Plasmidpräparatioun mat Ultraschall

D’Ultraschallbehandlung ass eng zouverlässeg Technik fir Plasmid-DNA ze fragmentéieren. Eng präzis astellbar Amplitud, e Pulsatiounsmodus an eng Temperaturkontroll sinn déi wichtegst Eegenschafte vun engem Ultraschallapparat fir eng Plasmidfragmentéierung ouni Schied. Zousätzlech hëlleft den Asaz vu bestëmmte Substanzen, géint den Ofbau vu Plasmiden ze schützen. Hielscher Ultrasonics bitt verschidde Léisunge fir eng kontrolléiert Plasmidfragmentéierung an eenzele Prouweréiercher, fir déi gläichzäiteg Ultraschallbehandlung vu ville Prouwen an och fir Multiwell-Placken. Léiert méi iwwer déi erfollegräich Plasmidfragmentéierung mat Ultraschall!

Schéiere vu Plasmide mat Ultraschall

Wann DNA-Prouwen Ultraschallwellen ausgesat ginn, erzeugen déi duerch Ultraschall entstane Schwéngungen eng akustesch Kavitatioun an der Flëssegkeet, déi DNA-Molekülle mat héijem Molekulargewiicht duerch mechanesch Kräfte schéiert oder brécht. D’Ultraschallbehandlung ass déi am meeschte benotzt Method fir Experimenter, bei deenen DNA a gréissere Quantitéite geschéiert gëtt, dorënner Uwendunge wéi d’Chromatin-Immunopräzipitatioun (ChIP), bei deene kleng Fragmentgréissten absolut entscheedend sinn, fir eng héich Opléisung ze kréien. (cf. Tseng et al., 2012)
Plasmid-DNA (pDNA) ass eng spezifesch Form vun DNA, déi sech duerch hir Rankform auszeechent an a Bakterien an a verschiddenen Eukaryote virkënnt.
Superhelikal pDNA ass déi gewënscht Form vu Plasmid-DNA, well si déi bescht Resultater an nogelagerte Prozesser wéi der automatiséierter Sequenzéierung an der Transfektioun liwwert. D’Ultraschallbehandlung eegent sech, fir pDNA, och superhelikal pDNA, erfollegräich ze fragmentéieren.
Thompson et al. (2008) hu gewisen, datt d’Ultraschallbehandlung vu Plasmiden, déi bekannterweis superhelikal DNA fragmentéiert, eng effektiv Method ass, fir d’phred20-Lieslängte bei der Sequenzéierung esou wäit ze verbesseren, datt si sech net signifikant vun deene vun der Kontrollmatriz vu Beckman Coulter oder vun enzymatesch lineariséierte Plasmiden ënnerscheeden.

Asaz vu Plasmidvektoren

Plasmide ginn dacks als Geschier benotzt, fir Genen ze klonéieren, ze transferéieren an ze manipuléieren. Wa Plasmiden experimentell fir dës Zwecker agesat ginn, gi si Vektore genannt. DNA-Fragmenter oder Gene kënnen an e Plasmidvektor agebaut ginn, wouduerch e sougenannte rekombinante Plasmid entsteet. Plasmidvektoren déngen als Transportmëttel, fir rekombinant DNA an eng Wiertszell anzebréngen, a sinn e Schlësselbestanddeel vum molekulare Klonéieren.
“Netviral Vektore ginn intensiv op hire méiglechen Asaz an der Gentherapie fir d’Behandlung vu verschiddene komplizéierte Krankheeten ënnersicht. Netviral Vektore schützen d’Plasmid-DNA géint physikaleschen, cheemeschen an enzymateschen Ofbau an transportéieren d’DNA-Moleküll op d’Zilplaz. Zum Beispill bilden kationesch Liposomen, Chitosan an aner positiv gelueden Nanopartikelen duerch elektrostatesch Wiesselwierkunge Komplexer mat Plasmid-DNA. Allerdéngs sinn déi liicht entstoend Komplexer aus kationesche Liposomen a Plasmid-DNA relativ grouss (d. h. 300–400 nm) a vun Natur aus heterogen, wat hiren Asaz a pharmazeeteschen Uwendunge schwéier mécht. Déi grouss an heterogen Komplexer aus Plasmid-DNA/Liposomen, Plasmid-DNA/Aerosolen a Plasmid-DNA/Peptide kënne mat Ultraschall op méi kleng an homogen Partikele reduzéiert ginn.” (Sarker et al., 2019)
E prominent Beispill fir den Asaz vu Plasmidvektoren ass CRISPR–Cas9. De CRISPR–Cas9-System gëtt typescherweis als een eenzege grousse Plasmid oder als méi kleng Plasmiden an d’Zellen abruecht, déi eng Zilsequenz, e CRISPR-Guide a Cas9 kodéieren.

Präparatioun vun DNA-beluede PLGA-Nanopartikele mat Ultraschall duerch Nanopräzipitatioun

Jo et al. (2020) hunn Poly(Mëllechsäure-co-Glykolsäure) (PLGA) benotzt, fir en Nanopartikelträger fir den Transport vun engem CRISPR–Cas9-Modellplasmid a primär Makrophagen aus dem Knachemuerch ze bilden. Fir d’Nanoprezipitatioun vu PLGA-Nanopartikele gouf PLGA mat zwou verschiddenen Endgruppen (Ester- an Amingruppen) benotzt, mam Zil, datt déi positiv gelueden Aminendgruppen d’Effizienz vun der Akapselung an d’Beluedung duerch d’Laaschtinteraktiounen tëschent hinnen an dem negativ geluedene Réckgrat vun der DNA erhéijen. An engem koneschen Zentrifugeréierchen aus Polypropylen vu 50 mL goufen 100 mg Pluronic F127 an 20 mL autoklavéiertem deioniséiertem Waasser duerch Vortexmëschung opgeléist, gefollegt vun 30 min douce Beschallung an engem Ultraschallbad (kuckt CupHorn). En autoklavéierte magnetesche Réierstaaf gouf bäigefüügt, an d’Léisung gouf bei 600 RPM fir 30 min gemëscht, wärend déi aner Léisungen hiergestallt goufen. Et gouf duerchgoend Labormaterial aus Plastik amplaz vu Glas benotzt, fir déi net spezifesch Adsorptioun vun DNA ze miniméieren. Léisunge vu PLGA an DMF (44,48 mg/ ml) an TIPS-Pentacen an THF (0,667 mg/ml) goufe separat hiergestallt. De PLGA gouf 30 min ouni Beweegung an DMF benetze gelooss, éier e fir 30 min beschallt gouf. (Fir de komplette Protokoll kuckt Jo et al., 2020)

Schutz vu Plasmid-DNA wärend der Beschallung

DNA, dorënner Plasmiden a superhelikal verdréite Plasmiden, ass héich empfindlech géintiwwer Ofbau. All verfügbar Fragmentéierungsmethode si fir bestëmmt Nodeeler bekannt. D’Fragmentéierung vun DNA mat Ultraschall ass eng vun de bevorzugte Methoden, well eng kontrolléiert Beschallung a Kombinatioun mat Schutzmoossnamen et erméiglecht, Schied un DNA-Sträng duerch Schéierkräften an Hëtzt ze reduzéieren.
Nieft Astellunge mat niddreger Amplitud, dem Pulsatiounsmodus an der Temperaturkontroll beim Schéiere vun DNA mat Ultraschall huet d’Benotzung vu bestëmmte Mëttelen e bedeitende Schutzeffekt géint den Ofbau vun DNA gewisen. Zum Beispill schütze verschidde Polymeren, Peptiden a Lipiden d’Plasmid-DNA wärend der Ultraschallbehandlung.

D’Stabilitéit vu Plasmid-DNA a Plasmid-DNA/IL-Nanokomplexe géintiwwer Schéierbelaaschtung duerch Ultraschall gouf mat engem Agarosegel-Elektrophoresetest ënnersicht. Souwuel d’Plasmid-DNA wéi och d’Plasmid-DNA/IL-Nanokomplexe goufe fir verschidden Zäitraim enger Schéierbelaaschtung duerch Ultraschall ausgesat. D’Plasmid-DNA gouf fir 0, 10, 20, 30 a 40 Minutten enger Schéierbelaaschtung duerch Ultraschall ausgesat. D’Plasmid-DNA/IL-Nanokomplexe goufen dogéint fir 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 an 120 Minutten enger Schéierbelaaschtung duerch Ultraschall ausgesat.
(Etüd a Bild: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) hu gewisen, datt, wann d’Nanostrukturen aus Plasmid-DNA / ionescher Flëssegkeet (pDNA/IL) fir 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 an 120 min enger Schéierbelaaschtung duerch Ultraschall ausgesat a mam kommerziell verfügbare kationesche Gentransportmëttel Lipofectamine komplexéiert goufen, den Undeel u fluoreszenzpositive Zelle respektiv 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% a 50% war (kuckt d’Diagramm hei drënner). De Prozentsaz u fluoreszenzpositive Zellen ass geklommen, wann d’Nanostrukture fir 10 an 20 min enger Schéierbelaaschtung duerch Ultraschall ausgesat goufen, an ass duerno lues erofgaangen.

Afloss vun der ionescher Flëssegkeet [Bmim][PF6] op den Transport vu Plasmid-DNA a COS7-Zellen. Plasmid-DNA/IL-Nanokomplexen (ionesch Flëssegkeet) goufe fir bis zu 120 Minutten enger Schéierbelaaschtung duerch Ultraschall ausgesat a mat LA komplexéiert, éier se a COS7-Zellen abruecht goufen. D’Donnéeë weisen déi duerchschnëttlech Zuel (%) vu GFP-positive HeLa-Zellen, déi an 10 verschiddene mikroskopesche Siichtfelder gezielt goufen, an d’Experiment gouf e puer Mol op dräi verschiddenen Deeg duerchgefouert. (Etüd an Diagramm: ©Sarker et al., 2019)

Virbereedung vu Lysat mat Ultraschall

Protokoll fir d’Zelllys mat Ultraschall
Fänkt mat enger ugeräicherter Zellprouf un, déi mat enger Method fir d’Zelltrennung virbereet gouf (z. B. immunomagnéitesch Zelltrennung, fluoreszenzaktivéiert Zellsortéierung (FACS), Dichtgradientenzentrifugatioun, Immunodicht-Zellisoléierung).
D’Zellprouwe mussen e Volume u Lyspuffer enthalen, dee fir d’Zil vum Experiment an den Ultraschallapparat mat Sond gëeegent ass.
Hypotonesch Puffere gi bevorzugt, well si d’Zelllys mat Ultraschall verstäerken. Et ass wichteg, datt Zousazstoffer an d’Salzkonzentratioun op eng gëeegent Manéier agesat ginn.
Wielt Ären Apparat fir d’Ultraschalllys: Fir déi indirekt Ultraschallbehandlung vu Prouffläsch gi VialTweeter oder CupHorn recommandéiert. Fir Multiwell-Placken ass den UIP400MTP den idealen Ultraschallapparat. A fir déi klassesch Ultraschallbehandlung mat enger Sond sinn Ultraschallhomogenisatore wéi den UP100H oder den UP200Ht mat enger Mikrospëtzt am beschte gëeegent.
Protokoll fir d’Ultraschallbehandlung mat enger Sond: Taucht d’Sond vum Ultraschallapparat an de Proufvolume an engem Mikrozentrifugeréierchen a behandelt d’Prouf ongeféier 10 Sekonne laang mat Ultraschall. Jee no DNA-Prouf kéint d’Ultraschallbehandlung nach eng oder zwou Kéiere widderholl ginn. Déi néideg Ultraschallenergie, déi agekoppelt gëtt (Ws/mL), hänkt vun der Viskositéit vun der Prouf a vum DNA-Typ of. D’Ofkillung mat engem Äisbad an de Pulsatiounsmodus vum Ultraschallapparat hëllefen ze verhënneren, datt d’Prouf thermesch ofgebaut gëtt.
No der Ultraschalllys gëtt d’Prouf zentrifugéiert, fir d’Reschter am Pellet ofzetrennen (déi net lyséiert Zellen, Zellkären an net lyséiert Organellen enthalen)
Wann d’Prouf net direkt weider verschafft gëtt, kann se bei enger gëeegenter Temperatur gelagert ginn, fir hir Viabilitéit ze erhalen.

Ultraschallapparater fir d’DNA-Fragmentéierung

Hielscher Ultrasonics bitt verschidde Plattformen op Ultraschallbasis fir d’Fragmentéierung vun DNA, RNA a Chromatin un. Dës verschidde Plattformen ëmfaassen Ultraschallsonden (Sonotroden), Léisunge fir déi indirekt Ultraschallbehandlung fir d’gläichzäiteg Virbereedung vu Prouwen a méi Réiercher oder Multiwell-Placken (z. B. 96-Well-Placken, Mikrotiterplacken), Sonoreakteren an Ultraschall-Cuphornen. All Plattforme fir d’Schéiere vun DNA gi vu leeschtungsstaarken Ultraschallprozessoren mat ofgestëmmter Frequenz ugedriwwen, déi sech präzis steiere loossen a reproduzéierbar Resultater liwweren.

Ultraschallprozessore fir all Proufzuel a Proufgréisst

Mat de Multi-Prouf-Ultraschallapparater VialTweeter (fir bis zu 10 Reagenzréiercher) an UIP400MTP (fir Mikroplacken/ Multiwell-Placken) vun Hielscher kann d’Veraarbechtungszäit vun de Prouwen duerch eng intensiv a präzis steierbar Ultraschallbehandlung einfach reduzéiert ginn, wärend déi gewënschte Gréissteverdeelung an Ausbezuelung vun den DNA-Fragmenter erreecht ginn. D’DNA-Fragmentéierung mat Ultraschall mécht d’Schrëtt vun der Plasmidvirbereedung effizient, zouverlässeg a skaléierbar. Protokoller kënne linear vun enger op vill Prouwe skaléiert ginn, andeems konstant Ultraschallparameter ugewannt ginn.
Ultraschallapparater mat Sonde mat engem bis fënnef Fangere sinn ideal fir d’Virbereedung vu méi klenge Proufzuelen. D’Laborultraschallapparater vun Hielscher si mat verschiddene Leeschtungsniveauen disponibel, sou datt Dir den idealen Ultraschall-Desintegrator fir Är DNA-bezunnen Uwendung wiele kënnt.