細胞溶解のための超音波処理細胞破砕と抽出
超音波細胞溶解は、現代のバイオテクノロジー研究室で広く応用されているサンプル調製技術である。その主な目的は、タンパク質、核酸、オルガネラなどの細胞内成分を放出するために、細胞膜または細胞全体を破壊することである。日常的なラボ作業において、超音波処理は、制御された細胞破砕と生体分子の効率的な抽出のための標準的な方法であることを意味する。ソニケーターの主な利点は、超音波強度、脈動、温度制御などの重要なプロセスパラメーターを正確に調節できることにあります。この制御により、研究者は、繊細な生体分子への熱的または機械的損傷を最小限に抑えながら、信頼性の高い溶解を達成し、穏やかでありながら非常に効率的な抽出プロセスを実現することができる。
ソニケーターによる細胞溶解
超音波細胞溶解は、音響キャビテーションを利用して細胞膜を破壊し、細胞内分子を放出します。Hielscher Ultrasonics社は、従来のプローブタイプのソニケーターだけでなく、無菌処理用のマルチサンプルソニケーター（複数のチューブやバイアル用のVialTweeterと標準マイクロプレート用の96ウェルプレートソニケーターUIP400MTP）も提供しています。
Hielscher Ultrasonics社は、サンプル前処理や臨床分析用の強力な非接触ソニケーターを提供しています。 マルチウェルプレートソニケーター UIP400MTP, ヴァイアル・ツイーター, カップホーン およびGDmini2フローソニケーター 無菌状態でサンプルを処理する。
超音波ホモジナイザー UP100H（100ワット）とUP400St（400ワット）：細胞溶解と抽出のための超音波処理。
細胞溶解・抽出用超音波ホモジナイザー
| 超音波装置タイプ | アプリケーション・フォーカス | サンプル量 | 典型的な使用例 | メリット | モデル例 |
|---|---|---|---|---|---|
| プローブ型ソニケーター | 単一サンプル超音波処理 | 0.1 mL～～1000 mL | 細胞溶解、タンパク質抽出、DNA/RNA断片化 | 精密なエネルギー制御、各種ソノトロード、小～中程度のサンプルに最適 | UP100H, UP200St, UP400ST |
| バイアルツイーター／カップホーン | 複数の密封バイアルの並列処理 | 8～10バイアル（～1～20mLずつ） | 複数の細胞懸濁液の標準化された溶解 | 均一な超音波処理、交差汚染の回避、再現性のある結果 | バイアルツイーター, カップホーン |
| 96ウェルプレートソニケーター | マルチウェルおよびマイクロタイタープレートの超音波処理 | マイクロプレートフォーマット | ハイスループットスクリーニング、プロテオミクス、細胞アッセイ | マルチサンプルワークフローに最適。 | UIP400MTP |
| フローセルリアクター | より大量の連続超音波処理 | >1 L、スケーラブル | 工業規模の細胞破砕、エキス生産 | 連続処理、スケーラブル、フルプロセス制御（振幅、圧力、温度） | UIP1000hdT, UIP2000hdT + フローセル |
| 無菌 / 間接超音波処理システム | 汚染のないサンプル処理 | バイアル/チューブ/マイクロプレートに依存 | 高感度サンプル、無菌環境、規制環境 | プローブが接触しないため、キャリーオーバーがなく、クリーニングの手間が最小限 | バイアルツイーター, カップホーン, UIP400MTP |
細胞溶解にソニケーションを使用する利点
他の細胞溶解・抽出法と比べて、超音波細胞溶解にはいくつかの利点がある：
- スピードだ： 超音波による細胞溶解と抽出は、ほんの数秒で細胞を破砕できる高速の方法である。これは、ホモジナイズ、凍結融解、ビーズミルなどの他の方法よりもはるかに速い。
- 効率が良い： 超音波による細胞溶解と抽出は、小さなサンプル、大きなサンプル、複数のサンプルを一度に処理できるため、小さなサンプルを個別に処理する必要がある他の方法よりも効率的である。
- ケミカルフリー:超音波による細胞溶解と抽出は、刺激の強い化学薬品や酵素を使用する必要のない非侵襲的な方法です。そのため、細胞内容物の完全性を維持する必要があるアプリケーションに最適です。サンプルの不要な汚染を避けることができます。
- 高い利回り： 超音波による細胞溶解と抽出は、DNA、RNA、タンパク質を含む細胞内容物を高収率で抽出することができる。これは、高周波の音波が細胞壁を破り、内容物を周囲の溶液中に放出するからである。
- 温度管理： 洗練された超音波ソニケーターは、サンプルの正確な温度制御を可能にします。Hielscher社のデジタルソニケーターは、プラグイン可能な温度センサーと温度モニタリングソフトウェアを装備しています。
- 再現可能： 超音波細胞溶解のプロトコールは簡単に再現でき、単純なリニアスケールアップにより、異なるサンプル量の大小に合わせることもできる。
- 万能だ： 超音波細胞溶解・抽出は、バクテリア、酵母、真菌、植物、哺乳類細胞など、幅広い種類の細胞の抽出に使用できる。また、タンパク質、DNA、RNA、脂質など、さまざまな種類の分子の抽出にも使用できる。
- 多数のサンプルの同時調製 Hielscher Ultrasonics社は、多数のサンプルを全く同じプロセス条件で快適に処理するためのいくつかのソリューションを提供しています。これにより、溶解と抽出のサンプル前処理工程が非常に効率的になり、時間を節約できます。
- 使いやすい： 超音波細胞溶解・抽出装置は使いやすく、最小限のトレーニングしか必要としない。また、廃棄物の再購入の必要がなく、1回の投資で済むため経済的である。そのため、幅広い研究者やラボにとって魅力的な装置となっている。
全体として、超音波による細胞溶解と抽出は、細胞内容物を抽出するための、高速で効率的、かつ精密に制御可能で汎用性の高い方法である。他の方法と比較して優れているため、幅広い研究および産業応用において魅力的な選択肢となる。
超音波細胞溶解の原理
超音波による細胞溶解と抽出は、高周波の音波を使用して細胞を破壊し、その内容物を抽出する。音波は周囲の液体に圧力変化を生じさせ、キャビテーションとして知られるプロセスで小さな気泡を形成・崩壊させる。これらの気泡は局所的に非常に強い機械的な力を発生させ、細胞を破砕して内容物を周囲の溶液中に放出する。
超音波破砕機を用いた細胞破砕には、一般的に以下のステップが含まれる：
- サンプルは液体バッファーの入ったチューブまたは容器に入れられる。
- 超音波プローブを試料に挿入し、約20～30kHzの高周波を印加する。
- 超音波は周囲の液体に振動とキャビテーションを引き起こし、局所的な力を発生させて細胞を破り、内容物を放出する。
- サンプルは遠心分離または濾過して細胞の残骸を除去し、抽出された内容物は下流の分析のために回収される。
一般的な溶解法の欠点
研究室での作業中、従来の機械的または化学的溶解プロトコルを用いた細胞溶解の煩わしさを既に経験しているかもしれない。
- 機械的溶解： 乳鉢と乳棒を使った粉砕や、フレンチプレス、ビーズミル、ローター・ステーター・システムを使ったホモジナイズなどの機械的溶解法には、精密なコントロールや調整オプションがないことが多い。このため、粉砕や剪断力がすぐに発生し、サンプルにダメージを与えたり、タンパク質を変性させたりする可能性がある。また、時間がかかり、大量の出発物質を必要とすることもある。
- 化学溶解： 洗剤ベースの溶解のような化学的溶解法は、脂質二重層を破壊し、タンパク質を変性させることにより、サンプルにダメージを与える可能性がある。また、複数の工程を必要とし、下流のアプリケーションを妨害する汚染物質が残留する可能性もある。洗剤の最適投与量を見つけることは、さらなる課題である。
- 凍結融解サイクル： 凍結融解サイクルは細胞膜の破裂を引き起こすが、繰り返されるサイクルはタンパク質の変性や分解を引き起こすこともある。また、この方法では何度もサイクルを繰り返す必要があり、時間がかかるだけでなく、収率も低くなることが多い。
- 酵素的溶解： 酵素的溶解法は、特定の細胞タイプに特有である可能性があり、複数のステップを必要とするため、時間がかかる。また、廃棄物が発生し、サンプルの劣化を避けるために注意深く最適化する必要がある。酵素溶解キットは高価であることが多い。現在使用している酵素溶解法で十分な結果が得られない場合、相乗的な方法として超音波処理を適用し、細胞破砕を強化することができる。
従来の機械的・化学的細胞溶解法とは対照的に、超音波処理は非常に効率的で信頼性の高い細胞破砕ツールであり、超音波処理のパラメーターを完全にコントロールすることができます。これによって、物質の放出と生成物の純度に高い選択性が保証される。[Balasundaramら、2009参照）。
あらゆる種類の細胞に適しており、小規模から大規模まで容易に適用できる。 – 常に管理された条件下で。超音波ホモジナイザーは洗浄が簡単です。超音波ホモジナイザーは、常にクリーンインプレイス(CIP)と滅菌インプレイス(SIP)機能を備えています。ソノトロードは巨大なチタン製ホーンで構成され、水または溶剤で拭き取りまたは洗浄することができます（作動媒体による）。超音波装置のメンテナンスは、その堅牢性によりほとんど必要ありません。
超音波による溶解と細胞破壊
一般に、ラボでのサンプルの溶解には15秒から2分かかる。超音波処理の強度は、適切な装置を選択するだけでなく、振幅の設定や超音波処理時間によって非常に簡単に調整できるため、細胞の構造や溶解の目的に応じて、細胞膜を非常に穏やかに破壊することも、急激に破壊することも可能である（例えば、DNA抽出にはよりソフトな超音波処理が必要であり、バクテリアの完全なタンパク質抽出にはより強力な超音波処理が必要である）。プロセス中の温度は、内蔵の温度センサーでモニターでき、冷却（アイスバスまたは冷却ジャケット付きフローセル）またはパルスモードの超音波処理によって容易に制御できる。パルスモード超音波処理では、1～15秒の短い超音波処理バーストサイクルにより、より長い断続時間中の放熱と冷却が可能です。
すべての超音波駆動プロセスは完全に再現可能で、直線的に拡張できる。
ヴァイアル・ツイーター は、多数のサンプルを同時に、均一かつ迅速に無菌調製するための超音波ホモジナイザーです。
- 細胞懸濁液の調製：細胞ペレットは、ホモジナイズして緩衝液に完全に懸濁させなければならない（緩衝液は、特定のクロマトグラフィー法など、次の分析に適合するものを選択する）。必要であれば、リゾチームおよび/またはその他の添加剤を加える（分離/精製手段にも適合するものでなければならない）。完全な懸濁液が得られるまで、穏やかな超音波処理で溶液を穏やかに混合／ホモジナイズする。
リゾチームと超音波処理の相乗効果についてもっと読む！ - 超音波溶解：サンプルを氷浴に入れる。細胞を破砕するため、懸濁液を60～90秒のスピードで超音波処理する（ソニケーターのパルスモードを使用）。
- 分離：溶解液を遠心分離する（例えば、10,000 x gで10分間、4℃で）。上清と細胞ペレットを注意深く分離する。上清が全細胞溶解液である。上清をろ過すると、可溶性細胞タンパク質の清澄液が得られる。
生物学とバイオテクノロジーにおける超音波発生装置の最も一般的な用途は以下の通りである：
- 細胞エキスの調製
- 酵母、細菌、植物細胞、軟・硬細胞組織、核物質の破壊
- タンパク質抽出
- 酵素の調製と単離
- 抗原の生産
- DNA抽出および/または標的フラグメンテーション
- リポソーム調製
プローブ型超音波破砕機による細胞破砕は、効率的な試料調製法である。
超音波の多様な応用は、バイオテクノロジー、生物工学、微生物学、分子生物学、生化学、免疫学、細菌学、ウイルス学、プロテオミクス、遺伝学、生理学、細胞生物学、血液学、植物学などの分野に及んでいる。
溶解細胞構造の破壊
細胞は、リン脂質二重膜（タンパク質脂質二重膜とも呼ばれる；疎水性脂質と親水性リン分子と埋め込みタンパク質分子によって形成される）で構成される半透膜によって保護されており、細胞内部（細胞質）と細胞外環境との間にバリアを形成している。植物細胞や原核細胞は細胞壁に囲まれている。セルロースの細胞壁が何層にも厚いため、植物細胞は動物細胞よりも溶解しにくい。細胞小器官、核、ミトコンドリアなどの細胞内部は、細胞骨格によって安定化されている。
細胞を溶解することで、細胞小器官、タンパク質、DNA、mRNA、その他の生体分子を抽出・分離することを目的としている。
従来の細胞溶解法とその欠点
細胞を溶解する方法はいくつかあるが、機械的方法と化学的方法に分けられ、洗剤や溶媒の使用、高圧の印加、ビーズミルやフレンチプレスの使用などがある。これらの方法の最も問題な欠点は、プロセスパラメーターの制御と調整が難しく、それによって影響が出ることである。
下の表は、一般的な溶解法の主な欠点を示している：
表：従来の細胞溶解法には大きな欠点がある
溶解の手順
溶解は繊細なプロセスである。溶解中、細胞膜の保護は破壊されるが、非生理的環境（pH値からの逸脱）による抽出タンパク質の不活性化、変性、分解は防がなければならない。したがって、一般的に溶解は緩衝液中で行われる。ほとんどの困難は、細胞内物質がすべて標的外に放出されたり、標的産物が変性したりする、制御不能な細胞破砕から生じる。
超音波処理と細胞溶解に関するよくある質問
- 超音波処理で細胞を溶解できますか？ そう、ソニケーションは、キャビテーション（細胞懸濁液内で微小な水蒸気泡が形成され、激しく崩壊する現象）を誘発する高周波の超音波を用いて、細胞を効果的に溶解する。その結果、機械的な力が細胞膜を破壊し、細胞内成分の液体中への放出を促進します。
- 細胞溶解にソニケーターを使うには？ 細胞溶解にソニケーターを利用するには、ソニケータープロー ブを細胞懸濁液に浸し、振幅やパルス時間などのパラメーターを調 整する。タンパク質の変性と酵素の不活性化を最小限に抑えながら、細胞破砕を最適化するために、プロセスを注意深くモニターする必要がある。
- 細胞溶解のための超音波処理の原理とは？ ソニケーションは音響キャビテーションの原理で行われる。超音波エネルギーは液体媒体中に伝達され、急激な圧力変動を引き起こし、マイクロバブルの形成と爆縮をもたらす。この爆縮により、強いせん断力と局所的な高温が発生し、細胞構造が破壊され、溶解液の均一性が向上する。
- 細胞溶解の超音波処理にはどのくらい時間がかかりますか？ 細胞溶解のための超音波処理の時間は、細胞の種類、細胞密度、ソニケーターの出力、使用する特定のプロトコールなどの因子によって大きく異なることがある。典型的な手順は数秒から数分で、発熱を管理し、均一な細胞破砕を確実にするために、しばしばサイクルで行われる。
- タンパク質抽出における超音波処理の目的は何ですか？ タンパク質抽出において、超音波処理は細胞膜を効率的に破裂させ、タンパク質を可溶化する役割を果たす。この方法は、細胞区画内のタンパク質を遊離させるのに特に有効で、タンパク質の精製や分析を行う溶解液の調製に不可欠である。
- なぜ超音波処理を抽出に使うのか？ ソニケーションは、その迅速な作用と、標的エネルギーを適用する能力により、抽出に適しており、過酷な化学処理を使用することなく、細胞構造を破壊して生物活性分子を放出し、抽出化合物の機能的完全性を保持する。
- 超音波処理はタンパク質間相互作用を破壊するか？ 超音波処理は細胞膜を効果的に破壊することができるが、タンパク質間相互作用も破壊する可能性がある。破壊の程度は超音波処理の強度と照射時間に依存し、タンパク質複合体の変性や解離を引き起こす可能性があり、その後の分析や機能研究に影響を及ぼす可能性がある。
- 超音波処理で大腸菌を溶解することは可能か？ Hielscherソニケーターは、強固な細胞壁を持つ大腸菌などの細菌細胞の溶解に特に効果的である。この技術は、細胞壁と細胞膜を剪断する物理的な方法を提供し、分子生物学や生化学の研究室で細菌の溶解物を調製するための好ましい方法となっている。
- 超音波処理の後の工程は？
超音波溶解後の下流工程には、通常、溶解液の分画、オルガネラの標的単離、さらにタンパク質の抽出または精製が含まれる。
処理された溶解液は分離され、高分解能プロテオミクス、トランスクリプトミクス、受容体結合研究など、分析的あるいは機能的なアプリケーションのために調製される。
文献／参考文献
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.