Ultraschalllyse vu bioingenieurtechnesch verännerten Zellen an der industrieller Produktioun

Bioingenieurtechnesch verännert Bakterienaarten ewéi E. coli souwéi genetesch verännert Zellzorte vu Mamendéieren a Planze gi breet an der Biotechnologie agesat, fir Moleküllen ze expriméieren. Fir dës synthetiséiert Biomoleküllen fräizesetzen, ass eng zouverlässeg Technik fir den Zellopschloss néideg. Héichleeschtungsultraschall ass eng bewäert Method fir eng effizient an zouverlässeg Zelllyse – a léisst sech einfach op grouss Duerchsätz skaléieren. Hielscher Ultrasonics bitt Iech héichleeschtungsfäeg Ultraschallapparater fir eng wierksam Zelllyse, fir grouss Volume vu qualitativ héichwäertege Biomoleküllen ze produzéieren.

Extraktioun vu Moleküllen aus Zellfabricken

Fir eng breet Palett vu Biomoleküllen ze produzéieren, kënne verschidde gezielt verännert Mikroben a Planzzellen als mikrobiell Zellfabricke benotzt ginn, dorënner Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana an Algen, nieft villen aneren. Dës Zellfabricke kënne Proteinnen, Lipiden, Biochemikalien, Polymeren, Biokraaftstoffer an Oleochemikalie produzéieren, déi als Liewensmëttel oder als Réistoff fir industriell Uwendunge benotzt ginn. Zellen, déi als Zellfabricke benotzt ginn, ginn a geschlossene Bioreaktore kultivéiert, wou si eng héich Effizienz a Spezifitéit souwéi en niddregen Energiebedarf erreeche kënnen.
Fir d’Zilmoleküllen aus de bioingenieurtechnesch verännerten Zellkulturen ze isoléieren, mussen d’Zellen opgeschloss ginn, soudatt dat intrazelluläert Material fräigesat gëtt. Ultraschallapparater fir den Zellopschloss si gutt etabléiert als héich zouverlässeg an effizient Technik fir d’Zelldesintegratioun an d’Fräisetzung vu Verbindungen.

Mikrobiell Zellfabricke sinn Zellen, deenen hire Metabolismus gezielt verännert gouf an déi fir d’Synthees vu verschiddene wäertvolle Verbindunge benotzt ginn. Den Zellopschloss mat Ultraschall ass eng effizient an zouverlässeg Method, fir déi wäertvoll Verbindungen aus dem Zellbanneschte fräizesetzen.
Etüd a Grafik: ©Villaverde, 2010.

Virdeeler vun Ultraschallapparater fir den Zellopschloss

Als netthermesch, schounend an awer héich effizient Technologie ginn Ultraschallapparater fir den Zellopschloss am Labo an an der Industrie agesat, fir Zellen ze lyséieren a qualitativ héichwäerteg Extrakter ze produzéieren, déi z. B. fir d’Isolatioun vu Moleküllen aus Zellfabricke benotzt ginn.

Leeschtungsultraschall fir den effizienten Opschloss vu mikrobiellen Zellfabricken

Mechanismus an Effekter vun Ultraschallapparater fir den Zellopschloss:
Den Ultraschall-Zellopschloss benotzt d’Kraaft vun Ultraschallwellen. Den Ultraschallhomogenisator / Zellopschlossapparat ass mat enger Sond (och Sonotrod genannt) aus enger Titanlegierung ekipéiert, déi mat enger héijer Frequenz vun ongeféier 20 kHz schwéngt. Dat bedeit, datt d’Ultraschallsond 20.000 Schwéngunge pro Sekonn an déi mat Ultraschall behandelt Flëssegkeet akoppelt. D’Ultraschallwellen, déi an d’Flëssegkeet agekoppelt ginn, si vun ofwiesselnden Héichdrock- / Nidderdrockzyklen charakteriséiert. Wärend engem Nidderdrockzyklus deent sech d’Flëssegkeet aus, an et entstinn winzeg Vakuumblosen. Dës ganz kleng Blose wuessen iwwer e puer ofwiesselnd Drockzyklen, bis se keng weider Energie méi ophuele kënnen. Zu dësem Zäitpunkt implodéieren d’Kavitatiounsblosen hefteg a schafen lokal en Ëmfeld mat enger aussergewéinlech héijer Energiedicht. Dëst Phänomeen ass als akustesch Kavitatioun bekannt a charakteriséiert sech duerch lokal ganz héich Temperaturen, ganz héich Drécker a Schéierkräften. Dës Schéierspannunge briechen d’Zellwänn effizient op an erhéijen de Massentransfer tëscht dem Zellbannenzegen an dem Léisungsmëttel ronderëm. Als reng mechanesch Technik gi Schéierkräften, déi duerch Ultraschall entstinn, wäit verbreet agesat a sinn dat recommandéiert Verfare fir de bakteriellen Zellopschloss souwéi fir d’Proteinisolatioun. Als einfach a séier Method fir den Zellopschloss ass d’Ultraschallbehandlung ideal fir d’Isolatioun aus klengen, mëttelgroussen a grousse Volummen. Déi digital Ultraschallapparater vun Hielscher si mat engem iwwersiichtlechen Astellungsmenü fir eng präzis Steierung vun der Ultraschallbehandlung ekipéiert. All Date vun der Ultraschallbehandlung ginn automatesch op enger agebauter SD-Kaart gespäichert a sinn einfach zougänglech. Ausgeräift Méiglechkeete fir d’Wärmeofleedung, wéi extern Killung, Ultraschallbehandlung am Pulsmodus asw., suerge wärend dem Ultraschall-Desintegratiounsprozess dofir, datt déi ideal Prozesstemperatur agehale gëtt an domat déi extrahéiert hëtztempfindlech Verbindungen intakt bleiwen.

Fuerschung ënnersträicht d’Stäerkte vum Zellopschloss an der Extraktioun mat Ultraschall

De Prof. Chemat et al. (2017) faassen an hirer Etüd zesummen, datt „d’Ultraschall-ënnerstëtzt Extraktioun eng ëmweltfrëndlech a wirtschaftlech rentabel Alternativ zu konventionellen Technike fir Liewensmëttel an Naturprodukter ass. D’Haaptvirdeeler sinn d’Reduktioun vun der Extraktiouns- a Veraarbechtungszäit, vun der Quantitéit un agesater Energie a Léisungsmëttelen, vun den Eenheetsoperatiounen a vun den CO₂ -Emissiounen.“
Gabig-Ciminska et al. (2014) hunn an hirer Etüd en Héichdrockhomogenisator an en Ultraschall-Zelldesintegrator fir d’Lyse vu Spore benotzt, fir DNA fräizesetzen. Beim Verglach vun deenen zwou Methode fir den Zellopschloss kënnt d’Fuerschungsequipe wat d’Zelllyse fir Sporen-DNA ugeet zu dëser Konklusioun: „D’Analys gouf mat Zelllysater aus der Héichdrockhomogeniséierung duerchgefouert. Duerno hu mir festgestallt, datt den Ultraschall-Zellopschloss fir dësen Zweck aussergewéinlech Virdeeler huet. E geet zimlech séier a ka fir kleng Proufvolummen duerchgefouert ginn.“ (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Biomoleküllen aus Zellfabricke fir d’Liewensmëttelproduktioun

Mikrobiell Zellfabricke sinn eng praktikabel an effizient Produktiounsmethod, bei där mikrobiell Organisme benotzt ginn, fir duerch metabolescht Bioengineering vu Mikroorganisme wéi Bakterien, Hiefen, Pilzer asw. héich Ausbeuten u natierlechen an net natierleche Metabolitten ze produzéieren. Enzymen a grousse Quantitéite ginn zum Beispill mat Mikroorganisme wéi Aspergillus oryzae, Pilzer a Bakterie produzéiert. Dës Enzyme ginn an der Liewensmëttel- a Gedrénksproduktioun souwéi an der Landwirtschaft, der Bioenergie an der Haushaltspfleeg benotzt.
Verschidde Bakterie wéi Acetobacter xylinum a Gluconacetobacter xylinus produzéiere wärend dem Fermentatiounsprozess Zellulos, woubäi Nanofaseren an engem Bottom-up-Prozess synthetiséiert ginn. Bakteriell Zellulos (och als mikrobiell Zellulos bekannt) ass cheemesch gläichwäerteg mat planzlecher Zellulos, huet awer en héije Kristallinitéitsgrad an eng héich Rengheet (fräi vu Lignin, Hemizellulos, Pektin an anere biogene Bestanddeeler) souwéi eng eenzegaarteg Struktur aus engem dräidimensionalen (3D), aus Zellulosnanofasere gewiefte vernetzte Geflecht. (cf. Zhong, 2020) Am Verglach mat Zellulos aus Planzen ass bakteriell Zellulos méi nohalteg, an déi produzéiert Zellulos ass reng, sou datt keng komplex Rengegungsschrëtt néideg sinn. D’Ultraschallbehandlung an d’Extraktioun mat Léisungsmëttelen ënner Asaz vun NaOH oder SDS (Natriumdodecylsulfat) si ganz wierksam fir bakteriell Zellulos aus de Bakterienzellen ze isoléieren.

Biomoleküllen aus Zellfabricke fir d’Produktioun vu Medikamenter an Impfstoffer

Ee vun de bedeitendste pharmazeetesche Produkter, déi aus Zellfabricke gewonnen ginn, ass mënschlechen Insulin. Fir d’Produktioun vun Insulin duerch Bioengineering ginn haaptsächlech E. coli a Saccharomyces cerevisiae benotzt. Well biosynthetiséiert Moleküllen am Nanometerberäich eng héich Biokompatibilitéit bidden, si biologesch Nanopartikele wéi Ferritin fir vill Uwendungen an der biologescher Produktioun vu Virdeel. Ausserdeem ass d’Produktioun a metabolesch verännerte Mikroben dacks däitlech méi effizient, wat déi erziilten Ausbeuten ugeet. Zum Beispill ass d’Produktioun vun Artemisininsäure, Resveratrol a Lycopin ëm dat Zéngfacht bis e puer Honnertfacht geklommen, an d’Produktioun am industrielle Moossstaf ass schonn etabléiert oder gëtt nach entwéckelt. (cf. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
Zum Beispill si proteinbaséiert Biomoleküllen am Nanometerberäich mat Eegenschafte fir sech selwer zesummenzelagere wéi Ferritin a virusänlech Partikele besonnesch interessant fir d’Entwécklung vun Impfstoffer, well si souwuel d’Gréisst wéi och d’Struktur vu Krankheetserreeger nomaachen an sech fir d’Konjugatioun vun Antigenen un hirer Uewerfläch eegnen, fir d’Interaktioun mat Immunzellen ze fërderen. Esou Molekülle ginn a sougenannten Zellfabricken (z. B. duerch Bioengineering verännerten E. coli-Stämm) expriméiert, déi e bestëmmt Zilmoleküll produzéieren.

Protokoll fir d’Ultraschalllys vun E. coli BL21 fir d’Fräisetzung vu Ferritin

Ferritin ass e Protein, deem seng Haaptfunktioun d’Späichere vun Eisen ass. Ferritin weist villverspriechend Eegenschaften als Nanopartikelen, déi sech selwer zesummelageren, an Impfstoffer, wou et als Dréier fir Impfstoffkomponenten (z. B. SARS-Cov-2-Spike-Proteinen) benotzt gëtt. Déi wëssenschaftlech Fuerschung vu Sun et. al. (2016) weist, datt rekombinante Ferritin bei niddregen NaCl-Konzentratiounen (≤50 mmol/L) a léislecher Form aus Escherichia coli fräigesat ka ginn. Fir Ferritin an E. coli BL21 ze expriméieren an de Ferritin fräizesetzen, gouf de folgende Protokoll erfollegräich applizéiert. Dat rekombinant pET-28a/ferritin-Plasmid gouf duerch Transformatioun an den E coli BL21 (DE3)-Stamm agebruecht. D’Ferritin-E coli BL21 (DE3)-Zelle goufen an LB-Wuesstemsmedie mat 0,5% Kanamycin bei 37°C kultivéiert a bei enger OD600 vun 0,6 mat 0,4% Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid fir 3 Stonne bei 37°C induzéiert. Déi definitiv Kultur gouf duerno duerch Zentrifugatioun bei 8000g fir 10 Minutte bei 4°C gesammelt, an de Pellet gouf entnomm. Duerno gouf de Pellet a LB-Medium (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% Hiefextrakt)/Lysepuffer (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) respektiv an NaCl-Léisunge mat verschiddene Konzentratiounen (0, 50, 100, 170 an 300 mmol/L) resuspendéiert. Fir d’Lys vun de Bakterienzelle gouf eng Ultraschallbehandlung am Pulsmodus applizéiert: z. B. mam Ultraschallapparat UP400St bei 100% Amplitud mat engem Aarbechtszyklus vu 5 Sekonnen UN, 10 Sekonnen AUS, iwwer 40 Zyklen) an duerno bei 10 000g fir 15 Minutte bei 4°C zentrifugéiert. Den Iwwerstand an den Nidderschlag goufe mat Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorees (SDS-PAGE) analyséiert. All mat Natriumdodecylsulfat gefierfte Gelle goufe mat engem Scanner mat héijer Opléisung gescannt. D’Gelbiller goufe mat der Software Magic Chemi 1D analyséiert. Fir eng optimal Däitlechkeet goufen d’Proteinbande mat ugepasste Parameteren detektéiert. D’Donnéeë fir d’Bande goufen aus techneschen Dräifachbestëmmunge generéiert. (kuckt Sun et al., 2016)

Ultraschall-Zellopschlossgeräter fir d’industriell Lys vu Zellfabricken

D’Lys an d’Extraktioun mat Ultraschall sinn eng zouverlässeg a praktesch Method, fir Metabolitten aus Zellfabricke fräizesetzen an domat eng effikass Produktioun vun Zilmoleküllen z’ënnerstëtzen. Ultraschall-Zellopschlossgeräter si vu Labo- bis Industriegréisst disponibel, an d’Prozesser kënne vollstänneg linear skaléiert ginn.
Hielscher Ultrasonics ass Äre kompetente Partner fir héichleeschtungsfäeg Ultraschall-Zellopschlossgeräter an huet laangjäreg Erfarung mat der Installatioun vun Ultraschallsystemer an Dëschopbauten an industriellen Anlagen.
Wat usprochsvoll Hardware a Software ugeet, erfëllen d’Zellopschlosssystemer vun Hielscher Ultrasonics all Ufuerderunge fir eng optimal Prozesskontroll, eng einfach Bedéngung a Benotzerfrëndlechkeet. D’Clienten an d’Benotzer vun den Ultraschallgeräter vun Hielscher schätzen de Virdeel, datt d’Ultraschall-Zellopschlossgeräter an d’Extraktere vun Hielscher eng präzis Iwwerwaachung a Steierung vum Prozess erméiglechen – iwwer en digitalen Touchdisplay an eng Fernsteierung iwwer de Browser. All wichteg Donnéeë vun der Ultraschallbehandlung (z. B. Nettoenergie, Gesamtenergie, Amplitud, Dauer, Temperatur, Drock) ginn automatesch als CSV-Datei op enger integréierter SD-Kaart gespäichert. Dëst hëlleft, reproduzéierbar a widderhuelbar Resultater ze kréien, a vereinfacht d’Standardiséierung vum Prozess souwéi d’Anhale vun der gudder Fabrikatiounspraxis (cGMP).
Natierlech sinn d’Ultraschallprozessoren vun Hielscher fir de 24/7-Betrib ënner voller Laascht gebaut a kënnen dofir zouverlässeg an industriellen Produktiounsanlage bedriwwe ginn. Duerch hir héich Robustheet an de geréngen Ënnerhaltsbedarf sinn d’Ausfallzäite vun den Ultraschallgeräter wierklech kuerz. D’Funktioune CIP (Botzen op der Plaz) a SIP (Steriliséieren op der Plaz) miniméieren opwänneg Botzaarbechten, besonnesch well all Deeler, déi mat der Flëssegkeet a Kontakt kommen, glat Metalluewerflächen hunn (keng verstoppt Ëffnungen oder Düsen).

D’Tabell hei ënne gëtt Iech en Unhaltspunkt fir déi ongeféier Veraarbechtungskapazitéit vun eisen Ultraschallgeräter: