Ultraschall Protein Extraktioun aus Tissue an Zell Kulturen
- Protein Extraktioun ass e wesentleche Probepräparatiounsschrëtt an der Proteomik.
- Proteine kënnen aus Planz- an Déieregewebe, Hefen a Mikroorganismen extrahéiert ginn.
- Sonication ass eng zouverlässeg, effizient Proteinextraktiounsmethod déi héich Proteinausgaben bannent enger kuerzer Extraktiounszäit gëtt.
Protein Extraktioun aus Tissues an Zellen
Protein Extraktioun aus Stoffer a kultivéierten Zellen ass e wesentleche Probepräparatiounsschrëtt dee wärend ville biochemeschen an analyteschen Techniken ausgefouert gëtt wéi ELISA, PAGE, Western Blotting, Massespektrometrie oder Proteinreinigung. Ultrasonic Zell Stéierungen, Lysis an Extraktioun ass eng präzis kontrolléierbar, net-thermesch Technik fir héich Ausbezuele vu Proteinen ze garantéieren.
Protein Extraktioun aus Zellen mat der Ultraschallsonde UP200St
- Schnell
- héich Ausbezuelen
- Héich Effizienz
- Präzis Kontroll iwwer Parameteren
- reproducible Resultater
- linear Skalierbarkeet
Allgemeng Instruktioune Fir Ultraschall Lysis a Protein Extraktioun
- Temperatur Kontroll: Fir eng héich Proteinausbezuelung ouni thermesch Denaturatioun ze garantéieren, muss d'Temperatur während der Extraktioun kontrolléiert ginn. Hielscher's modernste Ultraschallhomogenisatoren – och genannt Ultraschall Desintegrator oder Ultraschall – si genee kontrolléierbar. Si kommen mat engem plugable Temperatursensor. An den Astellungsoptioune vum Ultraschallhomogenisator kann eng maximal Temperatur gesat ginn. Wann dës Temperatur Max erreecht ass, stoppt den Ultraschall automatesch bis d'Probe ofgekillt ass.
- Buffer: D'Wiel vun engem passenden Puffer an de richtege Puffervolumen variéiert vun Tissu zu Tissu a muss duerch Test-a-Fehler Tester erausfonnt ginn.
- Isolatioun / Reinigung: Proteinlysate kënnen en Iwwerschoss vu Biomoleküle wéi DNA oder Kuelenhydrater enthalen, déi duerch Proteinnidderschlag (Deoxycholat-Trichloracetic Seier) oder Pufferaustausch geläscht kënne ginn.
Chittapalo an Noomhorm (2009) hunn an hirer Studie gemellt datt d'Protein Ausbezuele mat Hëllef vun der Sonikatioun eropgeet an datt d'Ultraschallgewebe Homogeniséierung a Lysisprozess existéierend Extraktiounsprozesser wesentlech verbesseren kann – déi nei kommerziell Extraktiounsméiglechkeeten erméiglechen.
Ultraschall CupHorn fir déi gläichzäiteg, héich efficace Probe virbereet vu multiple Proben ënner selweschten Konditioune fir Proteinisolatioun an DNA Fragmentatioun.
Protein Extraktioun aus Déier Tissue
Fir d'Virbereedung vu ganz grousser Tissu (zB Nier, Häerz, Lunge, Muskel asw.), soll de Tissu a ganz kleng Stécker mat propperem Tools, am léifsten op Äis, a sou séier wéi méiglech opgedeelt ginn, fir d'Degradatioun duerch Proteasen ze verhënneren (zB. Lysis-Puffer wéi RIPA oder hypotonesche Lysis-Puffer mat Protease a Phosphatase-Inhibitor Cocktail). No der Dissektioun gëtt d'Probe a flëssege Stickstoff taucht fir d'Snapafréiere. D'Probe kann bei -80 ° C fir spéider Benotzung gespäichert ginn oder op Äis gelagert ginn fir direkt Homogeniséierung. Direkt virun der Ultraschallextraktioun gëtt äiskale Lysis-Puffer (mat Protease-Inhibitoren DTT, Leupeptin an Aprotinin) séier an d'Proberouer bäigefüügt (pro ~ 10 mg Tissue ongeféier ~ 600 μL Puffer si recommandéiert). ca. 20-60mg Tissue gëtt pro Proberöhre recommandéiert.
Ultraschall Homogeniséierung, Lysis an Extraktioun gëtt mat engem Ultraschallhomogenisator wéi den UP100H oder UP200Ht ausgeführt, mat enger Mikro-Tipp Sonotrode ausgestatt. Sonication Dauer ass 60-90 Sekonnen. bei engem Ultraschallzyklusmodus vu 15 Sekonnen. sonication an 10 sec. Rou Zäit. D'Probe soll déi ganzen Zäit am Äis gehal ginn.
No der Ultraschallhomogeniséierung / Extraktioun gëtt de Lysat bei 27.000g fir ca. 20 min. Duerno gëtt de Supernatant gesammelt, sou datt d'Proteinkonzentratioun duerch e Proteinassay wéi Pierce Protein Assay BCA bestëmmt ka ginn.
Protein Extraktioun aus Blutt Serum
Fir eng homogen Mëschung aus dem Serum an dem Phosphatbuffer gëtt d'Probe fir d'éischt virum Ultraschall-Zell-Lysis geworf. Fir d'Ultraschall-Lysis gëtt d'Probe mat engem Ultraschall-Laborhomogenisator wéi den UP100H fir 8 Zyklen bei 20% Amplitude sonicéiert, fir Zyklen vun all 5 Sekonnen op a 15 Sekonnen aus. Protein Extraktioun gëtt duerch Sonikatioun an Zyklen (Pulsatiounsmodus) duerchgefouert an duerch d'Plaz vun der Probe op Äis, sou datt eng Iwwerhëtzung an thermesch Degradatioun vun der Probe vermeit gëtt. Zënter Serum enthält eng grouss Quantitéit u Proteinen mat héije Molekulare Gewiicht (wéi Albumin, α1-Antitrypsin, Transferrin, Haptoglobulin, Immunoglobulin G an Immunoglobulin A), déi d'Trennung vun nidderegmolekulare Proteinen während IEF stéieren, ass et recommandéiert se ofzeschafen. aus dem Serum mat enger Depletiounskolonn.
Protein Extraktioun aus Planz Tissue
Frësch, mëll Planzgewebe, zB Moos etc., kënne liicht gestéiert ginn andeems Dir dat gehackte Probematerial an de Lysis-Puffer fir Sonikatioun setzt. Zähnlech, lieweg Planzgewebe, wéi Somen, Nadelen etc., sollten dréchen gemoolt ginn. E puer haart, hëlze Planzmaterialien musse gefruer a gemoolt ginn a flëssege Stickstoff ier se duerch Sonikatioun extrahéiert ginn. Fir Planzenzellkultursuspensiounen ass eng Ultraschallbehandlung tëscht 30 an 150 Sekonnen an engem Lysisbuffer meeschtens genuch. Méi haart Material wéi Kürbiskerne erfuerderen eng méi intensiv Sonikatioun wéi hei ënnendrënner beschriwwen.
Protokoll fir Ultraschall Extraktioun vun Albumin aus Kürbiskerne
Fir d'Ultraschall-Protein-Extraktioun vun Albumin aus feingemuelten Kürbiskernepulver, 10 g offetteg Kürbiskernepulver an 100 mL deioniséiertem Waasser als Léisungsmëttel ginn an engem 250mL Glasbecher dobäigesat. D'Protein Extraktioun besteet aus zwee Schrëtt: Als éischt gëtt d'Probe sonicated mat engem Sonde-Typ Ultrasonicator UP400St (400W, 24kHz) equipéiert mat sonotrode S24d7. De Glasbecher gëtt an engem kale Waasserbad während der Ultraschallhomogeniséierung gesat. De pluggable Temperatursensor an d'Temperatursteuerungsastellunge vum Ultraschall UP400St garantéieren datt d'Probetemperatur ëmmer ënner 30 ° C gehal gëtt. Duerch déi präzis Temperaturkontroll während der Sonikatioun gëtt eng Denaturatioun vum Albumin vermeit. Zweetens gouf d'Extraktioun mat engem Mischer bei 200 U/min Geschwindegkeet a bei 30 ° C duerchgefouert. Duerno gëtt de Becher an en thermostatesche Shaker transferéiert. Globulin gëtt iwwer Dialyse mat destilléiert Waasser ewechgeholl. No der Entfernung vum Globulin kann de Proteinextrakt getest ginn fir den Albuminprofil ze bestëmmen a gëtt duerno op pI = 3.0 ugepasst mat 0,1 M HCl fir Albumin Koagulatioun. Déi zolidd Phase gëtt duerch Zentrifugéierung bei 5000g, 20°C getrennt an an deioniséiertem Waasser nei opgeléist. Albumin Koagulatioun gëtt zweemol gemaach fir de Proteinverhältnis am Albuminkonzentrat ze erhéijen.
Ultraschall alkalesch Proteinextraktioun fir d'Virbereedung vu Proteinkonzentrat aus Reisbran weist datt d'Ultraschallbehandlung zu enger méi héijer Proteinausgab an enger wesentlech méi kuerzer Extraktiounszäit resultéiert – Verglach mat konventionelle Extraktiounsmethoden.
Probe Virbereedungsprotokoll fir funktionell iNOS Enzym
Fir voll funktionell iNOS Enzym ze kréien (zB fir Drogenscreening), gëtt de folgende Protokoll recommandéiert: D'Zellsuspension soll op Äis plazéiert ginn a gëtt mat engem UP100H bei 10µm Amplitude am Zyklusmodus vu 5 Sekonnen sonikéiert. sonication an 25 sec. raschten op Äis. D'Prozedur soll widderholl ginn ca. 3 Kéieren. D'Reschtzäit tëscht Sonikatiounszyklen reduzéiert d'Temperaturerhéijung a reduzéiert dofir de Risiko vun der Denaturatioun.
Ultraschall Protein Solubiliséierung
Sonication kann de Protein Solubiliséierungsprozess beschleunegen, wat normalerweis e puer Stonnen erfuerdert. Fir d'Probe net ze iwwerhëtzen an d'Proteindegradatioun an d'Modifikatiounen an de Léisungen, déi Harnstoff enthalen, ze vermeiden, sollten d'Ultraschallausbréch net méi laang wéi e puer Sekonnen daueren.
Ultrasonicator UP200Ht mat 2mm Microtip S26d2 fir d'Sonication vu klenge Proben.
Ultraschall Ausrüstung fir Protein Extraktioun
Hielscher Ultrasonics bidden eng breet Palette vun Ultraschallhomogenisatoren fir d'Zerfall vun Zellen, Gewëss, Bakterien, Mikroorganismen, Hef a Spore.
Hielscher Labo Ultraschaller si mächteg an einfach ze bedreiwen. Gebaut fir 24/7 Operatioun, si sinn als robust an effizient Labo- a Bench-Top Apparater entworf. Fir all Apparater kënnen d'Energieausgang an d'Amplitude präzis kontrolléiert ginn. Déi breet Palette vun Accessoiren mécht weider Setupoptiounen op. Déi digital Ultraschaller wéi de VialTweeter, UP200Ht, UP200St, an UP400St hunn eng integréiert Temperaturkontroll an eng agebaute SD Kaart fir automatesch Datenopnam.
Fir déi indirekt, Kräizkontaminatiounsfräi a gläichzäiteg Sonikatioun vu verschidde Proben, bidde mir de VialTweeter oder den Ultraschall CupHorn.
D'Tabell hei drënner gëtt Iech en Iwwerbléck iwwer eis Ultraschaller fir Probepräparatioun, Zellstéierung an Extraktioun. Klickt op den Apparattyp fir méi Informatioun iwwer all Ultraschallhomogenisator ze kréien. Eis gutt ausgebilte a laangjäreg Erfahrungen technesche Personal wäerte frou Iech ze hëllefen de gëeegentste Ultraschall fir Är Probe Virbereedung ze wielen!
| Batch Volume | Duerchflossrate | Recommandéiert Apparater |
|---|---|---|
| bis zu 10 Fläschen oder Réier | na | VialTweeter |
| multiwell / microtiter Placke | na | UIP400MTP |
| multiple Réier / Schëffer | na | cuphorn |
| 1 bis 500 ml | 10 bis 200 ml/min | UP100H |
| 10 bis 1000 ml | 20 bis 200 ml/min | UP200Ht, UP 200 St |
| 10 bis 2000 ml | 20 bis 400 ml/min | UP 400 St |
Ofhängeg vun Ärer Applikatioun, Material a Probevolumen, wäerte mir Iech dee gëeegentste Setup fir Är Probevirbereedung recommandéieren. Kontaktéiert eis haut!
Kontaktéiert eis! / Frot eis!
Hielscher Digital Ultrasonicators hunn eng Browser Fernsteierung an automatesch Dateprotokolléierung op enger integréierter SD-Kaart.
VialTweeter fir indirekt sonication.
Fakten Worth Wëssen
proteomics
Proteomics ass de Fuerschungsfeld dat Proteinen an de Proteom ënnersicht. Proteinen erfëllen eng grouss Gamme vu vital Funktiounen bannent Organismen. De Proteome ass dee ganze Set vu Proteine ausgedréckt vun engem Genom, Zell, Tissu oder Organismus zu enger bestëmmter Zäit. De Proteom variéiert mat der Zäit an ënnerschiddlechen Ufuerderungen, oder Stress, déi eng Zell oder en Organismus erlieft. Méi spezifesch ass et de Set vun ausgedréckte Proteinen an enger bestëmmter Aart vun Zell oder Organismus, zu enger bestëmmter Zäit, ënner definéierte Bedéngungen. De Begrëff ass eng Mëschung vu Proteinen a Genom. Proteomics ass d'Studie vum Proteom.
protein
Proteine si grouss Biomoleküle, sougenannte Makromoleküle – déi aus enger oder méi laanger Ketten vun Aminosaierreschter besteet. Proteine si präsent an all Organismen vu vegetativen an Déier Hierkonft a si sinn entscheedend fir déi meescht biologesch Funktiounen. Well Proteine vill biologesch Informatioun enthalen, gi se fir analytesch Zwecker extrahéiert, zB fir proteomesch Fuerschung. Déi wichtegst Funktioun, déi vu Proteinen ausgeführt gëtt, beinhalt d'Katalyse vu metabolesche Reaktiounen, DNA Replikatioun, Äntwert op Reizen, an den Transport vu Molekülle vun enger Plaz op déi aner. Proteine ënnerscheede sech vuneneen haaptsächlech an hirer Sequenz vun Aminosäuren, déi duerch d'Nukleotid-Sequenz vun hiren Genen diktéiert gëtt, an déi normalerweis zu engem Protein ausklappen an eng spezifesch dreidimensional Struktur, déi seng Aktivitéit bestëmmt. Proteinen sinn – Nieft Peptiden – ee vun de Schlësselkomponente vu Liewensmëttel. Dofir ass Proteomics e mächtegt Tool an der Liewensmëttelwëssenschaft fir Prozesser, Liewensmëttelsécherheet an Ernärungsbewäertung ze optimiséieren.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction ass eng pre-analytesch Prozedur fir Analyten ze trennen a pre-konzentréieren. A Kombinatioun mat Ultraschall kann d'Wollekpunktextraktioun verstäerkt ginn, wat de Prozess méi effizient, méi séier an ëmweltfrëndlech mécht. Mat Ultrasonicatioun ass d'Wollekpunktextraktioun eng wesentlech méi effizient Method fir Analytpräparatioun. Liest méi iwwer Ultraschall assistéiert Cloud Point Extraktioun!Gel Elektrophorese
Gel Elektrophorese ass déi Haaptmethod fir Trennung an Analyse vu Makromoleküle wéi DNA, RNA a Proteinen souwéi hir Fragmenter, baséiert op hirer Gréisst a Ladung. Et gëtt an der klinescher Chimie benotzt fir Proteinen duerch Ladung an / oder Gréisst ze trennen (IEF Agarose, wesentlech Gréisst onofhängeg) an an der Biochemie, Molekulare Biologie a Proteomik fir eng gemëscht Populatioun vun DNA an RNA Fragmenter no Längt ze trennen, fir d'Gréisst vun DNA ze schätzen. a RNA Fragmenter oder fir Proteinen duerch Ladung ze trennen.
Zellkulturen
Zellkultur ass de kontrolléierte Wuesstumsprozess, duerch deen Zellen ënner kontrolléierte Bedéngungen kultivéiert ginn. Zellkulturbedingunge variéiere fir all Zelltyp. Am Allgemengen besteet d'Ëmfeld vun enger Zellkultur aus engem gëeegente Behälter (z.B. Petri-Schicht) mat Substrat oder Medium, deen déi essentiell Nährstoffer (Aminosäuren, Kuelenhydrater, Vitaminnen, Mineralstoffer), Wuesstumsfaktoren, Hormonen a Gase (CO2) liwwert.2, O2), a reguléiert de physiochemeschen Ëmfeld (pH-Puffer, osmoteschen Drock, Temperatur). Déi meescht Zellen brauchen eng Uewerfläch oder kënschtlech Substrat, wärend aner Zellkulture kënne fräi schwiewen a Kulturmedium (Suspensionskultur, Zellsuspension) kultivéiert ginn.
Mass Kulturen vun Déier Zell Linnen sinn an industriell Produktioun vun viral Impfungen an aner biotechnologesch ofgeleet Produkter benotzt. Mënschlech Stammzelle ginn kultivéiert fir d'Zuel vun den Zellen auszebauen an d'Zellen a verschidde somatesch Zellarten fir Transplantatiounszwecker ze differenzéieren.
Tissue Echantillon
De Begrëff Tissu beschreift e cellulären Zwëschenzäit, wou d'Zellmaterial op organisatoreschen Niveau tëscht Zellen an engem komplette Organ ass. Am Tissu ginn ähnlech Zellen aus dem selwechten Hierkonft, déi zesummen eng spezifesch Funktioun ausféieren, zesummegesat. Duerch déi funktionell Gruppéierung vu multiple Stoffer ginn déi komplex Strukture vun Organer geformt.
Tissue gëtt getest fir Fuerschung an der Biologie, Histologie / Histologie, Parasitologie, Biochemie, Immunhistochemie souwéi fir DNA ze kultivéieren an ze extrahieren. Et kann tëscht Déier (Ënnerdeelung: Mamendéieren Tissu) a Planz Tissu ënnerscheeden ginn. Déieregewebe ginn an déi véier Basisaarte vu Bindegewebe gruppéiert, Muskel, Nerven, an Epithelgewebe. Planzgewebe gëtt an déi folgend dräi Tissuesystemer ënnerdeelt: d'Epidermis, de Buedemgewebe an de vaskuläre Tissu.
Tissue Echantillon kënnen aus Déieren- oder Planzendeeler virbereet ginn, zB Schanken, Muskelen, Blieder, asw.
Kierper Flëssegkeeten
Blutt, Serum, Plasma, Cerebrospinal Flëssegkeet, Spaut a Synovial Flëssegkeet si Kierperflëssegkeeten, déi eng grouss Quell vun diagnostesch relevant Informatioun ubidden. Dofir ass eng sophistikéiert Virbereedung vu Kierperflëssegkeetsprouwen fir Analyse wichteg. Déi éischt Schwieregkeet ass verbonne mat der breet dynamescher Palette vu Komponenten, déi a Kierperflëssegkeeten präsent sinn.
Bestëmmung vun der Protein Konzentratioun
Bradford Assay, Lowry Assay a Bicinchonininsäure (BCA) Assay sinn allgemeng Assays fir d'Konzentratioun vu Proteinen ze bestëmmen. Bovine Serum Albumin (BSA) ass ee vun de meescht benotzt Protein Standarden.
lysis buffer
Lysis-Puffer muss am Aklang mam Zellmaterial oder Tissu gewielt ginn (Tissuekultur, Planz, Bakterien, Pilze, asw.), An ob d'Zellen an enger Struktur an der Aart vun der Struktur sinn. Eng breet Palette vu Lysispuffer fir Extraktioun vu Proteinen, Membranen an Organelle gi mat engem oder méi Detergenten formuléiert. D'Wäschmëttel gëtt normalerweis iwwer Test-a-Fehler Tester ausgewielt oder – wa verfügbar – no engem existente Proteinextraktiounsprotokoll. Den Detergent muss mat der Tissuequell an de Proteinen kompatibel sinn. Am Allgemengen gëtt de mëllste Detergent, deen fir e spezifescht Tissu / Protein funktionnéiert, gewielt fir déi maximal Funktionalitéit vum Extrait z'erhalen. Ausserdeem, am Fall vun enger Extraktioun vu Membranen an Organellen, hält e mëllen Detergent d'Membran intakt. Allgemeng benotzt Wäschmëttelen a Lysispuffer si meeschtens nonionesch oder zwitterionesch, zB CHAPS, Deoxycholat, Triton™ X-100, NP40, an Tween 20.
Zum Beispill, Tissue wéi Gehir, Liewer, Darm, Nier, Milz etc. kënnen einfach mat RIPA gebuffert ginn – awer Protease-Inhibitoren an DTT (zB fir Gelelektrophorese) solle mat abegraff ginn.
Lysisbuffer fir Skelettmuskelgewebe (äiskal): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) Glycerol, 1 mM EDTA , 1 mM Dithiothreitol ergänzt mat Protease a Phosphatase-Inhibitor Cocktail
Dësch vun gemeinsam Puffer an hirem pH Beräich. Am Allgemengen ginn dës Puffer normalerweis bei Konzentratioune vun 20-50 mM benotzt.
| buffer | pH Beräich |
|---|---|
| Zitrouneseier – NaOH | 2.2 – 6.5 |
| Natriumcitrat – Zitrouneseier | 3.0 – 6.2 |
| Natriumacetat – Essigsäure | 3.6 – 5.6 |
| Cacodylic Seier Natrium Salz – HCl | 5.0 – 7.4 |
| MES – NaOH | 5.6 – 6.8 |
| Natriumdihydrogenphosphat – dinatrium Waasserstoff phosphate | 5.8 – 8.0 |
| imidazol – HCl | 6.2 – 7.8 |
| MOPS – KOH | 6.6 – 7.8 |
| Triethanolamine Hydrochlorid – NaOH | 6.8 – 8.8 |
| Tris – HCl | 7.0 – 9,0 |
| HEPES – NaOH | 7.2 – 8.2 |
| Tricine – NaOH | 7.6 – 8.6 |
| Natriumtetraborat – borsäure | 7.6 – 9.2 |
| Bicine – NaOH | 7.7 – 8.9 |
| glycine – NaOH | 8.6 – 10.6 |
Déi meescht Puffer weisen eng pH-Ofhängegkeet mat der Temperatur. Dëst ass virun allem wouer fir Tris Puffer. De pKa ännert sech vun 8,06 bei 25°C op 8,85 bei 0°C.
(pH an pKa vun engem Puffer: pH moosst d'Konzentratioun vu Waasserstoffionen an enger wässerlecher Léisung. pKa (= Säuredissoziatiounskonstant) ass eng verwandte, awer méi spezifesch Moossnam, an där et hëlleft virauszesoen wéi e Molekül bei engem spezifesche Wierk handelt pH Wäert.)
TRIzol
TRIzol ass eng chemesch Léisung déi benotzt gëtt fir RNA / DNA / Protein wärend der Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform Extraktioun ze extrahieren. D'Benotzung vun ultraschall assistéiert TRIzol Extraktioun resultéiert zu héijen DNA, RNA, a Protein Erléisse vun der selwechter Probe an excels doduerch aner Extraktiounsmethoden.
Literatur / Referenzen
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.