Zelllyse vu BL21-Zellen duerch Ultraschallbehandlung
BL21-Zelle sinn e Stamm vun E. coli, dee wéinst senger Fäegkeet, Proteinne mat héijer Effizienz ze expriméieren, a Fuerschungslaboratoiren, an der Biotechnologie an an der industrieller Produktioun vill benotzt gëtt. Den Zellopbroch, d’Lyse an d’Proteinextraktioun mat Ultraschall sinn déi üblech Method, fir déi gewënscht Proteinnen aus dem Zellbannege vu BL21-Zellen ze isoléieren an ze sammelen. D’Ultraschallbehandlung brécht d’Zell komplett op a setzt all ageschlosse Proteinne fräi, soudatt 100% vum Protein disponibel sinn.
BL21-Zelle fir d’Proteinexpressioun
BL21 ass e cheemesch kompetente Bakteriestamm vun E. coli, dee fir d’Transformatioun an eng héich Proteinexpressioun mat engem T7-RNA-Polymerase-IPTG-Induktiounssystem gëeegent ass. BL21-Zellen erméiglechen eng héich effizient Proteinexpressioun vun all Gen, dat ënner der Kontroll vun engem T7-Promoter steet. Den E. coli-Stamm BL21(DE3) ass e Proteinproduktiounsstamm op Basis vun der T7-RNA-Polymerase, dee mat Expressiounsvektoren op Basis vum T7-Promoter kombinéiert gëtt an a Laboratoiren an an der Industrie vill fir d’Produktioun vu rekombinante Proteinne benotzt gëtt. Bei BL21(DE3) gëtt d’Expressioun vum Gen, dat fir dat rekombinant Protein kodéiert, vun der chromosomal kodéierter T7-RNA-Polymerase (T7 RNAP) transkribéiert, déi aachtmol méi séier transkribéiert wéi déi konventionell E. coli RNAP. Dat mécht de Stamm BL21(DE3) héich effizient an zu engem vun de beléiftsten Zellsystemer fir d’Proteinexpressioun.
Protokoll fir d’Ultraschalllyse an d’Proteinextraktioun aus BL21-Zellen
D’Zelllyse vu BL21-Zelle gëtt meeschtens mat Ultraschall a Kombinatioun mat Natriumlauroylsarcosinat (och als Sarkosyl bekannt) als Lysepuffer duerchgefouert. D’Virdeeler vum Zellopbroch a vun der Proteinextraktioun mat Ultraschall leien an der Zouverlässegkeet, der Reproduzéierbarkeet an an der einfacher, sécherer a séierer Bedéngung vun Ultraschallapparater. De follgende Protokoll beschreift Schrëtt fir Schrëtt d’Lyse vu BL21-Zelle mat Ultraschall:
- Fir d’Chaperonproteinnen ze entfernen, goufen d’BL21-Bakteriepellets a 50 ml äiskalem Natrium-Tris-EDTA-Puffer (STE) resuspendéiert (besteet aus 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, ergänzt mat 100 mM PMSF).
- Duerno ginn 500 ul Lysozym (10 mg/ ml) derbäigesat an d’Zelle gi fir 15 min op Äis inkubéiert.
- Uschléissend gi 500 ul DTT a 7 ml Sarkosyl (10% (w/v), a STE-Puffer ugesat) derbäigesat.
- Et ass essentiell, all Rengegungspuffer äiskal ze halen an d’Prouwe stänneg op Äis ze loossen. All Rengegungsschrëtt solle wa méiglech am Killraum duerchgefouert ginn.
- Fir d’Ultraschalllyse an d’Proteinextraktioun ginn d’Prouwen am VialTweeter MultiSample Ultrasonicator fir 4 x 30 sec bei 100% Amplitud mat engem Intervall vun 2 min tëscht den eenzelen Ultraschallbehandlunge behandelt. Alternativ kann en Ultraschallhomogenisator mat Sond a Mikrospëtzt, z. B. UP200Ht mat S26d2 (3 x 30 sec, 2 min. Paus tëscht den Ultraschallzyklen, 80% Amplitud), benotzt ginn.
- Fir weider Rengegungsschrëtt mussen d’Prouwen op Äis gehale ginn oder alternativ bis zur weiderer Veraarbechtung bei -80°C gelagert ginn.
Ultraschall-Zellopbrochapparat UP200St mat Mikrospëtzt S26d2 fir d’Lyse an d’Proteinextraktioun
Ultraschalllyse ënner preziser Temperaturkontroll
Eng prezis an zouverlässeg Temperaturkontroll ass beim Ëmgang mat biologesche Prouwe vun entscheedender Bedeitung. Héich Temperature léisen en thermesch bedéngten Ofbau vu Proteinnen an de Prouwen aus.
Wéi all mechanesch Methode fir d’Proufvirbereedung produzéiert och d’Ultraschallbehandlung Hëtzt. D’Temperatur vun de Prouwe léisst sech awer beim Asaz vum VialTweeter gutt kontrolléieren. Mir stellen Iech verschidde Méiglechkeete vir, fir d’Temperatur vun Äre Prouwen ze iwwerwaachen an ze kontrolléieren, wärend Dir se mam VialTweeter a mam VialPress fir d’Analys virbereet.
- Iwwerwaachung vun der Prouftemperatur: Den Ultraschallprozessor UP200St, deen de VialTweeter undreift, ass mat enger intelligenter Software an engem uschléissbaren Temperatursensor equipéiert. Schléisst den Temperatursensor un den UP200St un a setzt d’Spëtzt vum Temperatursensor an ee vun de Proufréiercher. Iwwer den digitale Faarf-Touchdisplay kënnt Dir am Menü vum UP200St e spezifeschen Temperaturberäich fir d’Ultraschallbehandlung vun Äre Prouwen astellen. Den Ultraschallapparat stoppt automatesch, wann déi maximal Temperatur erreecht ass, a pauséiert, bis d’Prouftemperatur op den ënneschte Wäert vum agestallten Temperaturberäich ∆ gefall ass. Duerno fänkt d’Ultraschallbehandlung automatesch erëm un. Dës intelligent Funktioun verhënnert den duerch Hëtzt verursaachten Ofbau.
- De VialTweeter-Block ka virgekillt ginn. Setzt de VialTweeter-Block (nëmmen d’Sonotrod ouni Schallwandler!) an de Frigo oder an den Tifküler, fir den Titanblock virzekillen. Dëst hëlleft, den Temperaturustig an der Prouf ze verzögeren. Wa méiglech, kann och d’Prouf selwer virgekillt ginn.
- Benotzt Dréchenäis fir d’Killung wärend der Ultraschallbehandlung. Benotzt eng flaach Schuel mat Dréchenäis a stellt de VialTweeter op d’Äis, fir datt d’Hëtzt séier ofgeleet ka ginn.
Clientë weltwäit benotzen de VialTweeter an de VialPress fir hir deeglech Proufvirbereedung a biologeschen, biocheemeschen, medezineschen a klinesche Laboratoiren. Mat der intelligenter Software an der Temperaturreegelung vum UP200St-Prozessor gëtt d’Temperatur zouverlässeg gereegelt an den duerch Hëtzt verursaachten Ofbau vun de Prouwe verhënnert. D’Ultraschall-Proufvirbereedung mam VialTweeter a mam VialPress liwwert héich zouverlässeg a reproduzéierbar Resultater!
Fannt den optimalen Ultraschall-Zellopschlossapparat fir Är Lyseapplikatioun
Hielscher Ultrasonics ass e Produzent mat laangjäreger Erfarung am Beräich vun héichleeschtungsfäegen Ultraschall-Zellopschlossapparater an Homogenisateure fir Laboratoiren, Dëschsystemer an Anlagen am industrielle Moossstaf. D’Gréisst vun Ärer Bakterienzellkultur, Äert Fuerschungs- oder Produktiounszil an de Volume vun den Zellen, déi pro Stonn oder Dag verschafft solle ginn, si wesentlech Facteuren, fir de richtegen Ultraschall-Zellopschlossapparat fir Är Applikatioun ze fannen.
Hielscher Ultrasonics bitt verschidde Léisunge fir déi gläichzäiteg Ultraschallbehandlung vu méi Prouwen (bis zu 10 Prouffläsch mam VialTweeter) a vu grousse Proufzuelen (d. h. Mikrotiterplacken / ELISA-Placke mam UIP400MTP), souwéi de klassesche Labor-Ultraschallapparat mat Sond a verschiddene Leeschtungsstufe vu 50 bis 400 Watt bis hin zu vollindustriellen Ultraschallprozessore mat bis zu 16.000 Watt pro Eenheet fir de kommerziellen Zellopschloss an d’Proteinextraktioun an der Groussproduktioun. All Ultraschallapparater vun Hielscher si fir den 24/7/365-Betrib ënner Volllaascht gebaut. Robustheet an Zouverlässegkeet si Kärcharakteristike vun eisen Ultraschallapparater.
All digital Ultraschallhomogenisateure si mat intelligenter Software, engem Faarf-Touchdisplay an enger automatescher Dateprotokolléierung equipéiert, déi den Ultraschallapparat zu engem prakteschen Aarbechtsinstrument am Labo an a Produktiounsanlage maachen.
Deelt eis mat, wéi eng Zort Zellen, wéi ee Volume, wéi dacks a mat wéi engem Zil Dir Är biologesch Prouwe verschaffe musst. Mir recommandéieren Iech den Ultraschall-Zellopschlossapparat, deen am beschte fir Är Prozessufuerderunge gëeegent ass.
Déi folgend Tabell gëtt Iech en Iwwerbléck iwwer déi ongeféier Veraarbechtungskapazitéit vun eisen Ultraschallsystemer, vu kompakten Handhomogenisateuren an Ultraschallapparater fir méi Prouwen bis hin zu industriellen Ultraschallprozessoren fir kommerziell Applikatiounen:
| Chargevolume | Duerchfloss | Recommandéiert Apparater |
|---|---|---|
| Placke mat 96 Verdéiwungen / Mikrotiterplacken | n.a. | UIP400MTP |
| 10 Prouffläsch mat jee 0,5 bis 1,5mL | n.a. | VialTweeter um UP200St |
| 0,01 bis 250mL | 5 bis 100mL/min | UP50H |
| 0,01 bis 500mL | 10 bis 200mL/min | UP100H |
| 10 bis 2000mL | 20 bis 400mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0,1 bis 20L | 0,2 bis 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 bis 100L | 2 bis 10L/min | UIP4000hdT |
| n.a. | 10 bis 100L/min | UIP16000 |
| n.a. | méi héich | Verbund vun UIP16000 |
Kontaktéiert eis! / Frot eis!
UIP400MTP Placken-Ultraschallapparat fir den Zellopschloss mat héijem Prouwenduerchsaz a Placke mat 96 Verdéiwungen
Ultraschallapparat UP200Ht mat 2mm Mikrospëtzt S26d2 fir d’Ultraschallbehandlung vu klenge Prouwen
Liest méi doriwwer, wéi Dir Ären Ultraschall-Geweebenhomogenisator fir déi effizient an zouverlässeg Virbereedung vu Pufferléisunge benotze kënnt!
Wëssenswäert Fakten
Escherichia-coli-Bakterien
Escherichia coli ass eng Bakterienaart, déi keng Spore bilt, gramnegativ ass a sech duerch hir Form vun engem riichte Stiefchen auszeechent. E.coli-Bakterie kommen an der Ëmwelt, a Liewensmëttel an am Daarm vu Mënschen an Déiere vir. E. coli ass normalerweis mat Hëllef vu peritriche Flagelle beweeglech, mee et ginn och onbeweeglech Aarten. E.coli si sougenannt fakultativ anaerob chemoorganotroph Organismen, dat heescht, datt si souwuel zu engem respiratoresche wéi och zu engem fermentative Stoffwiessel fäeg sinn. Déi meescht E.coli-Aarte sinn harmlos an erfëllen nëtzlech Funktiounen am Kierper, z. B. de Wuesstem vu schiedleche Bakterienaarten ënnerdrécken, Vitamme synthetiséieren asw.
Escherichia-coli-Bakterienzelle vum sougenannte B-Typ sinn eng speziell Kategorie vun E.coli-Stämm, déi an der Fuerschung wäit verbreet agesat ginn, fir Mechanisme wéi d’Empfindlechkeet géintiwwer Bakteriophagen oder Restriktiouns-Modifikatiounssystemer z’ënnersichen. Ausserdeem ginn E.coli-Bakterien als zouverlässeg Aarbechtsorganisme fir d’Proteinexpressioun a Laboratoirë vun der Biotechnologie an de Liewenswëssenschafte geschat. Zum Beispill ginn E.coli benotzt, fir Verbindunge wéi Proteinnen an Oligosacchariden am industrielle Moossstaf ze synthetiséieren. Wéinst spezifeschen Eegenschafte wéi engem Manktem u Proteasen, enger gerénger Acetatproduktioun bei engem héije Glukosniveau an enger erhéichter Permeabilitéit sinn E. coli B-Zellen déi am heefegste benotzt Wiertszelle fir d’Produktioun vu gentechnesch hiergestallte Proteinnen.
Rekombinant Protein
Rekombinant Proteinnen (rProt) gewannen a ville Branchen däitlech u Bedeitung, ënner anerem an der cheemescher Produktioun, der Pharmaindustrie, der Kosmetikindustrie, der Human- a Veterinärmedezin, der Landwirtschaft, der Liewensmëttelindustrie an der Offallbehandlung.
D’Produktioun vu rekombinantem Protein erfuerdert den Asaz vun engem Expressiounssystem. Als expriméierend Zellsystemer fir d’Produktioun vu rekombinanter DNA kënne souwuel prokaryotesch wéi och eukaryotesch Zelle benotzt ginn. Wärend Bakterienzelle wéinst Facteure wéi niddrege Käschten, einfacher Skaléierbarkeet an einfache Bedéngunge fir d’Kulturmedien am heefegste fir d’Proteinexpressioun benotzt ginn, si Systemer mat Mamendéierenzellen, Hiefen, Algen an Insektenzellen souwéi zellfräi Systemer etabléiert Alternativen. De Proteintyp, d’funktionell Aktivitéit an déi erfuerderlech Ausbeut un expriméiertem Protein beaflossen d’Auswiel vum Zellsystem, dee fir d’Proteinexpressioun benotzt gëtt.
Fir rekombinant Protein ze expriméieren, muss eng bestëmmt Zell mat engem DNA-Vektor transfizéiert ginn, deen d’Virlag vun der rekombinanter DNA enthält. D’Zellen, déi mat der Virlag transfizéiert goufen, ginn duerno kultivéiert. Als Folleg vum zelluläre Mechanismus transkribéieren an iwwersetzen d’Zellen dat gewënscht Protein a produzéieren domat dat ugestrieft Protein.
Well déi expriméiert Proteinnen an der zellulärer Matrix agespaart sinn, muss d’Zell lyséiert (opgeschloss an opgebrach) ginn, fir d’Proteinne fräizesetzen. An engem uschléissende Rengegungsschrëtt gëtt de Protein ofgetrennt a gerengegt.
Dat éischt rekombinant Protein, dat fir eng Behandlung agesat gouf, war rekombinant mënschlecht Insulin am Joer 1982. Haut gi weltwäit méi wéi 170 Aarte vu rekombinantem Protein fir medezinesch Behandlungen hiergestallt. Rekombinant Proteinnen, déi dacks an der Medezin agesat ginn, sinn zum Beispill rekombinant Hormonen, Interferonen, Interleukinnen, Wuesstemsfacteuren, Tumornekrosfacteuren, Bluttgerënnungsfacteuren, thrombolytesch Medikamenter an Enzyme fir d’Behandlung vu schwéiere Krankheete wéi Diabetis, Zwergwuess, Häerzinfarkt, kongestiv Häerzinsuffizienz, Schlagufall, multipel Skleros, Neutropenie, Thrombozytopenie, Anämie, Hepatitis, rheumatoider Arthritis, Asthma, Morbus Crohn a fir Kriibstherapien. (cf. Phuc V. Pham, in Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)
Literatur / Referenzen
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
VialTweeter-Sonikator fir déi gläichzäiteg Beschallung vun 10 Prouwen, z. B. fir BL21-Zellen opzeschléissen
Héichleeschtungsultraschall! D’Produktpalette vun Hielscher deckt de ganze Spektrum of, vum kompakten Ultraschallapparat fir de Labo iwwer Dëschapparater bis zu vollindustriellen Ultraschallsystemer.