Proteomikprotokoll: Kontaktfräi Ultraschallbehandlung verbessert d’Virbereedung vu Peptidprouwe fir MS
D’Bottom-up-Proteomik ass zu engem Grondpilier vun der moderner Biomarkerentdeckung, der Strukturbiologie an der klinescher Diagnostik ginn. Andeems si Proteinne virun der Analys mat Massespektrometrie (MS) a Peptide verdauen, kënne Fuerscher eng méi déif Sequenzofdeckung an eng méi zouverlässeg Quantifizéierung erreechen. D’Virbereedung vun héichkomplexe biologesche Prouwe fir MS bleift awer technesch usprochsvoll. Rezent methodesch Fortschrëtter weisen, wéi eng kontrolléiert Ultraschallbehandlung – speziell mam kontaktfräie VialTweeter Multi-Tube Sonicator an dem UIP400MTP Microplate Sonicator – dësen Aarbechtsoflaf däitlech vereinfache kann, d’Reproduzéierbarkeet verbessere kann an heefeg Engpäss bei den Apparater verhënnere kann.
Hei fannt Dir en detailléierte Protokoll fir d’Prouwevirbereedung, fir Peptide mat enger gëeegenter Gréisst fir d’Analys mat MS ze kréien.
Wie soll kontaktfräi Ultraschallbehandlung fir d’Virbereedung vu Peptidprouwe benotzen?
- Laboratoirë fir Bottom-up-Proteomik an Entdeckungsfuerschung: Fuerscher, déi héichkomplex Prouwe fir LC-MS- oder MALDI-Aarbechtsofleef virbereeden an eng gläichméisseg Peptidréckgewënnung mat héijer Ausbeut aus ënnerschiddleche biologesche Matricë brauchen.
- Benotzer vu S-Trap™ a Suspension Trapping: Ekippen, déi op d’Rengegung mat Mikrokolonne setzen an eng kontrolléiert Schéierfragmentéierung vun der DNA brauchen, fir d’Verstoppe vun de Kolonnen ze verhënneren an e reiwungslost Opluede vun de Prouwen an eng reiwungslos Verdauung ze garantéieren.
- Klinesch an translational Fuerschungsgruppen: Laboratoiren, déi Geweebe, Zellen, Plasma, Serum oder zerebrospinal Flëssegkeet verschaffen an deenen d’Reproduzéierbarkeet tëscht de Chargen an d’Integritéit vun de Prouwen entscheedend sinn.
- Ekippe fir quantitativ a geziilt MS: Laboratoiren, déi strikt Vergläichsstudien duerchféieren, bei deenen Ultraschallapparater mat Sond Risike vun enger Kräizkontaminatioun mat sech bréngen, déi d’Quantifizéierung vu Peptide mat gerénger Heefegkeet beanträchtege kéinten.
- Zentral Ariichtungen a Betriber mat héijem Prouwenduerchsaz: Gruppen, déi verschidde biologesch Replikater gläichzäiteg verschaffen a vun der Ultraschallbehandlung vu méi zouene Réiercher an engem Block mam VialTweeter profitéieren, déi d’Rengegung vun der Sond iwwerflësseg mécht, déi manuell Aarbechtszäit reduzéiert an aseptesch Bedéngungen oprechterhält.
- Fuerscher am Beräich vu PTMen a Proteinstrukturen: Fuerscher, déi eng schounend, temperaturkontrolléiert Veraarbechtung brauchen, fir labil Modifikatiounen ze erhalen an d’Sequenzofdeckung wärend der Zelllys an der Homogeniséierung ze maximéieren.
Ultraschallapparat fir méi Prouwen “VialTweeter” fir d’kontaktfräi Virbereedung vu Prouwen a méi zouene Fläschercher fir d’Proteomik
Iwwerbléck iwwer de Protokoll: Vu Geweebe an Zellen zu Peptiden, déi fir MS prett sinn
De wäit verbreete Bottom-up-Proteomik-Aarbechtsoflaf, dee vu Wojtkiewicz et al. beschriwwe gëtt, bitt eng robust, skaléierbar Method fir d’Virbereedung vu Peptidprouwen aus ënnerschiddleche biologesche Matricen. Ausgoend vu 50–100 mg schockgefruerem Geweebe oder 1–20 Milliounen Zellen integréiert de Protokoll d’Suspension-Trapping-Technologie (S-Trap™), fir Detergenten, Salzer a Veronrengegungen effizient virun der enzymatescher Verdauung ze entfernen.
No der Lys, der Proteinquantifizéierung, der Reduktioun an der Alkyléierung gëtt d’Prouf ugesaiert an op eng S-Trap™-Zentrifugatiounskolonn opgelueden, an där d’Verdauung mat Trypsin/lysC stattfënnt. Déi entstane Peptide ginn eluéiert, gedréchent an enger LC-MS-Analys ënnerzunn. Wann dësen Aarbechtsoflaf op 50 mg mënschlecht Häerzgeweebe applizéiert gëtt, liwwert en zouverlässeg genuch Peptide fir 30–40 Injektiounen, woubäi iwwer 4.000 eenzegaarteg Proteinne pro Analysduerchlaf identifizéiert ginn. Wärend d’Chimie an d’Rengegung mat Kolonne kloer definéiert sinn, hänkt den Erfolleg vun der Prozessketten staark vun den éischte Schrëtt vum physeschen Opschloss a vum Ëmgang mat der DNA of.
De Protokoll recommandéiert de VialTweeter Multi-Tube Sonicator fir d’Zellen duerch Ultraschall ze lyséieren an d’DNA duerch Schéierkräften ze fragmentéieren – béid Schrëtt sinn entscheedend fir d’Peptidanalys.
De VialTweeter behandelt zouen Eppendorf-Réiercher vun 1,0, 1,5 an 2,0mL souwéi verschidden NUNC-Fläschercher mat Ultraschall
Zell- a Geweebelys mat Ultraschall fir d’Proteinextraktioun
Am Bottom-up-Proteomik-Workflow ass d’Ultraschallbehandlung e Schlësselschrëtt bei der Lyse vun Zellprouwen, fir Proteinne fir déi uschléissend massenspektrometresch Analys ze extrahéieren. Nodeems SDS-Zelllysepuffer zum Zellpellet bäigefüügt gouf, ginn d’Prouwe mam VialTweeter Multi-Tube Sonicator mat Ultraschall behandelt. De Protokoll benotzt 1,5 mL Mikrozentrifugeréierer a gesäit vir, den Ultraschallapparat bei 30% Leeschtung jeeweils 10 Sekonnen anzeschalten an 10 Sekonnen auszeschalten, widderholl iwwer 3 Zyklen. No enger Waardezäit vun 1 Minutt gëtt den Zyklus nach zweemol widderholl. D’Prouwe gi kontinuéierlech mat Äis gekillt.
Dëse Prozess hëlleft net nëmme beim Opbrieche vun den Zellen, mee ass speziell néideg, fir déi genomesch DNA, déi bei der Lyse fräigesat gëtt, duerch Schéierkräften ze fragmentéieren. Eng effektiv DNA-Fragmentéierung duerch Schéierkräften ass entscheedend, fir d’Viskositéit vun de Prouwen ze reduzéieren an d’Verstoppe vun de S-Trap™-Kolonnen ze verhënneren, sou datt eng optimal Proteinnréckgewënnung an eng zouverlässeg uschléissend Peptidverdauung garantéiert sinn.
Déi entscheedend Roll vun der DNA-Fragmentéierung duerch Ultraschall-Schéierkräften
Ee vun den heefegste Problemer bei S-Trap™-baséierte Workflows ass d’Verstoppe vun de Kolonnen, dat bal ausschliisslech duerch genomesch DNA mat héijem Molekulargewiicht verursaacht gëtt, déi bei der Homogeniséierung vun Zellen oder Geweebe fräigesat gëtt. Intakt DNA erhéicht d’Viskositéit vun de Prouwen drastesch, hält Peptiden zeréck a blockéiert dat mikroporéist Sorbentbett vun der S-Trap™-Kolonn.
D’Ultraschallbehandlung léist dëse Problem, andeems si d’DNA mechanesch a kleng, léislech Fragmenter zerleet. Duerch d’Applikatioun vu kontrolléierter akustescher Energie fragmentéiert de VialTweeter Nukleinsaieren effizient duerch Schéierkräften, ouni iwwerméisseg Hëtzt ze produzéieren oder friem Veronrengegungen anzebréngen. Dës Reduktioun vun der Viskositéit garantéiert e reiwungslost Opluede vun de Prouwen, konstant Duerchflossraten an eng onënnerbrach Verdauungskinetik.
Optiméiert Ultraschallparameter fir de VialTweeter
De Protokoll leet en héich reproduzéierbaart Ultraschallbehandlungsschema fest, dat fir d’Integritéit vu biologesche Prouwen an d’Kompatibilitéit mat der uschléissender MS optiméiert ass. Fir Prouwen an 1,5mL Mikrozentrifugeréierer, déi mam kontaktlose Block-Ultraschallapparat Hielscher VialTweeter behandelt ginn, suergen déi follgend Parametere fir d’Lyse an eng optimal DNA-Fragmentéierung duerch Schéierkräften, wärend d’Proteinnstruktur erhale bleift:
- Amplitud: 30% Leeschtung
- Zyklusschema: 10 Sekonnen AGESCHALT / 10 Sekonnen AUSGESCHALT
- Dauer: 3 Zyklen (10sec AGESCHALT/10sec AUSGESCHALT) → 1 Minutt Rou op Äis → nach 2 Mol widderhuelen
- Temperaturkontroll: D’Prouwe gi wärend der Behandlung op Äis geluecht, fir thermesch Denaturéierung a virzäiteg enzymatesch Aktivitéit ze verhënneren
Dës gepulst Ultraschallbehandlung verhënnert lokal Iwwerhëtzung, miniméiert d’Oxidatioun vu Peptiden a garantéiert eng gläichméisseg akustesch Belaaschtung an alle Prouwefläschen. Den Opbau mat zouene Réierer eliminéiert och d’Noutwendegkeet, d’Sond tëscht de Prouwen ze botzen, a reduzéiert domat drastesch déi aktiv Aarbechtszäit an d’Variabilitéit tëscht de Bedreiwer.
Wichteg Virdeeler fir modern Proteomik-Workflows
D’Integratioun vum VialTweeter an Är Bottom-up-Proteomik-Prozesskette bitt verschidde praktesch a wëssenschaftlech Virdeeler:
- Gläichméisseg DNA-Fragmentéierung: Eng gläichméisseg Iwwerdroung vun akustescher Energie an all Prouwefläsche garantéiert eng reproduzéierbar Reduktioun vun der Viskositéit a verhënnert Variabilitéit tëscht de Chargë beim Opluede vun de S-Trap™-Kolonnen.
- Erhale vu labille Modifikatiounen: D’Behandlung bei niddreger Temperatur an engem Äisbad schützt posttranslational Modifikatiounen (PTMs) a verhënnert eng duerch Hëtzt ausgeléiste Proteinnaggregatioun wärend der Zelllyse.
- Vereinfacht uschléissend Veraarbechtung: Lysater, déi mam VialTweeter behandelt goufen, kënnen direkt duerch Zentrifugatioun gekläert an ouni zousätzlech Rengegungsschrëtt quantifizéiert ginn, wat de Wee zur S-Trap™-Verdauung beschleunegt.
- Skaléierbarkeet a Flexibilitéit: Déi selwecht Ultraschallastellunge gëlle souwuel fir héichkomplex Geweebeprouwe wéi och fir Zellsuspensiounen an ënnerstëtze Workflows fir d’Entdeckungsproteomik, d’geziilt Quantifizéierung an d’Glykoproteomik. D’Mikroplacken-Ultraschallapparater vun Hielscher erméiglechen eng einfach Skaléierung op grouss Proufzuelen a Multiwell-Placken.
De kontaktlose Multi-Tube Sonicator VialTweeter kann a Killschief bedriwwe ginn
Ultraschallapparater fir d’Virbereedung vu Proteomik-Prouwen
D’Virbereedung vu qualitativ héichwäertege Peptidprouwe fir d’Massespektrometrie erfuerdert méi wéi eng effizient Lys – si verlaangt eng präzis Kontroll vun der DNA-Scherung, der Temperatur an der Vermeidung vu Kontaminatiounen. Wann Dir den Hielscher VialTweeter an Äre Bottom-up-Proteomik-Workflow integréiert, kënnt Dir d’Verstoppe vun de S-Trap™-Saile verhënneren, eng reproduzéierbar Proteinausbezuelung garantéieren an déi fir empfindlech MS-Analysen erfuerderlech Rengheet erhalen. Egal ob Dir mënschlecht Geweebe, kultivéiert Zellen oder komplex Lysater verschafft, d’Ultraschallbehandlung am Block bitt déi Zouverlässegkeet, Skaléierbarkeet a Prozesskontroll, déi modern Proteomik-Laboratoirë verlaangen.
Fir op méi héich Proufzuelen ze skaléieren, profitéiert vun de fokusséierten, kontaktlose Mikroplacke-Sonikatore vun Hielscher, de Modeller UIP400MTP an UIP550MTP! Verschafft all Standard-Multiwell-Plack fir Proteomik mat héijem Proufduerchsaz!
Veraarbechtung a verschlossene Réier am Verglach mat traditionelle Sondesonikatoren
Traditionell hu Fuerscher fir d’DNA-Scherung op Sondesonikatore mat direktem Kontakt zeréckgegraff. Och wa si effektiv sinn, brénge Sondesystemer e puer kritesch Aschränkunge fir Proteomik-Workflows mat sech:
- Risiko vu Kräizkontaminatioun: Wann eng Sond fir méi Prouwe benotzt gëtt, féiert dat zur Iwwerdroung vun Aerosolen a bréngt Kontaminanten tëscht de Prouwen an, déi quantitativ MS-Resultater verfälschen.
- Proufverloscht: D’direkt Aféierung kann zu Sprëtzen, Verdampfung an dem Unhafte vu wäertvolle Peptiden un der Sondenuewerfläch féieren.
- Botzen: Eng grëndlech Dekontaminatioun vun der Sond tëscht den Duerchleef ass zäitopwänneg an dacks onvollstänneg, wat Studie vu Proteinen a gerénger Heefegkeet beanträchtegt.
De VialTweeter-Blocksonikator verschafft d’Prouwe ganz a verschlossene Mikrozentrifugeréier. Dës Konstruktioun als zouene System eliminéiert de Kontakt tëscht Sond a Prouf, verhënnert d’Bildung vun Aerosolen an erhält strikt aseptesch Bedéngunge wärend der ganzer Homogeniséierung a Lys. Fir Laboratoiren, déi héichkomplex Geweebslysater oder méi Zelllinne verschaffen, bedeit dat méi reng MS-Donnéeën, eng méi héich Peptidausbezuelung a méi zouverlässeg biologesch Replikater.
Skaléierung op d’Proufvirbereedung mat héijem Duerchsaz a Multiwell-Placken
Mat de Mikroplacke-Sonikatore vun de Modeller UIP400MTP an UIP550MTP kann d’Veraarbechtung a Réier einfach op d’Proufveraarbechtung mat héijem Duerchsaz an all Standard-Multiwell-Plack skaléiert ginn.
Multiwell-Placke-Sonikator UIP400MTP fir d’Proteinextraktioun aus Prouwe mat héijem Duerchsaz
Heefeg gestallte Froen iwwer d’Ultraschallbehandlung fir d’Virbereedung vu Peptidprouwen
Firwat ass eng Ultraschallbehandlung virun der S-Trap™-Peptidveraarbechtung erfuerderlech?
Eng Ultraschallbehandlung ass néideg, fir déi héichmolekular genomesch DNA ze scheren, déi bei der Zell- oder Geweebslys fräigesat gëtt. Intakt DNA erhéicht d’Viskositéit vun de Prouwen drastesch, wat d’S-Trap™-Mikrosail verstoppen a Peptide festhale kann, wouduerch d’Ausbezuelung an d’MS-Kompatibilitéit staark reduzéiert ginn.
Wéi verbessert de VialTweeter-Blocksonikator d’Proufvirbereedung am Verglach mat traditionelle Sondesonikatoren?
Am Géigesaz zu Sondesonikatore mat direktem Kontakt, déi tëscht den Duerchleef suergfälteg gebotzt musse ginn an e Risiko vun Aerosoliwwerdroung mat sech bréngen, verschafft de VialTweeter d’Prouwe ganz a verschlossene Proufgefässer a Mikrozentrifugeréier. Dës Konstruktioun mat verschlossene Réier eliminéiert Kräizkontaminatiounen, verhënnert Proufverloscht an erhält strikt aseptesch Bedéngunge wärend der ganzer Homogeniséierung an Zelllys.
Wat sinn déi optimal Ultraschallparameter fir d’Proteomik-Proufvirbereedung?
Fir biologesch Prouwe wéi Zellen a Geweebe gesäit de recommandéierte Protokoll e VialTweeter-Sonikator bei 30% Leeschtung mat engem Zyklus vun 10 Sekonnen un / 10 Sekonnen aus vir, deen 3 Mol widderholl gëtt. D’Prouwe solle wärend der Veraarbechtung op Äis gehale ginn, an den Zyklus soll nach zweemol widderholl ginn, wa ≥5 Milliounen Zelle verschafft ginn. (cf. Wojtkiewicz et al., 2021)
Wat soll ech maachen, wa meng S-Trap™-Sail beim Luede vun der Prouf verstoppt?
D’Verstoppe vun der Sail gëtt typescherweis duerch eng héich DNA-Viskositéit oder eng net genuch grëndlech Klärung verursaacht. Fir dëst ze behiewen, zentrifugéiert Äert Lysat virum Pipettéiere grëndlech a stellt sécher, datt d’DNA duerch Ultraschallbehandlung genuch geschéiert gëtt.
Wéi profitéiere quantitativ Proteomik-Workflows vun der kontaktloser Ultraschallbehandlung?
A quantitative Studie kënne souguer Spuere vu Kräizkontaminatioun tëscht Prouwen d’Miessunge vu Peptiden, déi a gerénger Quantitéit virkommen, verfälschen. D’Veraarbechtung vu méi Prouwen am VialTweeter a verschlossene Réiercher mécht d’Aféiere vun enger Sond iwwerflësseg, garantéiert d’Reproduzéierbarkeet vu Charge zu Charge an erhält d’Integritéit vun de Prouwe fir genee vergläichend Analysen.
Wéi eng Proteinausbeut a wéi eng Déift vun der MS-Analys kann ech vun dësem Protokoll erwaarden?
Ausgoend vu 50 mg mënschlechem Häerzgeweebe oder 5 Milliounen Zelle liwwert de S-Trap™-Workflow typescherweis genuch Peptide fir 30–50 LC-MS-Injektiounen, woubäi konsequent iwwer 4.000 eenzegaarteg Proteine pro Duerchlaf identifizéiert ginn. (vgl. Wojtkiewicz et al., 2021)
Literatur / Referenzen
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
- Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
- Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.
Hielscher Ultrasonics liwwert leeschtungsstaark kontaktlos Ultraschallapparater fir d’Prouwevirbereedung a klinesch Analysen. Den Ultraschallapparat UIP400MTP fir Multiwell-Placken, de VialTweeter, de CupHorn an den Duerchfloss-Ultraschallapparat GDmini2 verschaffen d’Prouwen, ouni se ze beréieren.