細胞溶解のための超音波処理：細胞破砕と抽出

超音波による細胞溶解は、現代のバイオテクノロジー研究室で広く用いられているサンプル前処理技術です。主な目的は、細胞膜または細胞全体を破砕して、タンパク質、核酸、細胞小器官などの細胞内成分を放出させることです。日常の実験作業では、超音波処理は、制御された細胞破砕と生体分子の効率的な抽出を行う標準的な方法となっています。超音波処理装置の主な利点は、超音波強度、パルス動作、温度制御などの重要なプロセスパラメーターを精密に調整できることにあります。この制御により、研究者は、繊細な生体分子への熱的または機械的な損傷を最小限に抑えながら、確実に細胞を溶解でき、穏やかでありながら非常に効率的な抽出プロセスを実現できます。

超音波処理装置による細胞溶解

超音波による細胞溶解では、音響キャビテーションを利用して細胞膜を破砕し、細胞内分子を放出させます。Hielscher Ultrasonicsは、従来のプローブ型超音波処理装置に加え、無菌処理用の複数サンプル対応超音波処理装置も提供しています。複数のチューブやバイアルに対応するVialTweeterと、標準的なマイクロプレートに対応する96ウェルプレート超音波処理装置UIP400MTPがあります。

Hielscher Ultrasonicsは、サンプル前処理と臨床分析用の強力な非接触型超音波処理装置を提供しています。マルチウェルプレート超音波処理装置UIP400MTP, VialTweeter, CupHorn およびフロー式超音波処理装置GDmini2は無菌条件下でサンプルを処理します。

実験室用破砕装置UP100HおよびUP400Stによる、サンプル前処理のための超音波処理。（ホモジナイズ、細胞溶解、抽出）

超音波ホモジナイザーUP100H（100ワット）およびUP400St（400ワット）：細胞溶解と抽出のための超音波処理。

細胞溶解と抽出用の超音波ホモジナイザー

超音波装置の種類	主な用途	サンプル量	代表的な使用例	利点	機種例
プローブ型超音波処理装置	単一サンプルの超音波処理	0.1 mL–約1000 mL	細胞溶解、タンパク質抽出、DNA/RNAの断片化	精密なエネルギー制御；多様なソノトロード；少量から中量のサンプルに最適	UP100H, UP200St, UP400St
VialTweeter / CupHorn	複数の密封バイアルの並列処理	8–10本のバイアル（各約1–20 mL）	複数の細胞懸濁液の標準化された溶解処理	均一な超音波処理；交差汚染を回避；再現性のある結果	VialTweeter, CupHorn
96ウェルプレート超音波処理装置	マルチウェルプレートおよびマイクロタイタープレートの超音波処理	マイクロプレート形式	ハイスループットスクリーニング、プロテオミクス、細胞アッセイ	各ウェルを同時かつ均等に超音波処理；複数サンプルのワークフローに最適	UIP400MTP
フローセルリアクター	より大量のサンプルの連続超音波処理	>1 L、スケールアップ可能	産業規模の細胞破砕、抽出物の製造	連続処理；スケールアップ可能；完全なプロセス制御（振幅、圧力、温度）	UIP1000hdT, UIP2000hdT + フローセル
無菌／間接超音波処理システム	汚染のないサンプル処理	バイアル／チューブ／マイクロプレートによって異なる	繊細なサンプル、無菌環境、規制要件のある環境	プローブの接触なし；キャリーオーバーを回避；洗浄の手間が最小限	VialTweeter, CupHorn, UIP400MTP

細胞溶解に超音波処理を使用する利点

他の細胞溶解・抽出方法と比較すると、超音波による細胞溶解にはいくつかの利点があります。

速度： 超音波による細胞溶解と抽出は、数秒で細胞を破砕できる迅速な方法です。ホモジナイズ、凍結融解、ビーズミル処理などの他の方法よりもはるかに高速です。
効率： 超音波による細胞溶解と抽出では、少量、大量、または複数のサンプルを一度に処理できるため、少量のサンプルを個別に処理する必要がある他の方法よりも効率的です。
化学薬品不要：超音波による細胞溶解と抽出は、強い作用を持つ化学薬品や酵素を使用する必要のない非侵襲的な方法です。そのため、細胞内容物の完全性を維持する必要がある用途に最適です。サンプルの不要な汚染を回避できます。
高収量： 超音波による細胞溶解と抽出では、DNA、RNA、タンパク質などの細胞内容物を高収量で抽出できます。これは、高周波の音波が細胞壁を破砕し、内容物を周囲の溶液中に放出させるためです。
温度制御： 高度な超音波処理装置では、サンプルの温度を精密に制御できます。Hielscherのデジタル超音波処理装置には、接続式の温度センサーと温度監視ソフトウェアが備わっています。
再現性： 超音波による細胞溶解のプロトコルは容易に再現でき、単純な線形スケールアップによって、より多量または少量の異なるサンプル量にも対応させることができます。
汎用性： 超音波による細胞溶解と抽出は、細菌、酵母、真菌、植物細胞、哺乳類細胞など、幅広い種類の細胞の抽出に使用できます。また、タンパク質、DNA、RNA、脂質など、さまざまな種類の分子の抽出にも使用できます。
多数のサンプルの同時前処理： Hielscher Ultrasonicsは、多数のサンプルをまったく同じプロセス条件下で容易に処理するためのソリューションを複数提供しています。これにより、細胞溶解と抽出というサンプル前処理工程を非常に効率的に行え、時間を節約できます。
使いやすさ： 超音波による細胞溶解・抽出装置は使いやすく、必要なトレーニングは最小限です。また、装置への投資は一度だけで、使い捨て消耗品を再購入する必要がないため、経済的です。そのため、幅広い研究者や研究室にとって魅力的です。

総合的に見て、超音波による細胞溶解と抽出は、細胞内容物を抽出するための、迅速で効率的、精密に制御可能で汎用性の高い方法です。他の方法に対する利点により、幅広い研究用途や産業用途で魅力的な選択肢となっています。

この解説動画では、実験室、分析、研究における細胞溶解、細胞破砕、タンパク質単離、DNA・RNAの断片化などの試料調製に、どの種類の超音波処理装置が最適かを説明します。用途、試料量、試料数、処理能力に合った種類の超音波処理装置をお選びください。Hielscher Ultrasonicsには、お客様に最適な超音波ホモジナイザーがあります。

超音波による細胞溶解の動作原理

超音波による細胞溶解と抽出では、高周波の音波を使用して細胞を破砕し、その内容物を抽出します。音波は周囲の液体中に圧力変化を生じさせ、キャビテーションと呼ばれるプロセスで小さな気泡を生成・崩壊させます。これらの気泡は局所的に非常に強い機械的な力を生み出し、細胞を破砕して内容物を周囲の溶液中に放出させることができます。

超音波処理装置による細胞溶解は、一般に次の手順で行います。

サンプルを、液体の緩衝液とともにチューブまたは容器に入れます。
超音波プローブをサンプルに挿入し、約20–30 kHzの高周波音波を加えます。
超音波は周囲の液体中に振動とキャビテーションを生じさせ、細胞を破砕して内容物を放出させる局所的な力を生成します。
サンプルを遠心分離またはろ過して細胞残渣を除去し、抽出された内容物を回収して後続の分析に使用します。

一般的な細胞溶解方法の欠点

研究室での作業中に、従来の機械的または化学的な細胞溶解プロトコルを使用する際の煩雑さを、すでに経験されているかもしれません。

機械的溶解： 乳鉢と乳棒による粉砕や、フレンチプレス、ビーズミル、ローター・ステーターシステムによるホモジナイズなどの機械的溶解方法では、精密な制御や調整のための選択肢が不足していることがよくあります。そのため、ミル処理や粉砕を行うと、サンプルを損傷させ、タンパク質を変性させる熱やせん断力が短時間で発生する可能性があります。また、時間がかかり、多量の出発材料が必要になる場合もあります。
化学的溶解： 界面活性剤を用いた溶解などの化学的溶解方法は、脂質二重層を破壊し、タンパク質を変性させることで、サンプルを損傷させる可能性があります。また、複数の工程が必要になる場合があり、後続の用途に支障をきたす汚染物質が残留する可能性もあります。界面活性剤の最適な添加量を見つけることも課題です。
凍結融解サイクル： 凍結融解サイクルは細胞膜を破裂させることができますが、サイクルを繰り返すとタンパク質の変性や分解も生じる可能性があります。この方法では複数回のサイクルが必要になる場合もあり、時間がかかり、収量が低下することもよくあります。
酵素的溶解： 酵素的溶解方法は、特定の細胞種にしか対応しない場合があり、複数の工程が必要なため、時間がかかります。また、廃棄物を生じ、サンプルの分解を回避するために慎重な最適化が必要です。酵素的溶解キットは高価であることがよくあります。現在の酵素的溶解手順で十分な結果が得られない場合は、相乗効果をもたらす方法として超音波処理を適用し、細胞破砕を強化できます。

従来の機械的・化学的な細胞溶解方法と比較して、超音波処理は、超音波処理パラメーターを完全に制御できる、細胞崩壊のための非常に効率的で信頼性の高い手段です。これにより、物質の放出における高い選択性と生成物の高純度が保証されます。[cf. Balasundaram et al., 2009]
あらゆる細胞種に適しており、小規模にも大規模にも容易に適用できます – 常に制御された条件下で行えます。超音波処理装置は洗浄が容易です。超音波ホモジナイザーには、常に定置洗浄（CIP）機能と定置滅菌（SIP）機能が備わっています。ソノトロードは重厚なチタン製ホーンからなり、拭き取りや、水または溶媒による洗い流しが可能です（使用する媒体によって異なります）。超音波処理装置は頑丈であるため、メンテナンスの必要性はほぼ無視できる程度です。

超音波による細胞溶解と細胞破砕

一般に、研究室でのサンプルの溶解には15秒–2分かかります。超音波処理の強度は、振幅と超音波処理時間の設定、および適切な装置の選択によって非常に容易に調整できるため、細胞の構造と溶解の目的に応じて、細胞膜を非常に穏やかに、または非常に急激に破砕することができます（例えば、DNA抽出にはより穏やかな超音波処理が必要であり、細菌からタンパク質を完全に抽出するには、より強力な超音波処理が必要です）。プロセス中の温度は内蔵の温度センサーで監視でき、冷却（氷浴または冷却ジャケット付きフローセル）やパルスモードでの超音波処理によって容易に制御できます。パルスモードでの超音波処理では、1–15秒間の短い超音波照射サイクルにより、それより長い休止期間中に放熱と冷却を行えます。
超音波を利用するすべてのプロセスは、完全に再現可能で、線形にスケールアップできます。

VialTweeterは、無菌条件下で信頼性の高いサンプルのホモジナイズを行える、複数サンプル対応の超音波処理装置です。

VialTweeter は、多数のサンプルを同時に、均一かつ迅速に無菌前処理するための超音波ホモジナイザーです。

細菌細胞の超音波溶解手順の例：

細胞懸濁液の調製：ホモジナイズにより、細胞ペレットを緩衝液中に完全に懸濁させる必要があります（特定のクロマトグラフィー法など、後続の分析に適合する緩衝液を選択してください）。必要に応じて、リゾチームおよび／または他の添加剤を加えます（これらも分離・精製方法に適合している必要があります）。完全な懸濁状態になるまで、穏やかな超音波処理下で溶液を優しく混合・ホモジナイズします。
リゾチームと超音波処理を組み合わせた相乗効果について、詳しくお読みください！
超音波による溶解：サンプルを氷浴に入れます。細胞破砕のために、懸濁液に60–90秒間ずつ超音波を照射します（超音波処理装置のパルスモードを使用）。
分離：溶解液を遠心分離します（例：10,000 x gで10分間；4degC）。上清を細胞ペレットから慎重に分離します。上清が全細胞溶解液です。上清をろ過すると、可溶性細胞タンパク質を含む清澄な液体が得られます。

この動画では、高強度超音波を用いてあらゆる標準的なマルチウェルプレートで確実な試料調製を可能にする超音波試料調製システムUIP400MTPを紹介します。UIP400MTPの代表的な用途には、細胞溶解、DNA・RNA・クロマチンのせん断、タンパク質抽出などがあります。

生物学およびバイオテクノロジーにおける超音波処理装置の最も一般的な用途は、次のとおりです。

細胞抽出物の調製
酵母、細菌、植物細胞、軟らかいまたは硬い細胞組織、核酸物質の破砕
タンパク質抽出
酵素の調製と単離
抗原の製造
DNA抽出および／または標的を定めた断片化
リポソームの調製

超音波による細胞破砕、細胞溶解、抽出は、研究室での効率的なサンプル前処理方法です。

プローブ型超音波処理装置による細胞破砕は、効率的なサンプル前処理方法です。

細胞溶解：細胞構造の破壊

細胞は、リン脂質二重層（タンパク質・脂質二重層とも呼ばれ、疎水性の脂質と親水性のリン分子から形成され、タンパク質分子が埋め込まれています）からなる半透性の細胞膜で保護されています。この膜は、細胞内部（細胞質）と細胞外環境の間に障壁を形成します。植物細胞と原核細胞は細胞壁に囲まれています。植物細胞は、セルロースからなる何層もの厚い細胞壁を持つため、動物細胞よりも溶解が困難です。細胞小器官、核、ミトコンドリアなどの細胞内部の構造は、細胞骨格によって安定化されています。
細胞を溶解する目的は、細胞小器官、タンパク質、DNA、mRNA、その他の生体分子を抽出・分離することです。

従来の細胞溶解方法とその欠点

細胞を溶解する方法はいくつかあり、機械的方法と化学的方法に分けられます。これらには、界面活性剤や溶媒の使用、高圧の適用、ビーズミルやフレンチプレスの使用が含まれます。これらの方法で最も問題となる欠点は、プロセスパラメーター、ひいてはその作用の制御と調整が困難なことです。
下の表に、一般的な溶解方法の主な欠点を示します。

表：従来の細胞溶解方法には大きな欠点があります

細胞溶解の手順

細胞溶解は繊細なプロセスです。溶解中は細胞膜による保護が失われますが、非生理的な環境（pH値からの逸脱）による抽出タンパク質の失活、変性、分解を防ぐ必要があります。そのため、一般に溶解は緩衝液中で行われます。問題の多くは、制御されていない細胞破砕により、すべての細胞内物質が標的を定めずに放出されること、および／または目的の生成物が変性することから生じます。

超音波処理と細胞溶解に関するよくある質問

超音波処理で細胞を溶解できますか？ はい。超音波処理は、高周波の超音波によってキャビテーションを誘発し、細胞を効果的に溶解します。キャビテーションは、細胞懸濁液中で微小な蒸気の気泡が生成し、激しく崩壊する現象です。その結果生じる機械的な力が細胞膜を破砕し、細胞内成分の液体中への放出を促進します。
細胞溶解に超音波処理装置をどのように使用しますか？ 細胞溶解に超音波処理装置を使用するには、装置のプローブを細胞懸濁液に浸し、振幅やパルス持続時間などのパラメーターを調整します。タンパク質の変性と酵素の失活を最小限に抑えながら細胞破砕を最適化するため、プロセスを注意深く監視する必要があります。
細胞溶解のための超音波処理はどのような原理で作用しますか？ 超音波処理は、音響キャビテーションの原理に基づいて作用します。超音波エネルギーが液体媒体に伝わると、急速な圧力変動が生じ、微小気泡が生成して内向きに崩壊します。この崩壊によって強いせん断力と局所的な高温が生じ、細胞構造が破砕され、溶解液の均一性が向上します。
細胞溶解のための超音波処理にはどのくらい時間がかかりますか？ 細胞溶解のための超音波処理時間は、細胞種、細胞密度、超音波処理装置の出力、使用する具体的なプロトコルなどの要因によって大きく異なる場合があります。一般的な手順では数秒から数分かかる場合があり、発熱を管理し、均一な細胞破砕を確保するため、サイクルを繰り返して行うことがよくあります。
タンパク質抽出における超音波処理の目的は何ですか？ タンパク質抽出において、超音波処理は細胞膜を効率的に破裂させ、タンパク質を可溶化する役割を果たします。この方法は、細胞内区画からタンパク質を放出させるのに特に有用であり、タンパク質の精製や分析に用いる溶解液の調製に不可欠です。
なぜ抽出に超音波処理が使用されるのですか？ 超音波処理は、作用が速く、標的にエネルギーを加えられるため、抽出に好んで用いられます。強い作用を持つ化学的処理を使用せずに細胞構造を破壊して生理活性分子を放出させるため、抽出された化合物の機能的な完全性を維持できます。
超音波処理はタンパク質間相互作用を破壊しますか？ 超音波処理は細胞膜を効果的に破砕できますが、タンパク質間相互作用も破壊する可能性があります。破壊の程度は超音波処理の強度と曝露時間によって異なり、タンパク質複合体の変性や解離につながる可能性があります。これが後続の分析や機能研究に影響を及ぼす場合があります。
超音波処理でE. coliを溶解できますか？ Hielscherの超音波処理装置は、頑丈な細胞壁を持つE. coliなどの細菌細胞の溶解に特に効果的です。この技術は、細胞壁と細胞膜をせん断する物理的方法であり、分子生物学や生化学の研究室で細菌溶解液を調製する際に好んで用いられています。
超音波処理工程の後にはどのようなプロセスがありますか？
超音波による溶解後の工程には、通常、溶解液の分画、目的の細胞小器官の単離、さらにタンパク質の抽出または精製が含まれます。
処理済みの溶解液は、その後分離され、高分解能プロテオミクス、トランスクリプトミクス、受容体結合研究などの分析用途や機能評価用途に向けて調製されます。

文献／参考文献

Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.