungsfäegen Ultraschall-Zellopschlossapparater an Homogenisateure fir Laboratoiren, Dëschsystemer a Systemer am industrielle Moossstaf. D’Gréisst vun Ärer bakterieller Zellkultur, Äert Fuerschungs- oder Produktiounszil an de Volume vun den Zellen, déi pro Stonn oder Dag verschafft solle ginn, si wesentlech Facteure fir de passenden Ultraschall-Zellopschlossapparat fir Är Uwendung ze fannen.
Hielscher Ultrasonics bitt verschidde Léisunge fir déi gläichzäiteg Ultraschallbehandlung vu méi Prouwen (bis zu 10 Fläschen) souwéi vu grousse Proufzuelen (d. h. Mikrotiterplacken / Placke mat 96 Vertiefungen), vum klassesche Labor-Ultraschallapparat mat Sond mat verschiddene Leeschtungsniveaue vu 50 bis 400 Watt bis hin zu vollindustriellen Ultraschallprozessore mat bis zu 16.000 Watt pro Eenheet fir de kommerziellen Zellopschloss an d’Proteinextraktioun an der Groussproduktioun. All Ultraschallapparater vun Hielscher si fir de Betrib 24/7/365 ënner voller Laascht gebaut. Robustheet an Zouverlässegkeet si Kärmerkmale vun eisen Ultraschallapparater.
All digital Ultraschallhomogenisateure si mat intelligenter Software, engem faarwegen Touchdisplay an automatescher Dateprotokolléierung ausgestatt, déi den Ultraschallapparat zu engem prakteschen Aarbechtsinstrument a Laboratoiren a Produktiounsanlage maachen.
Deelt eis mat, wéi eng Zellen, wéi ee Volume, mat wéi enger Heefegkeet a mat wéi engem Zil Dir Är biologesch Prouwe verschaffe musst. Mir recommandéieren Iech deen Ultraschall-Zellopschlossapparat, deen am beschte fir Är Prozessufuerderunge gëeegent ass.

D’Tabell hei ënnendrënner gëtt Iech en Unhaltspunkt fir déi ongeféier Veraarbechtungskapazitéit vun eisen Ultraschallsystemer, vu kompakten Handhomogenisateuren an Ultraschallapparater fir méi Prouwen bis hin zu industriellen Ultraschallprozessore fir kommerziell Uwendungen:

Chargevolumen	Duerchflossrate	Recommandéiert Apparater
Placke mat 96 Vertiefungen / Mikrotiterplacken	n.a.	UIP400MTP
10 Fläschen à 0,5 bis 1,5mL	n.a.	VialTweeter um UP200St
0,01 bis 250mL	5 bis 100mL/min	UP50H
0,01 bis 500mL	10 bis 200mL/min	UP100H
10 bis 2000mL	20 bis 400mL/min	UP200Ht, UP400St
0,1 bis 20L	0,2 bis 4L/min	UIP2000hdT
10 bis 100L	2 bis 10L/min	UIP4000hdT
n.a.	10 bis 100L/min	UIP16000
n.a.	méi héich	Verbund vun UIP16000

Kontaktéiert eis! / Frot eis!

Ultraschallhomogenisateure mat héije Schéierkräfte gi fir d'Veraarbechtung am Labo, um Labo-Dësch, am Pilotmoossstaf an am industrielle Moossstaf agesat.

Hielscher Ultrasonics produzéiert héichleeschtungsfäeg Ultraschallhomogenisateure fir Mëschuwendungen, Dispersioun, Emulgéierung an Extraktioun am Labor-, Pilot- an industrielle Moossstaf.

Literatur / Referenzen

Chen J.-X; Cipriani P.G.; Mecenas D.; Polanowska J.; Piano F.; Gunsalus K.C.; Selbach M. (2016): In Vivo Interaction Proteomics in Caenorhabditis elegans Embryos Provides New Insights into P Granule Dynamics. Molecular & Cellular Proteomics 15.5; 2016. 1642-1657.
Jonathan Alcántar-Fernández, Rosa E. Navarro, Ana María Salazar-Martínez, Martha Elva Pérez-Andrade, Juan Miranda-Ríos (2018): Caenorhabditis elegans respond to high-glucose diets through a network of stress-responsive transcription factors. PLoS One 13(7); 2018.
Segref, A.; Cabello, J.; Clucas, C.; Schnabel, R.; Johnstone I.L. (2010): Fate Specification and Tissue-specific Cell Cycle Control of the Caenorhabditis elegans Intestine. Molecular Biology of the Cell Vol. 21, 2010. 725–738.
Henderson S.T., Bonafe M., Johnson T.E. (2006): daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 2006; 61:444–60.

Wëssenswäert Fakten

Caenorhabditis elegans

C. elegans ass e fräi liewenden, transparenten Nematod (Fuedemwuerm) mat enger Längt vun ongeféier 1 mm, dee sech vu Bakterien (z. B. E. coli) erniert an e relativ kuerze Liewenszyklus huet. Bei 20 °C huet de Laborstamm vu C. elegans (N2) eng duerchschnëttlech Liewensdauer vun ongeféier 2–3 Wochen an eng Generatiounszäit vun 3 bis 4 Deeg. Wa C. elegans a grousser Zuel geziicht ginn, wat ënner präzis kontrolléierte Laborbedéngungen einfach méiglech ass, kënne si einfach a Screening-Ënnersichunge benotzt ginn, fir de Wierkmechanismus vun neie Medikamenter souwéi hir Effekter an hir Wiesselwierkunge bannent komplexe molekulare Prozesser bei mënschleche Krankheeten ze ënnersichen. De kuerze Genom, de kuerze Liewenszyklus an déi einfach Handhabung am Labo maachen C. elegans zu engem ideale Modellorganismus fir Fuerschungsberäicher wéi Genomik, Proteomik, Entwécklungsbiologie, Krankheetsfuerschung, Medikamentenentwécklung asw.
Caenorhabditis elegans-Wierm kënnen entweder männlech oder hermaphroditesch sinn. Hermaphroditten hu souwuel männlech wéi och weiblech Fortplanzungsorganer. Weiblech Wierm gëtt et awer net. Hermaphroditte kënne sech entweder selwer befruchten oder sech och mat männleche Wierm fortplanzen. C. elegans kann all Dag iwwer 1.000 Eeër produzéieren.
Well C. elegans zu den einfachsten Organisme mat engem Nervesystem gehéiert, gëtt dëse Fuedemwuerm zënter 1963 als Modellorganismus an der Fuerschung benotzt. D’Neurone léise keng Aktiounspotenzialer aus an expriméiere keng spannungsgesteiert Natriumkanäl. Beim Hermaphroditt ëmfaasst dëse System 302 Neuronen, deenen hiert Verbindungsmuster ëmfaassend kartéiert gouf an deem, wat als Konnektom bekannt ass.
Vill vun de Genen am Genom vu C. elegans hu funktionell Entspriechunge beim Mënsch, wat dësen Organismus zu engem extrem nëtzleche Modell fir mënschlech Krankheete mécht. Hie gëtt zum Beispill benotzt, fir Entwécklungsbiologie, Alterung a Facteuren, déi d’Laangliewegkeet beaflossen, ze ënnersichen. Ausserdeem dénge Mutante vu C. elegans als Modeller fir vill mënschlech Krankheeten, dorënner neurologesch Stéierungen (z. B. Alzheimer), ugebueren Häerzkrankheeten an Nierekrankheeten.
Dës Facteuren hunn C. elegans zu engem héich wäertvolle Modell fir vill Fuerschungsberäicher gemaach. Esou war C. elegans deen éischte méizellegen Organismus, deem säi ganze Genom sequenzéiert gouf. De Genom enthält geschaten 20.470 proteinkodéierend Genen. Ongeféier 35% vun de Gene vu C. elegans hu mënschlech Homologen. Bemierkenswäert ass, datt ëmmer nees nogewise gouf, datt mënschlech Genen hir Homologe bei C. elegans ersetze kënnen, wa se a C. elegans agefouert ginn. Ëmgekéiert kënne vill Gene vu C. elegans änlech wéi Gene vu Mamendéiere funktionéieren.

D’Liewensdauer vu C. elegans ass ongeféier 3 Wochen an ëmfaasst sechs Liewensstadien: d’Embryogenese (Eeërstadium), véier Larvestadien (L1 bis L4) an dat erwuessent Stadium. D’Nematode schlüpfen aus den Eeër als L1-Larven, déi aus 560 Zelle bestinn. De Wuesstem wärend all Larvestadium geschitt duerch Zelldeelung an Zellhypertrophie. Eng Häitung vun der Kutikula markéiert all Larvestadium. Wa schwéier Ëmweltbedéngungen dem Wuerm, dee sech entwéckelt, signaliséieren, datt d’Bedéngunge warscheinlech keng Fruchtbarkeet am erwuessene Stadium erlaben, kann C. elegans seng Entwécklung änneren an en alternativt L3-Larvestadium bilden, an deem d’Larven an en Dauerstadium iwwergoen. An dësem Zoustand sinn d’Déieren aussergewéinlech stresstolerant a laanglieweg a kënnen dräi bis néng Méint iwwerliewen. Dauerlarve schierme sech géint ongënschteg Bedéngungen of, andeems se souwuel hir Mond- wéi och hir Analhiel zoumaachen, hiren Daarm verklengeren an en daf-16/FOXO-ofhängege genetesche Programm aktivéieren, deen ënner anerem zur Expressioun vun enger dauerstadiumspezifescher Kutikula féiert. (cf. Henderson et al., 2006)

Dauerlarve vu C. elegans

Dauerlarven ass d’Bezeechnung fir Nematodelarven, déi an eng alternativ Entwécklungsphas agetruede sinn. De Begrëff „Dauerlarven“ gëtt besonnesch fir Wierm aus der Famill vun de Rhabditiden, dorënner Caenorhabditis elegans, benotzt. D’Wuert „Dauer“ ass vun däitschem Ursprong a bedeit „Dauer“ am Sënn vun „engem Zäitraum“. Dauerlarve trieden an eng Aart Stasis an a kënnen haart Bedéngungen iwwerliewen. Ob a wéini eng Larv an d’Dauerphas antrëtt, hänkt vun den Ëmweltbedéngungen of. Dauerlarve ginn an der Biologie intensiv ënnersicht, well d’Larven eng aussergewéinlech Fäegkeet weisen, haart Ëmweltbedéngungen ze iwwerliewen an iwwer laang Zäitraim ze liewen. Zum Beispill kënnen Dauerlarve vu C. elegans bis zu véier Méint iwwerliewen, vill méi laang wéi hir duerchschnëttlech Liewensdauer vun ongeféier dräi Woche wärend der normaler reproduktiver Entwécklung.

Iwwerbléck iwwer de Liewenszyklus vu C. elegans

Entwécklung vu C. elegans a gënschtegen Ëmweltbedéngungen:
Caenorhabditis elegans (C. elegans) weist ënnerschiddlech Entwécklungsverleef ënner gënschtegen an ongënschtegen Ëmweltbedéngungen.

Reaktioun vu C. elegans op gënschteg Bedéngungen:
Ënner gënschtege Bedéngunge follegt de mikroskopesche Ronnewuerm Caenorhabditis elegans (C. elegans) engem kloer definéierten Entwécklungswee. Den Nematod duerchleeft säi Liewenszyklus typescherweis zimlech séier, wann d’Ëmweltbedéngungen optimal sinn, typescherweis bei Temperaturen tëscht 15°C an 20°C.

Reproduktiv Entwécklung: C. elegans fänkt säi Liewenszyklus als Embryo un. Duerno duerchleeft en véier ënnerschiddlech Larvestadien, ofgekierzt als L1 bis L4.
Erwuessenestadium: Nom Ofschloss vun de véier Larvestadien erreecht C. elegans den Erwuessenestadium a just 3 bis 5 Deeg. An dësem Stadium kënnen d’Wierm sech fortplanzen a liewen nach weider 2 bis 3 Wochen, ofhängeg vun den Ëmweltfacteuren.

Reaktioun vu C. elegans op ongënschteg Bedéngungen:

C. elegans ass awer e widderstandsfäegen Organismus a ka sech duerch e Prozess, deen Dauerbildung genannt gëtt, un ongënschteg Bedéngungen upassen.

Dauerbildung: Wann d’Ëmweltbedéngungen ongënschteg ginn, zum Beispill duerch Iwwerbevëlkerung, e limitéiert Narungsangebot oder héich Temperaturen, kann C. elegans an en aussergewéinlecht drëtt Larvestadium antrieden, dat „Dauer“ genannt an als L3d ofgekierzt gëtt.
Iwwerliewen an der Dauerphas: Dauerlarve si speziell dorun ugepasst, ënner haarde Bedéngungen ze iwwerliewen. Si kënnen an dësem Stadium e puer Méint liewen, dobäi Energie spueren an usprochsvollen Ëmweltbedéngunge widderstoen.

Erhuelung a gënschtegen Ëmweltbedéngungen:
De bemierkenswäerten Aspekt vu C. elegans ass seng Fäegkeet, zu engem normale Liewenszyklus zeréckzekéieren, wann d’Bedéngunge sech verbesseren.

Zeréckkéier zu gënschtege Bedéngungen: Wann Dauerlarve vu C. elegans erëm op gënschteg Bedéngunge stoussen, wéi genuch Narung, eng méi niddreg Populatiounsdicht a passend Temperaturen, huele si d’Verännerung vun der Ëmwelt wouer.
Erhuelung a Fortplanzung: Als Reaktioun op dës verbessert Bedéngungen duerchlafen Dauerlarven e Prozess, deen „Erhuelung“ genannt gëtt. Wärend der Erhuelung gi si zeréck an d’Larvestadien iwwer a gi schliisslech zu fortplanzungsfäegen erwuessene Wierm mat enger normaler Liewensdauer.

Dës Fäegkeet, als Reaktioun op Ëmweltbedéngungen tëscht Entwécklungsstadien ze wiesselen, ass e besonneschen Aspekt vun der Biologie vu C. elegans. Si erméiglecht et de Wierm, ënner enger breeder Palett vu Bedéngungen effektiv ze iwwerliewen a sech fortzeplanzen, wat si zu engem wäertvolle Modellorganismus fir d’wëssenschaftlech Fuerschung mécht, besonnesch fir d’Ënnersichung vun der Entwécklung, der Genetik an dem Alteren.

Virbereedung vu C. elegans-Prouwe mat Ultraschall