Ultraschall Lysis fir Western Blotting

  • De westleche Blot ass eng analytesch Prozedur fir d'Detektioun vu spezifesche Proteinen an enger Probe vum Gewëssenhomogen oder Zellextrakt.
  • Fir e Western blot oder d'Enzymaktivitéit ze mellen, erfuerdert vill Erkenntnisse op d'Materialien (zB Proteine, DNA, subzellulär Fragmenter), déi an der Zell erfaasst sinn.
  • Sonication ass eng verlässlech an einfach ze handhabenmethod fir kontrolléiert Zelle Stéierung an Lyse.

Ultrasone Zell Sturz

Protein Extraktioun aus Gewëss a kultivéiert Zellen ass den éischte Schrëtt fir vill biologesch, biochemesch an analytesch Techniken (PAGE, Western Blotting, ELISA, Massespektrometry etc.) oder Proteinreinung. Fir een héije Protein Ausbezuelen ze kréien, muss de Zellmaterial a Gewëss effizient gestierzt / lyséiert ginn. Ob Planzenzellen oder Déierewëssenschaft, Dotatioun ass d'Methode fir Äert Zell Lysat einfach a séier ze preparéieren.

Virdeeler vun der Sonikatioun

  • Séier & effizient
  • einfach Operatioun
  • héich Protein Ausgab
  • reproduzierbar / widderhuelen
  • präis kontrolléiert
  • skalierbar sinn

Immunoprecipitationsprotokoll Fir Western Immunoblotting

A. Reagenz

Fir d'Virbereedung vun de Léisunge benotzt Dir gereinegt Waasser wéi Milli-Q.

  • 1X Phosphat Buuffered Salin (PBS)
  • 1X Zell Lysis Buffer: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM β-Glycerophosphat, 1 mM Na3VO4, 1 ug / ml Leupeptin
    Wichteg: Setzt 1 mM PMSF direkt virum Gebrauch.
  • 15 μl Protein A + 15 μl Protein G ass genuch fir IP, awer et kann ofhängeg vun Ärem primären Antikörper an de Probevolumen. Dir kënnt och virdru vermëschen Protein A / G Agarose benotzen (zB Protein A fir Kaninchen IgG zéien down a Protein G fir d'Maus IgG zéien down)
  • 3X SDS Probe Puffer: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6.8 bei 25 ° C), 6% W / V SDS, 30% Glycerol, 150 mM DTT, 0,03% w / v Bromphenol blo

B. Préparatioun vu Cell Lysates

  • Ernidderung vun den Zellen. Fir Zellen ënner nondenatürende Konditioune ze ernären, bréngen d'Medien erëm an d'Spullzellen erëm mat eiskaltem PBS.
  • Remove PBS a fëllt 0,5 ml Kockellysis-Puffer vun 0,5 ml an all Plack (10 cm) an d'Platen op Eis fir 5 Minutten.
  • Scrape Zellen aus de Placken a transferéieren op d'Mikrozentrifugenrohre. Halt op Äis.
  • Sëtzt zweemol fir 10 Sekonnen an Eise kale Immunoprecipitations Puffer (IP-Puffer: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 an der Protease Inhibitormix). Fir d'Unerkennung, de VialTweeter oder e Sonde-Ultraschall wéi d' UP100H oder UP200Ht sinn am meeschten ugepasst.
  • Centrifuge d'Lysate bei 15.000 g während 10 Minuten bei 4 ° C.
  • Den Iwwerstand zu engem neie Röh. (Falls néideg, de Lysat kann op -80 ° C gelagert ginn.)
  • Den primären Antikörper dem Iwwerstand z'erreechen. De Supernatant mam primäre Antikörper gëtt fir 1 Stonn bei 4 ° C ënner lues agitéiert. Primär Antikörper gëtt normalerweis an engem Betrag 10x méi konzentréiert, wéi deen fir d'Western Blotting benotzt. (Dir kënnt mat 1μg pro 100μL starten.)
  • De Supernatant gëtt duerno weider mat der Mëschung vu gläichen Mengen vun Protein A-Agarose (Invitrogen) a Protein G Agarose fir eng 1 Stonn inkubéiert.
  • D'Agarose pellets dreimal mat IP-Puffer wäschen. Duerno extrait de gebonnen Proteïen mam SDS-PAGE-Lénkpuffer duerch Erhitzen op 95 ° C fir 5 Minutten.

C. Immunoprecipitation

  • Huelt 200μl ZellLysat a fügen Primärantikörper. Inkubatioun bei enger zäiteger Rockung iwwer 4 ° C.
  • Fügt entweder Protein A oder G Agaroskerne (20 μl 50% Perlen). Inkubatéiert mat enger zéng Kachen fir 1-3 Stonnen op 4 ° C.
  • Microcentrifuge fir 30 Sekonne bei 4 ° C. Wäiss pellet fënnef Mol mat 500 ul vun 1X Zell Lysepuffer. Keep op iis während de wäschen.
  • Resuspendéiert de Pellet mat 20 ul 3X SDS Probe Puffer. Vivex, duerno Mikrozentrifuge fir 30 Sekonne.
  • Hëtzt d'Probe op 95-100 ° C fir 2-5 Minuten a Mikrozentrifuge fir 1 Minute bei 14.000 X g.
  • Lued de Probe (15-30 μl) op SDS-PAGE Gel (12-15%).
  • Analyse Beispill vun Western Blotting analyséieren.

Kontaktéiert eis / frot bei méi Informatiounen

Diskussioun un eis iwwert Är Veraarbechtung Ufuerderunge. Mir wäerten déi gëeegent charge an Veraarbechtung Parameteren fir Äre Projet recommandéieren.






Méi Sonication Protokollen

Western Blot Analyse mam Ultraschall UP50H

Dëse Protokoll gouf an der Studie vu Kriebisch et al benotzt. (2011):
D'Gesamtproteinin gouf aus MC3T3-E1 Zellen isoléiert mat 1,25 (OH)2D3 (10-8 M) oder Gefier. D'Zellen goufen a Puffer lyséiert mat 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) a 0,5% Natriumdeoxycholat (Merck). D'Zelllysat gouf bei 2 × 10 s bei Zyklus 1 an Amplitude 80 mat der UP50H Ultraschallprozessor (Hielscher, Ultraschall Technologie, Teltow, Däitschland). Duerno gouf den Zëmmer fir 10 min bei 14.000 U / min zerstéiert an den Iwwerstand fir e Western Blotting benotzt. Wärend vu fënnef Mikrogramm Protein gouf gekuckt am Proufpuffer a Reduktionsagent (Invitrogen) an duerno ofgetrennt duerch SDS-PAGE mat 4-12% Polyacrylamid Gelen (Invitrogen) an an eng Nitrocellulosemembran (GE Gesondheetsversorgung) transferéiert. D'Membran gouf fir 1 Stonn mat TBS (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl) blockéiert, deen 1% Kasein (Sigma-Aldrich) a 1% Tris (1 M) enthält. Nom Blockement gouf d'Membran mat lues agitatioun um 4 ° C mat dem primäre Antikörper (Kaninchen anti-human CBS 1/500 entwéckelt, deen am Labour vum Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA entwéckelt gouf). D'Inkubatioun mat engem Meerrott Peroxidase (HPR) -konjugéiert sekundär Antikörper (Dako) gouf fir 1 Stonn bei Raumtemperature gemaach. All Blotz gouf vun enger Chemilumineszenz (Perkin Elmer) entwéckelt.

Literatur / nëmmen



Iwwer Western Blotting

Bloit sinn analytesch Prozeduren, bei deenen DNA, RNA a Proteine op e Carrier transferéiert ginn, sou datt se trennt kënne ginn.
De Süde Blot gëtt fir d'Detektioun vun DNA, den Northern Blot fir RNA an den Western Blot fir Proteinen.
Déi Western Blotting gëtt och als Protein Immunoblott gemellt, well e Antikörper benotzt gëtt fir säi Antigen spezifesch z'entdecken. Déi Western Blotting ass eng vun de wichtegsten Analysemethoden fir spezifesch Proteine bei der Probe ze detektéieren. Am Western blot sinn d'Proteine on Membranen immobiliséiert fir se mat monoclonalen oder polyklonalen Antikörpern ze detektéieren.
Duerch SDS-Polyacrylamid Gelelektrophoresis (SDS-PAGE) native Proteine ginn duerch 3-D-Struktur oder denaturéiert Proteinen duerch d'Längt vum Polypeptid getrennt. D'Proteine ginn dann op eng Membran (typesch Nitrozellulose oder PVDF) übertragen, wou se gefierft ginn mat Antikörper, déi spezifesch dem Zielprotein sinn. Den Elektrophoreséierungsschritt vu Gel gëtt an der westlecher Blotanalyse beaflosst fir d'Fro vun der Cross-Reaktivitéit vun Antikörpern ze léisen.
Duerno sinn d'getrennte Proteine op eng Matrix (haaptsächlech op enger Nitrocellulose oder PVDF-Membran) geblott, wou se mat Antikörper gefierft ginn. D'Antikörper funktionnéieren als Sonde an ginn speziell fir d'Zielprotein ausgewielt. D'Analyse vum Standuert an d'Intensitéit vun der spezifescher Reaktioun weist d'Expressiounsdetailer vun den Zielproteinen an der spezifizéierter Probe. D'Western blotting konnt Zielprotein feststellen, wat esou kleng wéi 1ng ass wéinst der grousser Auflösung vun der Gelelektrophorese an der staarker Spezifitéit an der grousser Empfindlechkeet vum Immunoassay. D'Western blot Method ass an der Molekularbiologie, Biochemie, Immunogenetik an aner molekulare Fuerschungsfelder benotzt.
Aner ähnlech Techniken beinhalt d'Punkt Blot Analyse, d'Immunhistochemie an d'Immunozytochemie, wou Antikörper benotzt ginn fir Proteine an Gewëssen a Zellen duerch Immunostinn z'entscheeden, an enzymgebonneent immunosorbent Assay (ELISA).

Hielscher's VialTweeter is is´deal for the lysis of multiple samples

VialTweeter fir Ultraschallprobe

Kontaktéiert eis! / Frot eis!






Sonication ass e wichtege Schrëtt fir d'Proufpräparatioun

UP200St mat Micro-Tipp fir d'Opléisung vun der Opléisung