Ultraschallbehandlung a Mikroplacken an der Shotgun-Proteomik – Uwendungsnotiz

D’Shotgun-Proteomik ass op eng effizient, reproduzéierbar Proufopbereedung ugewisen, fir komplext biologescht Material a Peptiden ëmzewandelen, déi fir LC-MS/MS prett sinn. De Mikroplacken-Ultraschallapparat UIP400MTP ënnerstëtzt dëse Prozess, andeems en eng standardiséiert, parallel Ultraschallbehandlung vu Prouwe mat klenge Volumenen erméiglecht. Domat hëlleft en de Laboratoiren, den Opschloss, d’Extraktioun an d’erneit Opléisung an Aarbechtsofleef op Basis vu Mikroplacken ze verbesseren. Dës Uwendungsnotiz beschreift, wéi den UIP400MTP an d’proteomesch Proufopbereedung integréiert ka ginn, a benotzt dobäi e publizéierten Aarbechtsoflaf fir extrazellulär Vesikelen aus PLA2G12A/Th17-Studien als Beispill, dat am Laboratoire getest gouf.

Ultraschallbehandlung a Mikroplacke fir eng méi reproduzéierbar Shotgun-Proteomik

Fir Fuerscher an der Proteomik ass eng reproduzéierbar Proufopbereedung entscheedend fir héichwäerteg LC-MS/MS-Daten. De Mikroplacken-Ultraschallapparat UIP400MTP ënnerstëtzt eng standardiséiert, parallel Ultraschallbehandlung an Aarbechtsofleef op Basis vu Placken an an Aarbechtsofleef mat klenge Volumenen an héijem Duerchsaz.

En ass besonnesch nëtzlech fir Laboratoiren, déi mat Folgendem schaffen:

• Grouss Proufserien, déi eng eenheetlech Veraarbechtung iwwer vill Kavitéiten ewech erfuerderen
• Material mat limitéierter Ausgangsquantitéit, bei deem de Proufverloscht an d’Variabilitéit miniméiert musse ginn
• Lipidräich Prouwen, wéi extrazellulär Vesikelen
• Komplex biologesch Preparatiounen, déi en effizienten Opschloss, eng effizient Extraktioun oder eng effizient erneit Opléisung erfuerderen
• Vergläichend Shotgun-Proteomik, bei där d’Reproduzéierbarkeet iwwer verschidde Bedéngungen a Replikater ewech wesentlech ass

Andeems si d’Ultraschallbehandlung a Mikroplacke virun der enzymatescher Spaltung integréieren, kënne Fuerscher d’Prouwe besser op Follgendes virbereeden:

• Proteinextraktioun an erneit Opléisung
• Spaltung mat Trypsin/Lys-C
• Nano-LC/MS/MS-Datenerfaassung
• Nogelagert quantitativ Proteomikanalys

D’Ultraschallbehandlung a Mikroplacke kann nëtzlech si fir:

• Zentral Proteomikservicer
• EV-Fuerschungslaboratoiren
• Laboratoirë fir Immunologie an Zellbiologie
• Translational Fuerschungsgruppen
• Ekippen an de Liewenswëssenschaften, déi vun der Opbereedung vun eenzele Prouwen op Aarbechtsofleef mat méi héijem Duerchsaz iwwergoen

Proufopbereedung mat héijem Duerchsaz fir d’Proteomanalys vun extrazelluläre Vesikelen

Wat ass Shotgun-Proteomik?

D’Shotgun-Proteomik ass zu enger zentraler analytescher Strategie fir d’Charakteriséierung vu komplexe biologesche Prouwe ginn, vu Lysater vu ganzen Zellen a Geweebeextrakter bis zu gereinegten Organellen, extrazelluläre Vesikelen a klinesche Prouwe mat gerénger Ausgangsquantitéit. Hir Haaptstäerkt läit an der Kopplung vu Proteinspaltung, héichopléisender Flëssegchromatographie-Tandem-Massespektrometrie an der rechnergestëtzter Ofleedung vu Proteinen aus Peptiden. D’Qualitéit vum definitiven Proteomdatesaz gëtt awer scho laang bestëmmt, éier d’Prouf de Massespektrometer erreecht. En effiziente Proufopschloss, d’Opléisung vu Proteinen, d’Ewechhuele vu stéierende Substanzen, eng reproduzéierbar enzymatesch Spaltung an eng robust Peptidréckgewënnung sinn all entscheedend fir d’Déift vun der Proteomofdeckung an d’quantitativ Zouverlässegkeet.
Fir Fuerscher an der Proteomik a Laboratoiren an de Liewenswëssenschaften, déi mat limitéierten oder wäertvolle Prouwe schaffen, ass d’Proufopbereedung dacks den Enkpass.

D’Erausfuerderung vun extrazelluläre Vesikelen an der Proteomik

Extrazellulär Vesikelen (EVen) stellen zum Beispill eng besonnesch usprochsvoll Klass vu Prouwen duer. Et si membrangebonnen, lipidräich Partikelen am Nanomoossstaf mat enger relativ gerénger Proteinausbeut an engem héije Potenzial fir d’Verschleefung vu Lipiden, Salzer, Detergenzien, Serumproteinen an anere Matrixkomponenten. Dës Eegenschafte kënnen d’Effizienz vun der Verdauung, d’chromatographesch Leeschtung, d’Elektrospraystabilitéit an d’Peptididentifikatioun beanträchtegen. En Aarbechtsoflaf fir d’Prouwevirbereedung an der EV-Proteomik muss dofir staark genuch sinn, fir Vesikelstrukturen opzebriechen an d’Proteinfracht ze solubiliséieren, a gläichzäiteg mat der uschléissender enzymatescher Verdauung an der LC-MS/MS-Analys kompatibel bleiwen.
An dësem Kontext bitt eng mat Mikroplacke kompatibel Ultraschallbehandlung eng praktesch Approche fir eng reproduzéierbar, paralleliséiert Prouweveraarbechtung. D’Hielscher Mikroplacken-Ultraschallapparater UIP400MTP (400 W) an UIP550MTP (550 W) si fir d’Ultraschallbehandlung vu Prouwen a Multiwell-Placken a Gefäässer mat klengem Volumen entwéckelt a ënnerstëtzen Aarbechtsofleef mat engem méi héije Prouwenduerchsaz wéi konventionell Ultraschallapparater mat enger eenzeger Sond. Fir Proteomiklaboratoiren ass dëst Format attraktiv, well et d’Variabilitéit duerch manuell Aarbecht reduzéiere kann, d’parallel Behandlung vu méi Prouwe verbessere kann a sech méi natierlech a plackebaséiert Prouwevirbereedungsofleef integréiere léisst.

Beispill vun engem Aarbechtsoflaf

E rezenten Aarbechtsoflaf fir d’Proteomik vun extrazelluläre Vesikelen an der PLA2G12A-gedriwwener Th17-Zellbiologie bitt en nëtzlecht, am Labo getest Beispill dofir, wéi de Mikroplacken-Ultraschallapparat UIP400MTP an d’Prouwevirbereedung fir d’Shotgun-Proteomik integréiert ka ginn. An där Studieserie goufen EV-Prouwe fir d’Proteomanalys mat Methanol behandelt, mam UIP400MTP mat Ultraschall behandelt, zentrifugéiert, gedréchent, mat Trypsin/Lys-C verdaut a mat Nano-Flow-LC gekoppelt un héichopléisend Tandem-MS analyséiert. D’biologesch Aarbecht gouf 2026 vu Mochizuki-Ono a Kolleegen publizéiert, woubäi d’Proteomikanalys gehollef huet ze charakteriséieren, wéi PLA2G12A d’Proteine vun der EV-Fracht am Kontext vu pathogenen T-Zellreaktioune verännert.

Ultraschallapparat UIP400MTP fir Multiwell-Placken

Firwat Ultraschallbehandlung a Mikrotiterplacken?
Den UIP400MTP erméiglecht eng standardiséiert, parallel Ultraschallbehandlung vu Prouwe mat klenge Volummen. Dat ass nëtzlech, wann d’Reproduzéierbarkeet, eng kleng agesate Proufquantitéit an den Duerchsaz bei der Veraarbechtung vu ville Prouwe wichteg sinn.


Checklëscht fir d’Qualitéitskontroll

• Bestätegt, datt fir all Prouwen déiselwecht EV-Ausgangsquantitéit op Basis vum Proteinäquivalent agesat gëtt.
• Benotzt randomiséiert oder equilibréiert Uerdnunge fir d’Proufveraarbechtung.
• Halt de Methanolvolume, d’Dauer vun der Ultraschallbehandlung, d’Dréchnungszäit an de Verdauungsvolume konstant.
• Iwwerwaacht d’Peptidausbeut an d’Gesamtzuel vun de Proteinidentifikatiounen.
• Kontrolléiert den Taux vun net erfollegte Spaltungen an d’Verdeelung vun de Peptidlängten.
• Iwwerpréift d’Form vun de chromatographesche Peaken an d’Reproduzéierbarkeet vun de Retentiounszäiten.
• Huelt Leerprouwe mat op, fir d’Verschleefung ze iwwerwaachen.
• Benotzt fir méi grouss Studie gepoolt QC-Prouwen.
• Evaluéiert de Variatiounskoeffizient vun de Replikater.
• Benotzt PCA oder verwandte Methoden, fir Chargeneffekter oder Ausräisserprouwen z’identifizéieren.

Recommandatioune fir d’Protokolléierung

Wann Dir dësen Aarbechtsoflaf publizéiert oder dokumentéiert, gitt d’EV-Ausgangsquantitéit, d’Plackeformat, de Methanolvolume, d’Amplitude an d’Dauer vun der Ultraschallbehandlung mam UIP400MTP, d’Zentrifugatiounsbedéngungen, d’Dréchnungsmethod, de Verdauungspuffer, d’Enzymkonzentratioun, d’Verdauungszäit, d’Bedéngunge fir d’Usaiere, d’LC-MS/MS-Plattform, den Erfaassungsmodus, d’Softwareversioun, d’Datebank, de FDR-Schwellwäert, d’Normaliséierungsmethod an de statisteschen Aarbechtsoflaf un.
All Mikroplacken-Ultraschallgeräter vun Hielscher späicheren automatesch wichteg Prozessparameter wéi d’Amplitud, d’Dauer vun der Ultraschallbehandlung an d’Temperatur mat engem Datums- an Zäitstempel als CVS-Datei op der integréierter SD-Kaart. D’Protokolléiere vun Date fir d’Reproduzéierbarkeet an d’Qualitéitskontroll war nach ni méi einfach!

D’Etüd am Detail: EV-Shotgun-Proteomik an der PLA2G12A-Etüd

D’PLA2G12A-Studie liwwert e konkret Beispill fir den Asaz vum UIP400MTP an engem Shotgun-Proteomik-Workflow. Déi biologesch Fro war, wéi déi sekretéiert Phospholipase PLA2G12A extrazellulär Vesikelen, déi vun Th17-Zellen ofstamen, verännert an doduerch d’Differenzéierung vu pathogenen T-Zellen beaflosst. D’Auteuren hu gewisen, datt PLA2G12A op EV-Membranen awierkt, fir Lysophospholipiden, dorënner 1-Oleoyl-Lysophosphatidylethanolamin, ze produzéieren, an datt déi nogeschalt Signalvermëttlung duerch Lysophosphatidsaier iwwer LPA2 zur Th17-Differenzéierung bäidréit. Nieft der Lipidsignalvermëttlung hunn d’Studien och den Inhalt vun den EVen ënnersicht, dorënner den RNA- a Proteingehalt, wouduerch d’Shotgun-Proteomik e wichtege Bestanddeel vun der Charakteriséierungsstrategie war.
Am Workflow fir d’EV-Preparatioun goufen Th17-Zellen an engem Medium kultivéiert, dat fetalt Rënnerserum enthale huet, aus deem d’Exosome gréisstendeels ewechgeholl gi waren. D’Kulturiwweränn goufe fir d’éischt zentrifugéiert, fir Zellen ze entfernen, duerch en 0,22 µm-Filter filtréiert, duerch Ultrafiltratioun/Ultrazentrifugatioun konzentréiert, gewäsch, a PBS resuspendéiert a mat engem BCA-Proteinassay quantifizéiert. Dës virgeschalt EV-Preparatioun huet séchergestallt, datt eng definéiert Quantitéit un EV-Material op Basis vum Proteinäquivalent an de Proteomik-Workflow konnt iwwerholl ginn.
Fir d’Shotgun-Proteomikanalys hunn d’Auteuren EV-Prouwe benotzt, déi 5 µg Proteinäquivalenter entsprach hunn. Dës Prouwe goufen a PCR-Réiercher gedréchent, an et goufe 25 µL Methanol dobäigesat. D’Prouwe goufen duerno mam UIP400MTP-Mikroplacke-Sonikator fir 3 Minutte mat Ultraschall behandelt. No der Ultraschallbehandlung goufen d’Prouwe bei 4°C fir 20 Minutte bei 19.000 × g zentrifugéiert. Nodeems 20 µL vum Iwwerstand ewechgeholl gi waren, goufen d’Prouwe bis zur Dréchent zentrifugéiert. D’Proteinne goufen duerno duerch Ultraschallbehandlung a 4 µL Trypsin/Lys-C-Léisung mat enger Konzentratioun vun 100 ng/µL a 50 mM Ammoniumhydrogencarbonat opgeléist. D’Verdauung gouf fir 2 Stonne bei 37°C ënner Rësele bei 300 rpm duerchgefouert. De Verdauungsusaz gouf mat 1 µL 1,25% Trifluoressigsaier ugesaiert an duerch Nano-Flow-LC gekoppelt mat héichopléisender Tandem-Massespektrometrie analyséiert.
Dëse Workflow illustréiert verschidden nëtzlech Prinzippie fir d’EV-Proteomik mat wéineg Ausgangsmaterial. Éischtens gouf d’Ausgangsquantitéit op Basis vum Proteinäquivalent normaliséiert, wat wichteg ass, wann EVe vu verschiddene Genotyppen oder Behandlunge verglach ginn. Zweetens gouf virun der Ultraschallbehandlung Methanol benotzt, wat den Opschloss an d’Extraktioun ënnerstëtzt huet, wärend Detergenzsystemer vermidde goufen, déi d’LC-MS/MS erschwéiere kënnen. Drëttens war den Ultraschallschrëtt kuerz a standardiséiert, wat mat enger paralleller Proufveraarbechtung kompatibel ass. Véiertens gouf d’Trypsin/Lys-C-Verdaung an engem ganz klenge Volumen duerchgefouert, wat d’Verdënnung reduzéiert an d’Réckgewënnung vu Peptide bei wéineg Ausgangsmaterial ënnerstëtzt huet. Schlussendlech huet den direkten Iwwergank vun der Verdauung zur Usai erung an zur LC-MS/MS onnéideg Handhabungsschrëtt miniméiert.
Déi nogeschalt LC-MS/MS-Method huet eng Nano-Flow-Ëmkerphasentrennung benotzt, déi mat engem Q-Exactive HF Orbitrap-Massespektrometer gekoppelt war. D’Prouwe goufen op enger C18-Virsaile zeréckgehalen an duerno op enger analytescher Sail mat engem bannenzegen Duerchmiesser vu 50 µm bei 200 nL/min a 40°C getrennt. De Gradient ass iwwer 60 Minutte vun engem nidderegen Undeel un organeschem Léisungsmëttel op 35% Léisungsmëttel B eropgaangen, gefollegt vun enger Wäschung mat engem héijen Undeel un organeschem Léisungsmëttel an enger Reequilibréierung. D’MS-Datenerfaassung gouf am Positivionemodus mat datenonofhängeger Erfaassung a kollisiounsinduzéierter Dissoziatioun bei méi héijer Energie duerchgefouert. D’DIA-Réidateie goufe mat DIA-NN 1.8 an enger in silico virausgesoter Spektralbibliothéik analyséiert.