Ultrasonic Lysis fir Western Blotting

• De westleche Blot ass eng analytesch Prozedur fir d'Detektioun vu spezifesche Proteinen an enger Probe vun Tissuehomogenat oder Zellextrakt.
• Fir e Western Blot ze lafen oder Enzymaktivitéit ze moossen, erfuerderen vill Assays Zougang zu de Materialien (zB Proteinen, DNA, subzelluläre Fragmenter), déi an der Zell agespaart sinn.
• Sonication ass eng zouverlässeg an einfach ze handhaben Method fir kontrolléiert Zell Stéierungen a Lysis.

Ultraschall Zell Stéierungen

Proteinextraktioun aus Stoffer a kultivéierten Zellen ass den éischte Schrëtt fir vill biologesch, biochemesch an analytesch Techniken (PAGE, Western Blotting, ELISA, Massespektrometrie, etc.) oder Proteinreinigung. Fir eng héich Proteinausbezuelung ze kréien, muss d'Zellmaterial an den Tissu effizient gestéiert / lyséiert ginn. Egal ob Planzzell oder Déieregewebe, Sonikatioun ass d'Method fir Ären Zelllysat einfach a séier ze preparéieren.

Virdeeler vun Sonication

• Schnell & Effikass
• Einfach Operatioun
• héich Protein Rendement
• reproduzéierbar / widderholl
• genee kontrolléiert
• skalierbar

Immunoprecipitation Protocol Fir Western Immunoblotting

A. Reagens

Fir d'Virbereedung vun de Léisungen, benotzt gereinegt Waasser wéi Milli-Q.

• 1 x Phosphat gebufferter Saline (PBS)
• 1X Zell Lysis Buffer: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM β-glycerophosphat, 1 mM 13 VO4g, 1 mM Na ml Leupeptin
  Wichteg: Füügt 1 mM PMSF direkt virum Gebrauch derbäi.
• 15 μl Protein A + 15 μl Protein G ass genuch fir IP, awer et kann ofhängeg vun Ärem primäre Antikörper a Probevolumen. Dir kënnt och virgemëschte Protein A/G Agarose benotzen (zB Protein A fir Kanéngchen IgG erofzéien a Protein G fir Maus IgG erofzéien)
• 3X SDS Sample Buffer: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 bei 25°C), 6% w/v SDS, 30% glycerol, 150 mM DTT, 0,03% w/v bromophenol blue

B. Virbereedung vun Zell Lysates

• Ernte d'Zellen. Fir Zellen ënner net-denaturéierende Bedéngungen z'ernimmen, Medien ewechzehuelen an Zellen eemol mat äiskale PBS spülen.
• Ewechzehuelen PBS a fügen 0,5 ml äiskal 1X Zell lysis Puffer op all Plack (10 cm) an incubate der Placke op Äis fir 5 Minutten.
• Schrauwen Zellen vun de Placke a transferéieren op Mikrocentrifuge-Tubes. Halt op Äis.
• Sonicate zweemol fir 10 Sekonnen an äiskalem Immunoprecipitatiounsbuffer (IP-Puffer: 50 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40 an d'Protease-Inhibitormix). Fir sonication, der VialTweeter oder e Sonde Ultraschall wéi de UP100H oder UP200Ht sinn am meeschte gëeegent.
• Zentrifuge d'Lysate bei 15.000 g fir 10 Minutten bei 4 ° C.
• Transfert de Supernatant an en neit Röhre. (Wann néideg, kann d'Lysat bei -80 ° C gelagert ginn.)
• Füügt de primäre Antikörper zum Supernatant. De Supernatant mat dem primäre Antikörper gëtt fir 1 h bei 4 ° C ënner liichtem Agitatioun inkubéiert. Primär Antikörper gëtt typesch an engem Betrag 10x méi konzentréiert bäigefüügt wéi fir westlech Blotting benotzt gëtt. (Dir kënnt mat 1μg pro 100μL ufänken.)
• De Supernatant gëtt dann weider mat der Mëschung aus gläiche Quantitéite Protein A-Agarose (Invitrogen) a Protein G Agarose fir eng aner 1 h inkubéiert.
• Wäscht d'Agarose-Pellets dräimol mat IP-Puffer. Duerno extrahéiert déi gebonnen Proteine mat dem SDS-PAGE Luedebuffer andeems Dir 5 Minutten op 95 ° C erhëtzt.

C. Immunoprecipitatioun

• Huelt 200 μl Zelllysat a füügt primär Antikörper derbäi. Inkubéiert mat sanfte Schaukel iwwer Nuecht bei 4 ° C.
• Füügt entweder Protein A oder G Agarose Perlen (20 μl vun 50% Perlen Schlamm). Inkubéiert mat sanfte Schaukel fir 1-3 Stonnen bei 4 ° C.
• Mikrocentrifuge fir 30 Sekonnen bei 4 ° C. Wash Pellet fënnef Mol mat 500 μl vun 1X Zell Lysis Puffer. Halt op Äis während wäschen.
• Resuspendéiert de Pellet mat 20 μl 3X SDS Probebuffer. Vortex, dann microcentrifuge fir 30 Sekonnen.
• Hëtzt d'Probe op 95-100 ° C fir 2-5 Minutten a Mikrocentrifuge fir 1 Minutt bei 14.000 X g.
• Lued d'Probe (15-30 μl) op SDS-PAGE Gel (12-15%).
• Analyséiere Probe duerch Western Blotting.

Western Blot Analyse mam Sonicator UP50H

Nom Protokoll mam Sonde-Typ Sonicator UP50H gouf an der Studie vu Kriebisch et al. (2011):
Total Protein gouf aus MC3T3-E1 Zellen isoléiert mat 1,25 (OH) behandelt₂D₃ (10^-8 M) oder Gefier. Zellen sech mat engem Prellbock mat 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich) lysed; 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) an 0,5% Natriumdeoxycholat (Merck). D'Zelllysat gouf sonicated fir 2 × 10 s am Zyklus 1 an Amplitude 80 mat der UP50H Ultraschall Prozessor (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Däitschland). Duerno gouf d'Material fir 10 min bei 14.000 RPM centrifugéiert an de Supernatant gouf fir Western blotting benotzt. Fënnefanzwanzeg μg Protein gouf a Probebuffer a Reduzéierungsmëttel (Invitrogen) gekacht an duerno duerch SDS-PAGE getrennt mat 4-12% Polyacrylamidgelen (Invitrogen) an op eng Nitrocellulose Membran (GE Gesondheetsversuergung) transferéiert. D'Membran war fir 1 h mat TBS blockéiert (10 mm Tris-HCl; pH 7,6; 150 mm NaCl) mat 1% casein (Sigma-Aldrich) an 1% Tris (1 M). No Spär, war d'Membran mat liicht Agitation Iwwernuechtung bei 4 ° C mat der Primärschoul antibody incubated (Kanéngchen Anti-Mënsch CBS 1/500, am Labo vum Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA entwéckelt). Inkubatioun mat engem Meerrettich Peroxidase (HPR)-konjugéierten Secondaire Antikörper (Dako) gouf fir 1 h bei Raumtemperatur gemaach. All Blots goufen duerch verstäerkte Chemilumineszenz (Perkin Elmer) entwéckelt.
 

Klickt hei fir méi iwwer bescht Praktiken fir Ultraschallzellelysis an Extraktioun ze liesen, Lysatpräparatioun a Empfehlungen fir Prozessverbesserungen!
 
D'Tabell hei drënner gëtt Iech eng Indikatioun vun der geschätzter Veraarbechtungskapazitéit vun eise Labo-Gréisst Ultraschaller:

Literatur / Referenzen