Ultraschalllys fir Western Blotting

• De Western Blot ass eng analytesch Prozedur fir den Noweis vu spezifesche Proteinnen an enger Prouf aus Geweebshomogenat oder Zellextrakt.
• Fir e Western Blot duerchzeféieren oder d’Enzymaktivitéit ze moossen, erfuerdere vill Assayen Zougang zu de Materialien (z. B. Proteinnen, DNA, subzellulär Fragmenter), déi an der Zell agespaart sinn.
• D’Beschallung ass eng zouverlässeg an einfach ze handhabend Method fir de kontrolléierten Zellopschloss an d’Lys.

Zellopschloss mat Ultraschall

D’Extraktioun vu Proteinnen aus Geweeben a kultivéierten Zellen ass den éischte Schrëtt fir vill biologesch, biocheemesch an analytesch Techniken (PAGE, Western Blotting, ELISA, Massespektrometrie asw.) oder fir d’Proteinnrengegung. Fir en héije Proteinnertrag ze kréien, mussen d’Zellmaterial an d’Geweeb effizient opgeschloss/lyséiert ginn. Egal ob Planzzell oder Déieregeweeb, d’Beschallung ass d’Method, fir Äert Zelllysat einfach a séier virzebereeden.

Virdeeler vun der Beschallung

• séier & effizient
• einfach Bedéngung
• héije Proteinnertrag
• reproduzéierbar/ widderhuelbar
• präzis kontrolléiert
• skaléierbar

Immunoprezipitatiounsprotokoll fir Western Immunoblotting

A. Reagenzien

Benotzt fir d’Virbereedung vun de Léisunge gereinegt Waasser, wéi Milli-Q.

• 1X phosphatgepuffert Salzléisung (PBS)
• 1X Zelllyspuffer: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM β-Glycerophosphat, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml Leupeptin
  Wichteg: Füügt 1 mM PMSF direkt virum Gebrauch derbäi.
• 15 μl Proteinn A+15 μl Proteinn G si fir d’IP genuch, mee dat ka vun Ärem primären Antikierper a vum Proufvolumen ofhänken. Dir kënnt och virgemëschte Proteinn-A/G-Agarose benotzen (z. B. Proteinn A fir de Pull-down vu Kanéngercher-IgG a Proteinn G fir de Pull-down vu Mais-IgG)
• 3X SDS-Proufpuffer: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 bei 25°C), 6% w/v SDS, 30% Glycerol, 150 mM DTT, 0,03% w/v Bromphenolblo

B. Virbereedung vun Zelllysater

• Recoltéiert d’Zellen. Fir Zellen ënner net denaturéierende Bedéngungen ze recoltéieren, huelt d’Medien ewech a spullt d’Zellen eemol mat äiskalem PBS.
• Huelt de PBS ewech, füügt op all Plack (10 cm) 0,5 ml äiskalen 1X Zelllyspuffer derbäi an inkubéiert d’Placke fir 5 Minutten op Äis.
• Schraapt d’Zelle vun de Placken of an iwwerdrot se a Mikrozentrifugeréiercher. Haalt se op Äis.
• Beschallt zweemol fir jee 10 Sekonnen an äiskalem Immunoprezipitatiounspuffer (IP-Puffer: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 an d’Proteaseinhibitor-Mëschung). Fir d’Beschallung sinn de VialTweeter oder e Sondenultraschallapparat wéi den UP100H oder den UP200Ht am beschte gëeegent.
• Zentrifugéiert d’Lysater bei 15.000 g fir 10 Minutten op 4°C.
• Iwwerdrot den Iwwerstand an en neit Réierchen. (Falls néideg, kann d’Lysat bei –80°C gelagert ginn.)
• Füügt de primären Antikierper zum Iwwerstand derbäi. Den Iwwerstand mam primären Antikierper gëtt fir 1 h bei 4°C ënner liichtem Beweegen inkubéiert. De primären Antikierper gëtt typescherweis an enger Quantitéit derbäigefüügt, déi 10x méi konzentréiert ass wéi déi, déi fir Western Blotting benotzt gëtt. (Dir kënnt mat 1μg pro 100μL ufänken.)
• Den Iwwerstand gëtt duerno mat der Mëschung aus gläiche Quantitéite vu Proteinn-A-Agarose (Invitrogen) a Proteinn-G-Agarose fir eng weider 1 h inkubéiert.
• Wäscht d’Agarosepellets dräimol mat IP-Puffer. Extrahéiert duerno déi gebonne Proteinne mam SDS-PAGE-Luedpuffer, andeems Dir se fir 5 Minutten op 95°C erhëtzt.

C. Immunoprezipitatioun

• Huelt 200 μl Zelllysat a füügt de primären Antikierper derbäi. Inkubéiert iwwer Nuecht bei 4°C ënner liichtem Wippen.
• Füügt entweder Proteinn-A- oder Proteinn-G-Agarosekäre bäi (20 μl vun enger 50% Käre-Suspensioun). Inkubéiert fir 1–3 Stonne bei 4°C ënner liichtem Wippen.
• Mikrozentrifugéiert fir 30 Sekonne bei 4°C. Wäscht de Pellet fënnefmol mat 500 µl 1X Zelllyspuffer. Haalt en tëscht a wärend de Wäschschrëtt op Äis.
• Resuspendéiert de Pellet mat 20 μl 3X SDS-Proufpuffer. Mëscht mam Vortexmëscher a mikrozentrifugéiert duerno fir 30 Sekonnen.
• Erhëtzt d’Prouf fir 2–5 Minutten op 95–100°C a mikrozentrifugéiert fir 1 Minutt bei 14.000 X g.
• Lued d’Prouf (15–30 μl) op e SDS-PAGE-Gel (12–15%).
• Analyséiert d’Prouf mat Western Blotting.

Western-Blot-Analys mam Sonikator UP50H

De folgende Protokoll mam Sondesonikator UP50H gouf an der Etüd vu Kriebisch et al. (2011) benotzt:
Gesamtproteinn gouf aus MC3T3-E1-Zellen isoléiert, déi mat 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) oder dem Trägermëttel behandelt gi waren. D’Zelle goufe mat engem Puffer lyséiert, dee 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) an 0,5% Natriumdeoxycholat (Merck) enthale huet. D’Zelllysat gouf fir 2 × 10 s bei Zyklus 1 an Amplitud 80 mam UP50H Ultrasonic Processor (Hielscher, Ultraschalltechnologie, Teltow, Däitschland) beschallt. Duerno gouf d’Material fir 10 min bei 14.000 rpm zentrifugéiert an den Iwwerstand fir Western Blotting benotzt. Fënnefanzwanzeg μg Proteinn goufen am Proufpuffer a Reduktiounsmëttel (Invitrogen) gekacht an duerno duerch SDS-PAGE mat 4–12% Polyacrylamidgelen (Invitrogen) getrennt an op eng Nitrozellulosemembran (GE health care) iwwerdroen. D’Membran gouf fir 1 h mat TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) blockéiert, deen 1% Kasein (Sigma-Aldrich) an 1% Tris (1 M) enthale huet. Nom Blockéiere gouf d’Membran iwwer Nuecht bei 4°C ënner liichtem Beweegen mam primären Antikierper inkubéiert (Kanéngerchen-Anti-Mënsch-CBS 1/500, entwéckelt am Labo vum Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA). D’Inkubatioun mat engem sekundären Antikierper (Dako), dee mat Meerrettichperoxidase (HPR) konjugéiert war, gouf fir 1 h bei Raumtemperatur duerchgefouert. All Blotte goufe mat verstäerkter Chemilumineszenz (Perkin Elmer) entwéckelt.
 

Klickt hei, fir méi iwwer bewäert Verfare fir d’Zelllys an d’Extraktioun mat Ultraschall, d’Virbereedung vu Lysater a Recommandatioune fir Prozessverbesserungen ze liesen!
 
D’Tabell hei ënnendrënner gëtt Iech en Unhaltspunkt fir déi ongeféier Veraarbechtungskapazitéit vun eisen Ultraschallapparater am Labomoossstaf:

Literatur / Referenzen

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.