Ultraschall Protein Extrait aus Tissue a Zellkulturen
- Protein Extraktioun ass e wesentlecht Virbereedungspréifung fir Proteomik.
- Proteine kënnen aus Planz an Déierewëssenschaft, Hefen a Mikroorganismen extrahiert ginn.
- Sonication ass eng verlässlech, efficace Protein Extraktioun Methode déi e groussen Protein Ausbezuele an enger Kuerzextraktioun gëtt.
Protein Extraktioun aus Stoffer an Zellen
Protein Extraktioun aus Stoffer a kultivéierten Zellen ass e wesentleche Probepräparatiounsschrëtt dee wärend ville biochemeschen an analyteschen Techniken ausgefouert gëtt wéi ELISA, PAGE, Western Blotting, Massespektrometrie oder Proteinreinigung. Ultrasonic Zell Stéierungen, Lysis an Extraktioun ass eng präzis kontrolléierbar, net-thermesch Technik fir héich Ausbezuele vu Proteinen ze garantéieren.
Protein Extraktioun aus Zellen mat der Ultraschallsonde UP200St
- Rapid
- héich Resultat
- héich Effizienz
- Präzise Kontroll vun Parameteren
- Reproducible Resultater
- Linear Skaléierbarkeet
Allgemeng Instruktioune Fir Ultraschall Lysis a Protein Extraktioun
- Temperaturregelung: Fir e gudden Protein Ausbezuelen ouni thermesche Denaturatioun ze garantéieren, muss d'Temperatur bei der Extraktioun kontrolléiert ginn. Hielscher's State-of-Art Ultraschallhomogenisatoren – och genannt Ultraschall Desintegrator oder Ultraschall – sinn genee kontrolléiert. Si kommen mat engem Stecktemperatur-Sensor. An de Parameteren vum Ultraschall Homogenisateur kann e maximal Temperatur sinn. Wann dës Temperatur maximal erreecht gëtt, hält den Ultraschall automatesch op, bis d'Probe geklomm ass.
- Buffer: D'Wiel vun engem passende Puffer an de richtege Volumen vu Puffer hänkt vun Gewier u Gewëss aus a muss aus Versuch-a-Fehler-Tester erausfuerderen.
- Isolatioun / Puren: Proteins Lysate kënnen e Plus vun Biomolekülen wéi DNA oder Kuelegen, déi duerch Protein-Ausfällung (Deoxycholat-Trichloressigsäure) oder Pufferaustausch beseechen kann enthale sinn.
Chittapalo an Noomhorm (2009) hunn an hirer Studie gemellt datt d'Protein Ausbezuelung mat Hëllef vun Sonikatioun erhéicht gëtt an datt d'Ultraschallgewebe Homogeniséierung a Lysisprozess existéierend Extraktiounsprozesser wesentlech verbesseren kann – fir nei kommerziell Ausnahmegesetzer z'erhéijen.
Ultraschall CupHorn fir déi gläichzäiteg, héich efficace Probe virbereet vu multiple Proben ënner selweschten Konditioune fir Proteinisolatioun an DNA Fragmentatioun.
Protein Extraktioun vum Déierewëss
Fir d'Virbereedung vu ganzer Gréisst Tissue (z. B. Nier, Häerz, Lung, Muskel etc.), soll den Tissu a ganz klenge Stécker mat propperem Tools dissektéiert ginn, op Äis am léifsten, a sou séier wéi méiglech fir Degradatioun duerch Proteasien ze verhënneren (z. B. lysisbuffer wéi RIPA oder hypotonesche Lysisbuffer mat Protease a Phosphatase-Inhibitor Cocktail). Nom dissektéieren ass d'Probe mat flëssege Stickstoff fir Schnappfrost gedompelt. D'Prouf kann op -80 ° C fir spéider Benotzung gelagert ginn oder op Äis fir direkt Homogeniséierung opgespaart ginn. Direkt virun der Ultrasonic Extraktioun gëtt d'Äis kale Lysis-Puffer (mat Protease-Inhibitoren DTT, Leupeptin an Aprotinin) séier an de Probe-Röhre hinzugefügt (pro ~ 10 mg Tissu ongeféier ~ 600 μL Puffer gëtt empfohlen). Ongeféier. 20-60 mg Tissu ass pro Probe-Röhre empfohlen.
Ultraschall Homogeniséierung, Lysis an Extraktioun gëtt mat engem Ultraschallhomogenisator wéi den UP100H oder UP200Ht ausgeführt, mat enger Mikro-Tipp Sonotrode ausgestatt. Sonication Dauer ass 60-90 Sekonnen. bei engem Ultraschallzyklusmodus vu 15 Sekonnen. sonication an 10 sec. Rou Zäit. D'Probe soll déi ganzen Zäit am Äis gehal ginn.
No Ultraschallhomogenisatioun / Extrait ass de Lysat bei ongeféier 27.000 g zentrifugéiert. 20 min. Duerno gëtt de Supernatent gesammelt, sou datt d'Proteinkonzentratioun vu engem Protein Assay bezeechent gëtt wéi Pierce Protein Assay BCA.
Protein Extraktioun vu Bluttserum
Fir eng homogen Mëschung aus dem Serum an dem Phosphatbuffer gëtt d'Probe fir d'éischt virum Ultraschall-Zell-Lysis geworf. Fir d'Ultraschalllysis gëtt d'Probe mat engem Ultraschall Labo Homogenisator wéi den UP100H fir 8 Zyklen bei 20% Amplitude sonicéiert, fir Zyklen vun all 5 Sekonnen op a 15 Sekonnen aus. Protein Extraktioun gëtt duerch Sonikatioun an Zyklen duerchgefouert (Pulsatiounsmodus) an andeems d'Probe op Äis plazéiert ass, sou datt eng Iwwerhëtzung an thermesch Degradatioun vun der Probe vermeit gëtt. Zënter Serum enthält eng grouss Quantitéit u Proteinen mat héichmolekulare Gewiicht (wéi Albumin, α1-Antitrypsin, Transferrin, Haptoglobulin, Immunoglobulin G an Immunoglobulin A), déi d'Trennung vun nidderegmolekulare Proteinen während IEF stéieren, ass et recommandéiert se ofzeschafen. aus dem Serum mat enger Depletiounskolonn.
Protein Extraktioun aus Planzenzell
Frësche, mëllen Planzewelt, zB Moos etc., kënne ganz einfach gestéiert ginn andeems d'gutt gehackte Probe-Material an d'Lysis-Puffer fir d'Sonikéierung plazéiert gëtt. Hefteg, ligenös Planzewebe, wéi Somen, Spuere Nadelen asw. Sollten dréche geroden. E puer schwéier, hëlzent Planzmaterialien musse gefruer ginn a flëssegem Stéckstoff ginn ier se duerch d'Sonikatioun erausgeholl ginn. Fir Planzzellkultursuspensiounen ass eng Ultraschallbehandlung tëscht 30 an 150 Sekonnen an engem Lysisbuffer meeschtens genuch. Méi schwéier Material wéi Kürbiskerne brauchen eng méi intensiv Sonikatioun wéi hei ënnendrënner beschriwwe ginn.
Protokoll zur Ultraschallerwerung vun Albumin aus Kürbissablack
Fir d'Ultraschall-Protein-Extraktioun vun Albumin aus feingemuelten Kürbiskernepulver, 10 g offetteg Kürbiskernepulver an 100 mL deioniséiertem Waasser als Léisungsmëttel ginn an engem 250mL Glasbecher dobäigesat. D'Protein Extraktioun besteet aus zwee Schrëtt: Als éischt gëtt d'Probe sonicated mat engem Sonde-Typ Ultrasonicator UP400St (400W, 24kHz) equipéiert mat sonotrode S24d7. De Glasbecher gëtt an engem kale Waasserbad während der Ultraschallhomogeniséierung gesat. De pluggable Temperatursensor an d'Temperaturkontrollastellunge vum Ultraschall UP400St suergen datt d'Probetemperatur ëmmer ënner 30 ° C gehale gëtt. Duerch déi präzis Temperaturkontroll während der Sonikatioun gëtt eng Denaturatioun vum Albumin vermeit. Zweetens gouf d'Extraktioun mat engem Mischer bei 200 U/min Geschwindegkeet a bei 30 ° C duerchgefouert. Duerno gëtt de Becher an en thermostatesche Shaker transferéiert. Globulin gëtt iwwer Dialyse mat destilléiert Waasser ewechgeholl. No der Entfernung vum Globulin kann de Proteinextrakt getest ginn fir den Albuminprofil ze bestëmmen a gëtt duerno op pI = 3.0 ugepasst mat 0,1 M HCl fir Albuminkoagulatioun. Déi zolidd Phase gëtt duerch Zentrifugéierung bei 5000g, 20°C getrennt an an deioniséiertem Waasser nei opgeléist. Albumin Koagulatioun gëtt zweemol duerchgefouert fir de Proteinverhältnis am Albuminkonzentrat ze erhéijen.
D'Ultraschall-Alkoholprotein-Extraktioun fir d'Virbereedung vum Proteinkonzentraten aus der Reisbran ass datt d'Ultraschallbehandlung zu méi héijen Protein Ausbeuten an enger deutlech méi kierter Extraktiounzäit – am Verglach mat konventionell Extramethoden.
Probe Préparat Probe fir funktionell iNOS Enzym
Fir voll funktionell iNOS Enzym ze kréien (zB fir Drogenscreening), gëtt de folgende Protokoll recommandéiert: D'Zellsuspension soll op Äis plazéiert ginn a gëtt mat engem UP100H bei 10µm Amplitude am Zyklusmodus vu 5 Sekonnen sonikéiert. sonication an 25 sec. raschten op Äis. D'Prozedur soll widderholl ginn ca. 3 Kéieren. D'Reschtzäit tëscht Sonikatiounszyklen reduzéiert d'Temperaturerhéijung a reduzéiert dofir de Risiko vun der Denaturatioun.
Ultraschall Protein Solubilatioun
Sonication kann den Protein Solubilisatiounsprozess beschleunigen, wat normalerweis e puer Stonnen erfordert. Fir d'Préparatioun vun der Probe ze verhënneren a Proteinabbau a Modifikatioune bei der Léisung vu Harnstoff ze verhënneren, däerfe d'Ultraschallspur nët méi laang sinn wéi e puer Sekonnen.
Ultrasonicator UP200Ht mat 2mm Microtip S26d2 fir d'Sonication vu klenge Proben.
Ultraschall Ausrüstung fir Protein Extraktioun
Hielscher Ultrasonics biedt eng breet Palette vun Ultraschallhomogeniseren fir d'Zerfall vun Zellen, Gewëss, Bakterien, Mikroorganismen, Hefegen an Spore.
Hielscher Labo Ultraschaller si mächteg an einfach ze bedreiwen. Gebaut fir 24/7 Operatioun, si sinn als robust an effizient Labo- a Bench-Top Apparater entworf. Fir all Apparater kënnen d'Energieausgang an d'Amplitude präzis kontrolléiert ginn. Déi breet Palette vun Accessoiren mécht weider Setupoptiounen op. Déi digital Ultraschaller wéi de VialTweeter, UP200Ht, UP200St, an UP400St hunn eng integréiert Temperaturkontroll an eng agebaute SD Kaart fir automatesch Datenopnam.
Fir déi indirekt, Kräizkontaminatiounsfräi a gläichzäiteg Sonikatioun vu verschidde Proben, bidde mir de VialTweeter oder den Ultraschall CupHorn.
D'Tabell hei drënner gëtt Iech en Iwwerbléck iwwer eis Ultraschaller fir Probepräparatioun, Zellstéierung an Extraktioun. Klickt op den Apparattyp fir méi Informatioun iwwer all Ultraschallhomogenisator ze kréien. Eis gutt ausgebilte a laangjäreg Erfahrungen technesche Personal wäerte frou Iech ze hëllefen de gëeegentste Ultraschall fir Är Probe Virbereedung ze wielen!
| Konte gefouert QShortcut | Duerchflossrate | recommandéiert Comments |
|---|---|---|
| bis zu 10 Fläschen oder Réier | na | VialTweeter |
| multiwell / microtiter Placke | na | UIP400MTP |
| multiple Réier / Schëffer | na | Cuphorn |
| 1 bis 500mL | 10 bis 200mL / min | UP100H |
| 10 bis 1000 ml | 20 bis 200 ml/min | UP200Ht, An UP200St |
| 10 bis 2000mL | 20 bis 400mL / min | UP400St |
Ofhängeg vun Ärer Applikatioun, Material a vun de Volume Band, proposéiere mir Iech déi besser konfiguréiert Setup fir Äre Préavispräpung. Kontaktéiert eis haut!
Kontaktéiert eis! / Frot eis!
Hielscher Digital Ultrasonicators hunn eng Browser Fernsteierung an automatesch Dateprotokolléierung op enger integréierter SD-Kaart.
VialTweeter indirekt Akkumulation.
Fakten Wësse wat weess
Proteomics
Proteomics ass de Fuerschungsfeld, deen Proteinen un Proteom huet. Proteinen fullfil eng rieseg Array vu Vitalfunktiounen am Organismen. De Proteom ass den ganzen Satz vun Proteinen, ausgedréckt vu Genom, Zell, Gewëss oder Organismus zu enger Zäit. De Proteom schwätzt mat Zäit a verschidde Besoinen, oder betount, datt eng Zell oder Organismus erfuerscht. Méi spezifesch ass et den Satz vun Expriméiert Proteinen an enger bestëmmter Zell oder Organismus, zu enger Zäit, ënner definéierte Bedingungen. De Begrëff ass eng Mëschung vu Proteinen an Genomen. Proteomik ass d'Studie vum Proteom.
Protein
Proteine si grouss Biomolekele, sougenannte Makromolekülen – déi aus enger oder méi laang Ketten vun Aminosäurereschterstécker besteet. Proteine sinn an all Organismen vu vegetareschen a Déiereschaffen an si sinn entscheedend fir déi meescht vun den biologesche Funktiounen. Well Proteinen vill biologesch Informatiounen enthale sinn, ginn se fir analytesch Zwecker extraktéiert, zB fir proteomesch Recherche. Déi wichtegst Funktioun vun Proteinen besteet aus der Katalyse vu metabolesche Reaktiounen, der DNA-Replikatioun, der Reaktioun op Reizen, an dem Transport vun de Molekülen aus engem Standuert op en aneren. Proteinen ënnerscheeden sech virun allem an hirer Sequenz vun Aminosäuren, déi duerch d'Nukleotidsequenz vun hiren Genen diktéiert gëtt, an déi normalerweis e Protokoll fëllen an eng spezifesch dreidimensionaler Struktur, déi seng Aktivitéit bestëmmt. Proteinen sinn – ausser Peptiden – Ee vun de wichtegste Komponente vun der Iessen. D'Proteomik ass also e staarkt Instrument fir d'Liewenswëssenschaft fir Prozesse, Liewensmëttelsécherheet an Ernährungsbeurteilung optiméieren.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction ass eng pre-analytesch Prozedur fir Analyten ze trennen a pre-konzentréieren. A Kombinatioun mat Ultraschall kann d'Wollekpunktextraktioun verstäerkt ginn, fir de Prozess méi effizient, méi séier an ëmweltfrëndlech ze maachen. Mat Ultrasonicatioun ass d'Wollekpunktextraktioun eng wesentlech méi effizient Method fir Analytpräparatioun. Liest méi iwwer Ultraschall assistéiert Cloud Point Extraktioun!Gel Electrophoresis
Gel Elektrophorese ass d'Haaptmetall fir d'Trennung an Analyse vu Makromoleküle wéi DNA, RNA a Proteine wéi och hir Fragmenter, baséiert op hir Gréisst a Frachnung. Et gëtt an der klinescher Chemie benotzt fir Proteine ze trennen fir d'Ladung a / oder d'Gréisst (IEF Agarose, am wesentleche Gréisst unabhänglech) an an der Biochemie, Molekularbiologie a Proteomik fir eng gemëscht Populatioun vun DNA- a RNA-Fragmenter ze trennen, fir d'Gréisst vun der DNA ze schätzen a RNA-Fragmenter oder fir Proteine ze trennen.
Zell Kulturen
D'Zellkultur ass de kontrolléierten ëmmer méi wëssenschaftleche Prozess, duerch deen Zellen ënner kontrolléierte Konditioune cultivéiert ginn. Zellkulturbedingunge variéieren fir all Zortyp. Am Allgemengen ass d'Ëmwelt vun enger Zellkultur aus engem passenden Schouss (z. B. Petri) mat Substrat oder Medium, deen d'essentielle Nährstoffer ubelaangt (Aminosäuren, Kachbuden, Vitamine, Mineralstoffer), Wuestum Faktoren, Hormonen a Gasen (CO2, O2) a regelt d'physio-chemesch Emwelt (pH-Puffer, osmotesch Drock, Temperatur). Déi meescht Zellen brauchen eng Uewerfläch oder e künstleche Substrat, während aner Zellkulturen fräi am Kulturmedium fräi kënne ginn (Suspensionskultur, Zellsuspension).
Mass Kulturen vun Déierenzelllinen ginn an der Industrieproduktioun vu viralen Impfstécker an aner biotechnologësch Produkter benotzt. Mënschliche Stammzellen ginn agefouert fir d'Zuel vun Zellen auszublänzen an d'Zellen a verschidden Zommatzzorten fir Transplantatiounszwecker ze differenzéieren.
Tissue-Beispiller
De Begrëff Tissue beschreift en zellularen Zwëschenprodukt, wou d'Zellmaterial op enger organisatorescher Basis tëscht Zellen a engem komplett Uergel läit. Am Tissu, ähnlech Zellen, aus dem selwechte Urspronk, déi zesummen eng spezifesch Funktion maachen, agefouert ginn. Duerch déi funktionell Gruppéierung vu multiple Gewëss sinn déi komplex Strukturen vun den Organer geformt ginn.
Tissue gëtt gepréift fir Fuerschung an der Biologie, Histologie / Histopathologie, Parasitologie, Biochemie, Immunohistochemie wéi och fir DNA ze kultivéieren an auszewéckelen. Et kann tëscht Déieren (Ënnerdeelung: Mammegewebe) a Planzewebe ënnerscheet ginn. Déieren Tissuë ginn an déi véier Basis Aarte vu Bindegewierer, Muskelen, Nerven an Epithelgewebe gruppéiert. Planzewebe gëtt an de folgenden dräi Tissesystemer ënnerdeelt: d'Epidermis, de Buedemweb, an de vaskuläre Tissu.
Tissueproblemer kënnen aus Tier- oder Pflanzenteilen preparéiert ginn, z. B. Knuewel, Muskel, Blieder, etc.
Kierzelen
Blutt, Serum, Plasma, Cerebrospinal Flëss, Sphär a Synovialflëssegkeet sinn Kierstlechflëssegkeeten, déi eng grouss Quell vun diagnostesch relevanten Informatioune bidden. Dofir ass eng raffinéiert Preparatioun vu Kierperféierungsproblemer fir Analyse wichteg. Déi éischt Schwieregkeet ass mat der breeder dynamescher Distanz vu Komponenten ass an der Kierperfluid ass.
Bestëmmung vu Protein Konzentratioun
Bradford ass Assay, Lowry Assay a Bicinchoninsäure (BCA) assay normal Assays, fir d'Konzentratioun vu Proteinen ze bestëmmen. Bovine Serum Albumin (BSA) ass ee vun den heefegsten gebrauchten Proteinstandard.
Lysis Buffer
Lysis-Puffer muss aus dem Zellmaterial oder Gewëss gewise ginn (Gewësskultur, Planz, Bakterien, Pilze, etc.), an ob d'Zellen an enger Struktur an der Struktur stinn. Eng breet Palette vun Lyphis-Puffer fir d'Extrait vun Proteinen, Membranen a Orgel a formuléiert mat engem oder méi vereinfacht. Den Detergent gëtt normalerweis iwwer Test- a Fehler-Tester gewielt – wann et ze verfügbar – no engem existent Protein Extrait Protokoll. Den Detergent muss kompatibel sinn mat der Gewiererquelle an de Proteinen. Am allgemengen ass de mëlleste Sphär, deen fir e spezifeschen Gewebe / Protein funktionéiert, gewielt fir d'maximal Funktioun vum Extrakt ze erhalen. En plus, am Fall vun enger Extraktioun vu Membranen an Organellen, hält e mëttlere Sphuelm d'Membran intakt. Allgemeng gebraucht Wäschmëttelen an Lysepuffern sinn mexikanesch oder zwitterionesch, zB CHAPS, Deoxycholat, Triton ™ X-100, NP40 a Tween 20.
Zum Beispill kënnen Tissue wéi Gehir, Liewer, Dessert, Niere, Milet etc. och einfach mat PIPA gepufferte ginn. – awer Protease-Inhibitoren an DTT (zB bei Gelelektrophorese) sollen agebaut ginn.
Lysis-Puffer fir Skelett Muskelgewebe (eis kale): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl 2, Triton X-100, 10% G / , 1 mM Dithiothreitol ergänzt mat Protease- an Phosphatase-Inhibitor-Cocktail
Table of gemeinsam Puffer an hirem pH-Bereich. Allgemeng sinn dës Puffer normalerweis zu Konzentratioune vu 20-50 mM benotzt.
| Buffer | pH-Streck |
|---|---|
| Zitrouneseier – NaOH | 2.2 – 6.5 |
| Sodiumcitrat – Zitrouneseier | 3.0 – 6.2 |
| Natriumacetat – Essigsäure | 3.6 – 5,6 |
| Cacodylsäure Natriumsalz – HCl | 5.0 – 7.4 |
| MES – NaOH | 5,6 – 6.8 |
| Natrium-Dihydrogenphosphat – Dinatriumwasserstoffphosphat | 5.8 – 8.0 |
| Imidazole – HCl | 6.2 – 7.8 |
| MOPS – KOH | 6.6 – 7.8 |
| Triethanolamin Hydrochlorid – NaOH | 6.8 – 8.8 |
| Tris – HCl | 7.0 – 9.0 |
| HEPES – NaOH | 7.2 – 8.2 |
| Tricine – NaOH | 7,6 – 8.6 |
| Sodiumtetraborat – Borsäure | 7,6 – 9.2 |
| Bicine – NaOH | 7.7 – 8.9 |
| Glycin – NaOH | 8.6 – 10,6 |
Déi meescht Puffer verlaangen eng pH-Ofhängegkeet mat der Temperatur. Dëst gëllt speziell fir Tris Buffer. De pKa changéiert vun 8,06 op 25 ° C bis 8.85 um 0 ° C.
(pH a pKa vun engem Puffer: pH misst d'Konzentratioun vu Waasserstoff an enger wässrer Léisung behalen. pKa (= Disserdossierung konstant) ass eng relancéiert, awer méi spezifesch Mass, datt et hëlleft fir ze prognéiren wéi e Molekiil op eng spezifesch pH value.)
TRIzol
TRIzol ass eng chemesch Léisung déi benotzt gëtt fir RNA / DNA / Protein bei der Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform Extraktioun auszerechnen. D'Verwäertung vun der Ultraschall assistéiert TRIzol-Austraktioun ergëtt eng grouss DNA, RNA a Protein vu der selwechter Probe erauszefannen an excels domat aner Extramethoden.
Literatur / nëmmen
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.