Plasmid Virbereedung mat Ultraschall

Ultrasonication ass eng zouverlässeg Technik fir Plasmid DNA ze fragmentéieren. Genau kontrolléierbar Amplitude, Pulsatiounsmodus an Temperaturkontroll sinn déi wichtegst Feature vun engem Ultraschall fir net schiedlech Plasmidfragmentatioun. Zousätzlech hëlleft d'Benotzung vu bestëmmten Agenten géint Plasmiddegradatioun ze schützen. Hielscher Ultrasonics bitt verschidde Léisunge fir kontrolléiert Plasmidfragmentatioun aus eenzel Fläschen, gläichzäiteg Sonikatioun vu ville Proben wéi och Multi-Well Placken. Léiert méi iwwer erfollegräich Ultraschallplasmidfragmentatioun!

Plasmid Schéier mat Ultraschall

Wann DNA Proben un Ultraschallwellen ënnerworf ginn, kreéieren déi ultraschall generéiert Schwéngungen akustesch Kavitatioun an der Flëssegkeet, déi héichmolekulare DNA Molekülle iwwer mechanesch Kräfte schneiden oder brécht. Sonication ass déi meescht verbreet Method fir bulk DNA Scheren Experimenter abegraff Uwendungen, wéi Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), fir déi kleng Fragmentgréissten absolut entscheedend sinn fir héich Opléisung ze kréien. (cf. Tseng et al., 2012)
Plasmid DNA (pDNA) ass spezifesch Form vun DNA, charakteriséiert duerch seng Ringform a gëtt a Bakterien an e puer Eukaryoten fonnt.
Supercoiled pDNA ass déi gewënscht Form vu Plasmid DNA well et déi bescht Resultater an Downstream Prozesser wéi automatiséiert Sequenzéierung an Transfektioun weist. Ultrasonication ass gëeegent fir pDNA ze fragmentéieren, dorënner supercoiled pDNA, erfollegräich.
Thompson et al. (2008) bewisen datt Plasmid-Sonicatioun, déi bekannt ass fir supercoiled DNA ze fragmentéieren, ass en effektive Wee fir d'Sequenz phred20 Lieslängt ze verbesseren bis zum Punkt datt se net wesentlech anescht sinn wéi dem Beckman Coulter seng Kontrollschabloun oder enzymatesch lineariséierter Plasmiden.

Benotzung vu Plasmidvektoren

Plasmide ginn dacks als Tools benotzt fir Genen ze klonen, ze transferéieren an ze manipuléieren. Wann Plasmide experimentell fir dës Zwecker benotzt ginn, gi se Vektore genannt. DNA Fragmenter oder Genen kënnen an e Plasmidvektor agebaut ginn, sou datt e sougenannte rekombinante Plasmid erstellt. Plasmidvektore ginn als Gefierer benotzt fir rekombinant DNA an eng Hostzell ze féieren a sinn e Schlësselkomponent vum molekulare Klonen.
“Net-viral Vektore ginn extensiv studéiert fir hir potenziell Notzung an der Gentherapie fir verschidde komplizéiert Krankheeten ze behandelen. Net-viral Vektore schützen Plasmid DNA géint kierperlech, chemesch an enzymatesch Degradatioun a liwweren d'DNA Molekül op d'Zilplaz. Zum Beispill kationesch Liposomen, Chitosan an aner positiv gelueden Nanopartikel bilden Komplexe mat Plasmid DNA duerch elektrostatesch Interaktiounen. Wéi och ëmmer, déi liicht geformt kationesch Liposomen / Plasmid DNA Komplexe si relativ grouss (dh 300-400 nm) an heterogen an der Natur, wat se schwéier an pharmazeuteschen Uwendungen ze benotzen. Déi grouss an heterogen Plasmid DNA / Liposomen, Plasmid DNA / Aerosolen, a Plasmid DNA / Peptide Komplexe kënnen op méi kleng an homogen Partikele mat Ultraschall reduzéiert ginn.” (Sarker et al., 2019)
E prominent Beispill fir d'Benotzung vu Plasmidvektoren ass CRISPR-Cas9. De CRISPR-Cas9 System gëtt typesch un Zellen geliwwert als een eenzegt grousst Plasmid oder méi kleng Plasmiden, déi eng Zilsequenz, e CRISPR Guide a Cas9 codéieren.

Ultrasonic Virbereedung vun DNA-gelueden PLGA Nanopartikel duerch Nanoprecipitation

Jo et al. (2020) benotzt Poly(Milch-Co-Glykolsäure) (PLGA) fir en Nanopartikel Carrier ze bilden fir d'Liwwerung vun engem Modell CRISPR-Cas9 Plasmid a primäre Knochenmark ofgeleet Makrophagen. Fir d'Nanoprecipitatioun vu PLGA Nanopartikelen, goufen PLGA mat zwou verschiddenen Endgruppen (Ester an Amingruppen) benotzt mam Zil datt déi positiv gelueden Amin Endkappen d'Verkapselungseffizienz an d'Belaaschtung erhéijen wéinst de Ladungsinteraktiounen tëscht et an dem negativ geluedenen Réckgrat vun d'DNA. An engem 50 ml polypropylen konischen Zentrifuge Röhre gouf 100 mg Pluronic F127 an 20 ml autoklavéiert DI Waasser opgeléist duerch Wirbelmëschung gefollegt vun 30 min sanfter Sonikatioun mat engem Ultraschallbad (gesinn CupHorn). Eng autoklavéiert magnetesch Rührbar gouf bäigefüügt an d'Léisung gouf bei 600 RPM fir 30 min gemëscht, während déi aner Léisunge gemaach goufen. Plastiks Laboware gouf amplaz vu Glasware uechter benotzt fir net spezifesch Adsorptioun vun DNA ze minimiséieren. Léisunge vu PLGA opgeléist an DMF (44,48 mg / ml) an TIPS Pentacen opgeléist an THF (0,667 mg / ml) goufen separat gemaach. De PLGA gouf roueg gelooss fir an DMF fir 30 min ze naass ier se fir 30 min sonicated gouf. (fir de komplette Protokoll kuckt Jo et al., 2020)

Plasmid DNA Schutz während Sonication

DNA abegraff Plasmiden a supercoiled Plasmiden sinn héich sensibel Degradatioun. All verfügbare Fragmentéierungsmethoden si bekannt fir gewësse Nodeeler. Ultraschall DNA Fragmentatioun ass eng vun de bevorzugte Methoden zënter kontrolléierter Sonikatioun a Kombinatioun mat Schutzmoossnamen erlaabt d'Schéier- an Hëtztinduzéiert Schued vun DNA Strécke ze reduzéieren.
Nieft niddereg Amplituden Astellungen, Pulsatiounsperiod Modus an Temperatur Kontroll während Ultrasonic DNA Schéier, huet d'Benotzung vu bestëmmte Agenten bedeitendst Schutzmoossnamen Effekt géint DNA Degradatioun gewisen. Zum Beispill schützen verschidde Polymere, Peptiden a Lipiden d'Plasmid DNA wärend der Ultraschall.

D'Stabilitéit vu Plasmid DNA, a Plasmid DNA /IL Nanokomplexe géint Ultraschallschéierstress gouf mat Agarosegel Elektrophorese-Assay ënnersicht. Souwuel d'Plasmid DNA wéi och d'Plasmid DNA /IL Nanokomplexe goufen Ultraschallschéierstress fir verschidden Zäitpunkte ënnerworf. D'Plasmid DNA gouf fir 0, 10, 20, 30 an 40 Minutten un Ultraschallschéierstress ausgesat. Wéi och ëmmer, d'Plasmid DNA /IL Nanokomplexe goufen un Ultraschallschéierstress fir 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 an 120 Minutten ausgesat.
(Etude a Bild: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) bewisen datt wann d'Plasmid DNA / ionesch Flëssegkeet (pDNA / IL) Nanostrukture fir 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90, an 120 min un Ultraschallschéierstress ënnerworf goufen a mat dem kommerziell verfügbaren kationesche Gen komplexéiert goufen Liwwerung Agent lipofectamine, de Prozentsaz vun fluorescent positiv Zellen waren 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65%, an 50%, respektiv (kuckt ënnert Diagramm). De Prozentsaz vu fluoreszent positiven Zellen ass eropgaang wann d'Nanostrukture fir 10, an 20 min Ultraschallschéierstress ënnerworf goufen, an duerno lues erofgaange sinn.

Afloss vun ionescher Flëssegkeet [Bmim] [PF6] op d'Liwwerung vu Plasmid DNA op COS7 Zellen. Plasmid DNA / IL (ionesch Flëssegkeet) Nanokomplexe goufe bis zu 120 Minutten Ultraschallschéierstress ënnerworf a mat LA komplexéiert ier se an COS7 Zellen geliwwert goufen. D'Daten weisen d'Duerchschnëttszuel (%) vun GFP positiven HeLa Zellen gezielt an 10 verschiddene mikroskopesche Felder an d'Experiment gouf e puer Mol op dräi verschidden Deeg gemaach. (Studie an Diagramm: ©Sarker et al., 2019)

Ultrasonic Lysate Virbereedung

Ultraschall Zell Lysis Protokoll
Fänkt mat enger beräicherter Probe vun Zellen un, déi iwwer eng Zelltrennungsmethod virbereet gouf (zB immunomagnetesch Zelltrennung, Fluoreszenz-aktivéiert Zellsortéierung (FACS), Dichtgradient Zentrifugéierung, Immunodensitéit Zellisolatioun).
D'Zellproben mussen e Volume vun engem Lysis-Puffer weisen, dee passend ass fir den experimentellen Zil an den Sonde-Typ Ultraschall.
Hypotonesch Puffer si bevorzugt well se d'Ultraschallzelllysis verbesseren. Et ass wichteg datt Zousatzstoffer a Salzkonzentratioun op eng adäquat Manéier benotzt ginn.
Wielt Ären Ultraschall-Lysis-Apparat: Fir indirekt Sonikatioun vu Fläschen ass de VialTweeter oder CupHorn recommandéiert. Fir Multiwell-Placken ass den UIP400MTP den ideale Ultraschall. A klassesch Sonde-Typ Sonikatioun, en Ultraschallhomogenisator wéi den UP100H oder UP200Ht mat engem Mikro-Tipp sinn am meeschte passend.
Protokoll fir Sonde-Typ Sonikatioun: Setzt d'Ultraschallsonde an de Probevolumen an engem Mikrocentrifuge-Röhre a sonicate fir ca. 10 Sekonnen. Ofhängeg vun der DNA Probe, kann d'Sonicatioun nach eng oder zwee Mol widderholl ginn. Déi erfuerderlech Ultraschallenergie-Input (Ws / ml) hänkt vun der Probeviskositéit an der DNA-Typ of. Ofkillung iwwer Äisbad a Pulsatiounsmodus vum Ultraschall hëlleft ze verhënneren datt d'Probe thermesch ofgebaut gëtt.
No Ultraschalllysis gëtt d'Probe centrifugéiert fir Pelletstécker ze trennen (enthält onlyséiert Zellen, Käre an onlyséiert Organelle)
Wann d'Probe net direkt weider veraarbecht gëtt, kann et bei enger passender Temperatur gespäichert ginn fir seng Viabilitéit ze erhaalen.

Ultraschaller fir DNA Fragmentatioun

Hielscher Ultrasonics bitt verschidde Ultraschall-baséiert Plattforme fir DNA, RNA a Chromatin Fragmentatioun. Dës verschidde Plattformen enthalen Ultraschallsonden (Sonotroden), indirekten Sonikatiounsléisungen fir d'simultan Probepräparatioun vu Multiple Tubes oder Multi-Well Placken (zB 96-Well Placke, Mikrotiterplacke), Sonoreaktoren an Ultraschall Cuphorns. All Plattforme fir DNA Scheren ginn ugedriwwen duerch Frequenz-ofgestëmmte, High-Performance Ultrasonic Prozessoren, déi präzis kontrolléierbar sinn a reproduzéierbar Resultater liwweren.

Ultrasonic Prozessoren fir all Sample Zuel a Gréisst

Mat Hielscher's Multi-Sample Ultrasonicator VialTweeter (fir bis zu 10 Reagenzglieser) an UIP400MTP (fir Mikroplaten / Multiwell Placke) gëtt et einfach méiglech d'Probeveraarbechtungszäit ze reduzéieren wéinst intensiver a präzis kontrolléierbarer Ultraschall, wärend déi gewënschte DNA Fragment Gréisst Verdeelung an Ausbezuele kritt . Ultraschall DNA Fragmentatioun mécht Plasmid Virbereedung Schrëtt effizient, zouverlässeg a skalierbar. Protokoller kënne linear vun engem op e puer Proben skaléiert ginn andeems konstant Ultraschallparameter applizéiert ginn.
Sonde Ultraschaller mat engem bis fënnef Fanger sinn ideal fir d'Virbereedung vu méi klengen Probezuelen. Hielscher's Labo Ultraschaller si verfügbar mat verschiddene Kraaftniveauen, sou datt Dir den ideale Ultraschallstéierer fir Är DNA-verbonne Applikatioun wielt.