Applicazioni degli ultrasuoni nel virus MonkeyPox

L'ultrasonicazione è un importante metodo di trattamento per l'isolamento del virus del vaiolo delle scimmie (MPXV) da campioni analitici, per la frammentazione del DNA del virus e per la produzione di vaccini contro il vaiolo delle scimmie. Per la preparazione dei campioni prima della diagnostica e dell'analisi (PCR, ELISA, ecc.) gli ultrasuoni vengono utilizzati per lisare le cellule al fine di rilasciare il virus del vaiolo delle scimmie dall'interno della cellula e/o per frammentare il DNA. Nella produzione di vaccini, le applicazioni vanno dalla preparazione delle particelle virali/del DNA, all'incapsulamento in vettori di farmaci e alla formulazione degli inoculi.
Di seguito sono riportate informazioni dettagliate sulla preparazione a ultrasuoni dei campioni di virus del vaiolo delle scimmie e sulla produzione di vaccini MPXV assistita da ultrasuoni.

 

Cosa troverete in questa pagina:

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Gli ultrasuonatori ad alte prestazioni sono uno strumento di lavorazione fondamentale nella produzione di molti vaccini.

Questo sistema di 2 ultrasuoni da 1 kW per il funzionamento a flusso continuo è installato in un impianto di produzione di vaccini.

Lisi ultrasonica e frammentazione del DNA prima della reazione a catena della polimerasi (PCR)

L'infezione da virus del vaiolo delle scimmie viene rilevata mediante test di amplificazione degli acidi nucleici (NAAT), utilizzando la reazione a catena della polimerasi (PCR) in tempo reale o convenzionale, per individuare sequenze uniche di DNA virale. Il campione (ad esempio, da un tampone nasofaringeo o da biopsie cutanee) contiene il virus nelle cellule.
Per l'analisi, il virus deve essere rilasciato dalle cellule e il DNA virale deve essere frammentato per la PCR.

Lisi a ultrasuoni:

Ultrasuoni UP200Ht con microtip S26d2 per la lisi a ultrasuoni di campioni biologiciLa disgregazione/lisi cellulare a ultrasuoni è un metodo affidabile ed efficiente per isolare i virus dai campioni cellulari e quindi una tecnica preferibile rispetto agli agenti chimici, come il lisozima, la proteinasi K e diversi detergenti che vengono utilizzati in alternativa per ottenere la lisi cellulare e il rilascio del DNA.
Tuttavia, l'uso di questi reagenti chimici richiede una lunga preparazione del campione in diverse fasi prima dell'analisi PCR per evitare l'inibizione della reazione PCR. Poiché gli inibitori della PCR influenzano l'efficienza dell'amplificazione, piccole variazioni della quantità di inibitori non rimossi possono portare a grandi variazioni nell'amplificazione del prodotto PCR (Diaco, 1995).
Il vantaggio dell'ultrasuonoterapia per la lisi è che è auspicabile una rottura completa delle strutture cellulari e il rilascio del DNA senza la necessità di reagenti lisanti e di una preparazione del campione che richiede molto tempo. (cfr. Fykse et al., 2003)

Frammentazione ultrasonica del DNA:

La frammentazione del DNA a ultrasuoni è semplice e affidabile e produce frammenti di DNA di lunghezza regolabile (coppie di basi, bp). Utilizzando gli ultrasuoni, il DNA può essere frammentato efficacemente alla lunghezza desiderata. Il controllo preciso dei parametri ultrasonici e le sofisticate opzioni di raffreddamento impediscono la degradazione del DNA.
Per saperne di più sulla frammentazione del DNA a ultrasuoni!

 

Il video mostra il sistema di preparazione del campione ad ultrasuoni UIP400MTP, che permette la preparazione affidabile del campione di qualsiasi piastra standard a più pozzetti utilizzando ultrasuoni ad alta intensità. Le applicazioni tipiche dell'UIP400MTP comprendono la lisi delle cellule, il taglio di DNA, RNA e cromatina e l'estrazione delle proteine.

Ultrasuonatore UIP400MTP per la sonicazione di piastre a più pozzetti

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Applicazioni degli ultrasuoni nel vaccino contro il virus del vaiolo delle scimmie

Gli ultrasuoni vengono utilizzati per produrre vaccini come quello contro il vaiolo delle scimmie. I vaccini utilizzati contro il virus del vaiolo delle scimmie sono attualmente vaccini a virus vivo. I vaccini di nuova concezione potrebbero utilizzare altre piattaforme, come quella basata sul DNA. Attualmente contiene un viurs Vaccinia Ankara modificato, un orthopoxvirus attenuato e non replicante. Contiene anche Tris (tris-aminometano) e cloruro di sodio. Il vaccino può contenere anche piccole quantità di DNA e proteine provenienti da cellule di embrione fibroblastico di pollo, utilizzate per la crescita del virus vaccinale, benzonasi e composti antibiotici come gentamicina e ciprofloxacina.

L'omogeneizzazione a ultrasuoni è utilizzata nella produzione di vaccini virali vivi attenuati, vaccini a DNA, cocktail di DNA multivariati, vaccini a mRNA, vaccini a proteine ricombinanti, vaccini a particelle virus-simili, ecc.

Le applicazioni degli ultrasuoni nella produzione di vaccini vanno da

  • dispersione di particelle e agenti virali
  • emulsificazione
  • inattivazione dei virus
  • formulazione del vettore del farmaco (NLC, SLN)
  • Incapsulamento
  • dissoluzione degli agenti
  • preparazione di coadiuvanti
  • Degasaggio / disaerazione

 

Potete trovare informazioni più approfondite sulle applicazioni degli ultrasuoni per migliorare la produzione dei vaccini!

Protocollo per l'isolamento a ultrasuoni del virus del vaiolo delle scimmie

Il gruppo di ricerca di Stittelaar (2005) ha utilizzato la lisi ad ultrasuoni per liberare il virus del vaiolo delle scimmie dalla coltura cellulare dell'ospite in crescita e dalle cellule ottenute tramite lo scambio di gole di primati infetti.

Preparazione del vaccino contro il vaiolo delle scimmie:

I virus del vaiolo delle scimmie sono stati coltivati su cellule di fibroblasti embrionali di pollo privi di patogeni specifici. Dopo un'incubazione di 1-2 giorni, la sospensione di cellule virali è stata raccolta con un ciclo di scongelamento e poi concentrata mediante centrifugazione. Il pellet è stato risospeso e sottoposto a diversi cicli di omogeneizzazione a ultrasuoni.

Isolamento del virus del vaiolo delle scimmie da macachi vaccinati:

I campioni sono stati scongelati tre volte e sonicati in un CupHorn a ultrasuoni. Due diluizioni (1:10 e 1:100) in terreno di trasporto integrato con l'1% di siero fetale bovino sono state utilizzate per inoculare monostrati di cellule Vero in piastre a sei pozzetti. Dopo 1 ora di incubazione a 37°C, gli inoculi sono stati rimossi e sostituiti con terreno di coltura integrato con l'1% di siero fetale bovino. I monostrati sono stati coltivati per 5 giorni a 37°C e colorati con una soluzione di cristalvioletto.
(cfr. Stittelaar et al., 2005)

In questo video vi mostriamo un sistema a ultrasuoni da 2 kilowatt per il funzionamento in linea in un armadio spurgabile. Hielscher fornisce apparecchiature a ultrasuoni a quasi tutti i settori industriali, come l'industria chimica, farmaceutica, cosmetica, petrolchimica e per i processi di estrazione con solventi. Questo armadio in acciaio inox spurgabile è progettato per il funzionamento in aree pericolose. A tale scopo, l'armadio sigillato può essere spurgato dal cliente con azoto o aria fresca per evitare che gas o vapori infiammabili entrino nell'armadio.

2x Ultrasuonatori da 1000 Watt in armadio spurgabile per l'installazione in aree pericolose

Ultrasuonatori per l'analisi dei virus e la produzione di vaccini

L'ampia gamma di prodotti Hielscher Ultrasonics offre l'ultrasuonatore ideale per i laboratori di ricerca e di analisi e per la produzione industriale di vaccini.
Hielscher Ultrasonics è specializzata nella progettazione, produzione e distribuzione di ultrasuonatori e sono-bioreattori ad alte prestazioni da utilizzare nei laboratori di ricerca e di analisi e da impiegare nella produzione industriale di vaccini (ad es. vaccini, API).
Controllo preciso dei parametri di processo a ultrasuoni da parte di Hielscher Ultrasonics' software intelligenteLa sonicazione può essere applicata a recipienti aperti, reattori chiusi a agitazione continua e reattori a flusso continuo. Tutte le parti dei sistemi a ultrasuoni, che entrano in contatto con il fluido, sono realizzate in acciaio inossidabile, titanio o vetro. Le parti autoclavabili e i raccordi sanitari assicurano la produzione in condizioni di condizioni di qualità farmaceutica.
Registrazione automatica dei dati: Il software intelligente registra automaticamente i parametri del processo di sonicazione sulla scheda di memoria SD integrata. Il controllo preciso di tutti i parametri di processo assicura il controllo preciso di tutti i parametri di processo. Riproducibilità, standardizzazione della produzionee facilita il rispetto degli standard di sicurezza dei prodotti farmaceutici.
Ultrasuoni Hielscher’ I processori a ultrasuoni sono altamente affidabili e possono essere controllati con precisione. Tutti gli ultrasuonatori industriali possono essere regolati per fornire l'intera gamma di ampiezze, da quelle più basse a quelle molto elevate. La robustezza dei sistemi a ultrasuoni Hielscher consente un funzionamento 24 ore su 24, 7 giorni su 7, in condizioni di lavoro gravose e in ambienti difficili.

La tabella seguente fornisce un'indicazione della capacità di lavorazione approssimativa dei nostri ultrasuoni:

Volume di batch Portata Dispositivi raccomandati
piastre multipozzetto / microtitolazione n/a UIP400MTP
1 - 500mL 10 - 200mL/min UP100H
10 - 2000mL 20 - 400mL/min UP200Ht, UP400St
0,1 - 20L 0,2 - 4L/min UIP2000hdT
10 - 100L 2 - 10L/min UIP4000hdT
n/a 10 - 100L/min UIP16000
n/a più grande cluster di UIP16000

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Gli omogeneizzatori a ultrasuoni sono affidabili per il taglio del DNA

Taglio del DNA ad ultrasuoni
Adattato da Jkwchui sotto CC-BY-SA.03



Letteratura / Referenze

  • Stittelaar, Koert; Amerongen, Geert; Kondova, Ivanela; Kuiken, Thijs; Lavieren, Rob; Pistoor, Frank; Niesters, Hubert; Doornum, Gerard; Van der Zeijst, Bernard; Mateo, Luis; Chaplin, Paul; Osterhaus, Albert (2005): Modified Vaccinia Virus Ankara Protects Macaques against Respiratory Challenge with Monkeypox Virus. Journal of Virology 79, 2005. 7845-51.
  • Shah Purvin, Parameswara Rao Vuddanda, Sanjay Kumar Singh, Achint Jain, and Sanjay Singh (2014): Pharmacokinetic and Tissue Distribution Study of Solid Lipid Nanoparticles of Zidovudine in Rats. Journal of Nanotechnology, Volume 2014.
  • J. Robin Harris, Andrei Soliakova, Richard J. Lewis, Frank Depoix, Allan Watkinson, Jeremy H. Lakeya (2012): Alhydrogel® adjuvant, ultrasonic dispersion and protein binding: a TEM and analytical study. Micron Volume 43, Issues 2–3, February 2012, 192-200.
  • Doron Melamed, Gabriel Leitner, E. Dan Heller (1991): A Vaccine against Avian Colibacillosis Based on Ultrasonic Inactivation of Escherichia coli. Avian Diseases Vol. 35, No. 1 (Jan. – Mar., 1991), 17-22.
  • Huang C-F, Wu T-C, Wu C-C, Lee C-C, Lo W-T, Hwang K-S, Hsu M-L, Peng H-J. (2011): Sublingual vaccination with sonicated Salmonella proteins and mucosal adjuvant induces mucosal and systemic immunity and protects mice from lethal enteritis. APMIS 119, 2011. 468–78.

Particolarità / Cose da sapere

Virus del vaiolo delle scimmie

Il vaiolo delle scimmie (MPV, MPXV o hMPXV) è una specie di virus a DNA a doppio filamento che causa una zoonosi virale. Questa malattia è nota come infezione da vaiolo delle scimmie e può manifestarsi nell'uomo e negli animali. Appartiene al genere Orthopoxvirus della famiglia Poxviridae. Il virus del vaiolo delle scimmie è uno degli orthopoxvirus umani insieme ai virus della variola (VARV), del vaiolo bovino (CPX) e della vaccinia (VACV). Gli orthopoxvirus sono caratterizzati da grandi particelle virali a forma di mattone, contenenti un genoma di DNA a doppio filamento di circa 200.000 bp.

Test ELISA

ELISA è l'acronimo di Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ed è un test immunologico etichettato considerato il gold standard dei test immunologici. L'ELISA è un test immunologico, apprezzato per la sua elevata sensibilità diagnostica, utilizzato per rilevare e quantificare molecole, tra cui anticorpi, antigeni, proteine, glicoproteine e ormoni. Il principio dell'ELISA si basa sull'interazione antigene-anticorpo. Grazie a questa interazione antigene-anticorpo, gli anticorpi specifici si legano all'antigene bersaglio. Solo quando avviene l'interazione, il substrato può legarsi all'enzima e si può osservare una successiva conversione del substrato, il che significa ottenere un risultato positivo.


Ultrasuoni ad alte prestazioni! La gamma di prodotti Hielscher copre l'intero spettro, dagli ultrasuoni da laboratorio compatti alle unità da banco fino ai sistemi a ultrasuoni industriali completi.

Hielscher Ultrasonics produce omogeneizzatori a ultrasuoni ad alte prestazioni da laboratorio a dimensione industriale.