Zell Lysis vun BL21 Zellen duerch Ultrasonication
BL21 Zellen sinn e Stamm vun E. coli déi wäit an de Fuerschungslaboratoiren, Biotechnologie an Industrieproduktioun benotzt gëtt wéinst hirer Kapazitéit fir Proteinen héich effizient auszedrécken. Ultrasonic Zell Stéierungen, Lysis a Protein Extraktioun ass déi allgemeng Method fir déi gezielte Proteinen aus dem cellulären Interieur vun BL21 Zellen ze isoléieren an ze sammelen. Ultrasonication stéiert d'Zelle komplett a befreit all agespaart Proteinen, sou datt 100% vum Protein verfügbar ass.
BL21 Zellen fir Protein Ausdrock
BL21 Zell ass eng chemesch kompetent E. coli bakteriell Stamm gëeegent fir Transformatioun an héich Niveau Protein Ausdrock mat engem T7 RNA Polymerase-IPTG Induktioun System. BL21 Zellen erlaben héich-Effizienz Protein Ausdrock vun all Gen, datt ënner der Kontroll vun engem T7 Promoteur ass. Den E. coli Stamm BL21(DE3) ass en T7 RNA Polymerase-baséiert Proteinproduktiounsstamm kombinéiert mat T7 Promoteur-baséiert Ausdrockvektoren a gëtt wäit an Laboratoiren an Industrie applizéiert fir rekombinant Proteinen ze produzéieren. Am BL21 (DE3) gëtt den Ausdrock vum Gen, deen de rekombinante Protein codéiert, vun der chromosomal kodéierter T7 RNA Polymerase (T7 RNAP) transkribéiert, déi aacht Mol méi séier transkriptéiert wéi konventionell E. coli RNAP. Dëst mécht de Stamm BL21(DE3) héich effizient a verwandelt et zu engem vun de meescht bevorzugte Proteinausdrockzellsystemer.
Protokoll fir Ultraschall Lysis a Protein Extraktioun aus BL21 Zellen
Zelllysis vu BL21 Zellen gëtt meeschtens mat Ultraschall a Kombinatioun mat Natriumlauroyl Sarcosinat (och bekannt als Sarkosyl) als Lysisbuffer gemaach. D'Virdeeler vun der Ultraschallzellstéierung an der Proteinextraktioun leien an der Zouverlässegkeet, Reproduktioun wéi och einfach, sécher a séier Operatioun vun Ultraschaller. De Protokoll hei drënner gëtt eng Schrëtt-fir-Schrëtt Richtung fir Ultraschall BL21 Zell Lysis:
- Fir d'Chaperone Proteinen ze entfernen, goufen BL21 bakteriell Pellets an 50 ml äiskalem Natrium Tris-EDTA (STE) Puffer resuspendéiert (besteet aus 10 mM Tris-HCL, pH 8.0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl ergänzt mat 100 mM PMSF).
- D'500 ul vun Lysozym (10 mg / ml) ginn dobäi an d'Zellen sinn op Äis fir 15 min incubated.
- Duerno ginn 500 ul DTT a 7 ml Sarkosyl (10% (w/v) aus STE-Puffer) dobäigesat.
- Et ass essentiell fir all Reinigungsbuffer äiskal ze halen an d'Proben ëmmer op Äis ze halen. All Reinigungsschrëtt solle wa méiglech am kale Raum duerchgefouert ginn.
- Fir Ultraschalllysis a Proteinextraktioun ginn d'Proben sonicated an der VialTweeter MultiSample Ultrasonicator fir 4 x 30 sec bei 100% Amplitude mat engem 2 min Intervall tëscht all sonication. Alternativ, en Sonde-Typ Ultraschall Homogenisator mat Mikro-Tipp zB, UP200Ht mat S26d2 (3 x 30 sec, 2 min. Paus tëscht Ultraschallzyklen, 80% Amplitude) ka benotzt ginn.
- Fir weider Reinigungsschrëtter mussen d'Proben op Äis gehal ginn oder alternativ bei -80 ° C bis weider Veraarbechtung gelagert ginn.
Ultraschall Zell Disruptor UP200St mat Mikro-Tipp S26d2 fir Lysis an Protein Extraktioun
Ultrasonic Lysis ënner Präzise Temperaturkontroll
Déi präzis an zouverlässeg Temperaturkontroll ass entscheedend beim Ëmgang mat biologesche Proben. Héich Temperaturen initiéieren thermesch induzéiert Proteindegradatioun a Proben.
Wéi all mechanesch Probepräparatiounstechniken, erstellt Sonikatioun Hëtzt. Wéi och ëmmer, d'Temperatur vun de Proben kann gutt kontrolléiert ginn wann Dir de VialTweeter benotzt. Mir presentéieren Iech verschidde Méiglechkeeten fir d'Temperatur vun Äre Proben ze iwwerwaachen an ze kontrolléieren wärend Dir se mam VialTweeter a VialPress fir Analyse virbereet.
- Iwwerwaachung vun der Probetemperatur: Den Ultraschallprozessor UP200St, deen den VialTweeter dréit, ass mat enger intelligenter Software an engem pluggbare Temperatursensor ausgestatt. Steet den Temperatursensor an den UP200St an setzt den Tipp vum Temperatursensor an ee vun de Proberöhren. Via digital faarweg Touch-Display kënnt Dir am Menü vun der UP200St e spezifescht Temperaturbereich fir Är Probe-Sonicatioun setzen. Den Ultraschall stoppt automatesch wann d'maximal Temperatur erreecht gëtt a pausen bis d'Probetemperatur erof op den ënneschten Wäert vun der festgeluegter Temperatur ∆ ass. Da fänkt d'Sonication automatesch erëm. Dës intelligent Feature verhënnert Hëtzt-induzéiert Degradatioun.
- De VialTweeter Block kann virgekillt ginn. Setzt de VialTweeter Block (nëmmen d'Sonotrode ouni Transducer!) An de Frigo oder de Frigo fir den Titanblock ze precoolen hëlleft d'Temperaturerhéijung an der Probe ze posten. Wa méiglech, kann d'Probe selwer och virgekillt ginn.
- Benotzt dréchen Äis fir während der Sonikatioun ze killen. Benotzt e flaache Schacht gefëllt mat trockenem Äis a setzt de VialTweeter op d'Äis sou datt d'Hëtzt séier opléise kann.
Clienten weltwäit benotzen de VialTweeter a VialPress fir hir alldeeglech Probepräparatiounsaarbecht a biologeschen, biochemeschen, medizineschen a klineschen Laboratoiren. Déi intelligent Software an d'Temperaturkontrolle vum UP200St Prozessor, d'Temperatur ass zouverlässeg kontrolléiert an d'Hëtzt-induzéiert Probe Degradatioun vermeit. Ultrasonic Probe Virbereedung mam VialTweeter a VialPress liwwert héich zouverlässeg a reproduzéierbar Resultater!
Fannt den Optimal Ultrasonic Disruptor fir Är Lysis Applikatioun
Hielscher Ultrasonics ass e laangjärege erfuerene Fabrikant vu High-Performance Ultrasonic Zell Disrupters an Homogenisatoren fir Laboratoiren, Bench-Top an industriell Skala Systemer. Är bakteriell Zellkulturgréisst, Är Fuerschungs- oder Produktiounsziel an de Volume vun der Zell fir pro Stonn oder Dag ze veraarbecht sinn wesentlech Faktore fir de richtegen Ultraschallzellstéierer fir Är Uwendung ze fannen.
Hielscher Ultrasonics bitt verschidde Léisunge fir d'simultan Sonikatioun vu Multi-Proben (bis zu 10 Fläschen mam VialTweeter) a Masseproben (dh Mikrotiterplacke / ELISA Placke mat der UIP400MTP), souwéi de klassesche Sonde-Typ Labo Ultrasonicator mat verschiddene Kraaftniveauen vun 50 bis 400 Watt bis zu voll industriellen Ultraschallprozessoren mat bis zu 16.000 Watt pro Eenheet fir kommerziell Zellstéierung a Proteinextraktioun a grousser Produktioun. All Hielscher Ultraschaller si fir d'24/7/365 Operatioun ënner voller Laascht gebaut. Robustheet an Zouverlässegkeet si Kärfeatures vun eisen Ultraschallapparater.
All digital Ultrasonic Homogenisatoren si mat Smart Software, faarwege Touch Display an automatesch Dateprotokolléierung ausgestatt, déi den Ultraschallapparat zu engem prakteschen Aarbechtsinstrument an Labo a Produktiounsanlagen maachen.
Loosst eis wëssen, wéi eng Zellen, wat Volumen, mat wéi enger Frequenz a mat wéi engem Zil Dir Är biologesch Proben veraarbecht. Mir recommandéieren Iech de gëeegentste Ultraschallzellstéierer fir Är Prozessfuerderunge.
D'Tabell hei drënner gëtt Iech eng Indikatioun iwwer d'ongeféier Veraarbechtungskapazitéit vun eisen Ultraschallsystemer vu kompakten Handgehalten Homogenisatoren a MultiSample Ultrasonicatoren bis industriell Ultraschallprozessoren fir kommerziell Uwendungen:
| Batch Volume | Duerchflossrate | Recommandéiert Apparater |
|---|---|---|
| 96-Well / microtiter Placke | na | UIP400MTP |
| 10 Fläschen à 0,5 bis 1,5 ml | na | VialTweeter bei UP200St |
| 001 bis 250 ml | 5 bis 100 ml/min | UP50H |
| 001 bis 500 ml | 10 bis 200 ml/min | UP100H |
| 10 bis 2000 ml | 20 bis 400 ml/min | UP200Ht, UP 400 St |
| 0.1 bis 20L | 02 bis 4 l/min | UIP2000hdT |
| 10 bis 100 l | 2 bis 10 l/min | UIP4000hdT |
| na | 10 bis 100 l/min | UIP16000 |
| na | méi grouss | Stärekoup vun UIP16000 |
Kontaktéiert eis! / Frot eis!
UIP400MTP Platte Sonicator fir High-Performance Zell Stéierungen an 96-Well Placke
ultrasonicator UP200Ht mat 2mm Microtip S26d2 fir d'Sonication vu klenge Proben
Liest méi iwwer wéi Dir Ären Ultraschallgewebe Homogenisator benotze kënnt fir déi effizient an zouverlässeg Virbereedung vu Pufferléisungen!
Fakten Worth Wëssen
Escherichia Coli Bakterien
Escherichia coli ass eng Bakterientyp, dat ass net-sporeformend, Gram-negativ a zeechent sech duerch seng Form vun enger riichter Staang. E.coli Bakterien sinn an der Ëmwelt, Liewensmëttel an Darm vu Mënschen an Déieren präsent. E. coli ass normalerweis beweeglech andeems se peritrichesch Flagella benotzt, awer et ginn och net-beweeglech Aarte. E.coli si sougenannte fakultativ anaerobe chemoorganotroph Organismen, dat heescht datt se fäeg sinn souwuel respiratoresch wéi fermentativ Metabolismus ze maachen. Déi meescht E.coli Aarte si benign an erfëllen nëtzlech Funktiounen am Kierper, zB Ënnerdréckung vum Wuesstum vu schiedleche Bakterienarten, Synthese vu Vitaminnen etc.
Escherichia coli Bakterienzelle vum sougenannte B Typ sinn eng speziell Kategorie vun E.coli Stämme, déi wäit an der Fuerschung benotzt gi fir Mechanismen wéi Bakteriofagempfindlechkeet oder Restriktiounsmodifikatiounssystemer z'ënnersichen. Ausserdeem ginn E.coli Bakterien als zouverléisseg Aarbechtspäerd fir Proteinausdrock an Biotechnologie a Life Science Laboratoiren geschätzt. Zum Beispill ginn E.coli benotzt fir Verbindungen wéi Proteinen an Oligosacchariden op industrieller Skala ze synthetiséieren. Wéinst spezifesche Fonctiounen wéi Protease Defizit, niddereg Acetat Produktioun op engem héije Niveau vun Glukos, a verstäerkte Permeabilitéit, E. coli B Zellen sinn hien am meeschte benotzt Host Zellen fir d'Produktioun vun genetesch manipuléiert Proteinen.
Rekombinant Protein
Rekombinant Proteinen (rProt) gewannen bedeitend Wichtegkeet a ville Filialen, och an der chemescher Produktioun, pharmazeutescher, kosmetescher, Mënsch- an Déiermedizin, Landwirtschaft, Liewensmëttel wéi och Offallbehandlungsindustrie.
D'Produktioun vu rekombinante Protein erfuerdert d'Benotzung vun engem Ausdrocksystem. Als Ausdrock vun Zellsystemer fir d'Produktioun vu rekombinant DNA, kënne souwuel prokaryotesch wéi eukaryot Zellen benotzt ginn. Wärend Bakterienzelle am meeschte verbreet fir Proteinausdrock benotzt ginn wéinst Faktoren wéi niddrege Käschten, einfach Skalierbarkeet an einfache Medienbedéngungen, Mamendéieren, Hef, Algen, Insekt an Zellfräi Systemer sinn etabléiert Alternativen. D'Proteintyp, d'funktionell Aktivitéit, souwéi déi erfuerderlech Ausbezuele vum ausgedréckte Protein beaflossen d'Auswiel vum Zellsystem, deen fir Proteinausdrock benotzt gëtt.
Fir rekombinant Protein auszedrécken, muss eng bestëmmte Zell mat engem DNA Vektor transfektéiert ginn, deen d'Schabloun vun der rekombinanter DNA enthält. D'Zellen transfektéiert mat der Schabloun ginn dann kultivéiert. Als Konsequenz vum celluläre Mechanismus, transkriberen an iwwersetzen d'Zellen de Protein vum Interesse, an doduerch dat geziilt Protein produzéieren.
Wéi déi ausgedréckte Proteine an der cellulärer Matrix agespaart sinn, muss d'Zelle lyséiert ginn (gestéiert a gebrach) fir d'Proteine ze befreien. An engem spéideren Reinigungsstuf gëtt de Protein getrennt a gereinegt.
Déi éischt rekombinant Protein, déi an der Behandlung benotzt gouf, war rekombinant mënschlecht Insulin am Joer 1982. Haut gi méi wéi 170 Aarte vu rekombinant Protein weltwäit fir medizinesch Behandlungen produzéiert. Allgemeng benotzt rekombinant Proteine, déi an der Medizin benotzt ginn, sinn zum Beispill rekombinant Hormonen, Interferonen, Interleukine, Wuesstumsfaktoren, Tumornekrosefaktoren, Bluttgerinnungsfaktoren, thrombolytesch Medikamenter, an Enzyme fir d'Behandlung vu grousser Krankheeten wéi Diabetis, Zwergismus, Myokardinfarkt, kongestiv Häerzversoen, cerebral Apoplexie, Multiple Sklerose, Neutropenie, Thrombozytopenie, Anämie, Hepatitis, rheumatoider Arthritis, Asthma, Crohn's Krankheet, a Kriibstherapien. (cf. Phuc V. Pham, an Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)
Literatur / Referenzen
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
VialTweeter sonicator fir déi simultan Sonikatioun vun 10 Proben, zB fir BL21 Zellen ze stéieren
Héich performant Ultraschall! D'Produktpalette vun Hielscher deckt de ganze Spektrum vum kompakten Labo Ultraschall iwwer Bench-Top-Eenheeten bis voll-industriell Ultraschallsystemer.