Applicazioni degli ultrasuoni per il virus del vaiolo delle scimmie
Il trattamento a ultrasuoni è un importante metodo di lavorazione per l’isolamento del virus del vaiolo delle scimmie (MPXV) dai campioni analitici, per la frammentazione del DNA virale e per la produzione di vaccini contro il vaiolo delle scimmie. Nella preparazione dei campioni prima della diagnosi e delle analisi (PCR, ELISA ecc.), il trattamento a ultrasuoni viene utilizzato per lisare le cellule allo scopo di liberare il virus del vaiolo delle scimmie dall’interno delle cellule e / o frammentare il DNA. Nella produzione di vaccini, le applicazioni spaziano dalla preparazione delle particelle virali / del DNA all’incapsulamento in veicoli per farmaci e alla formulazione degli inoculi.
Di seguito sono disponibili informazioni dettagliate sulla preparazione a ultrasuoni dei campioni contenenti il virus del vaiolo delle scimmie e sulla produzione di vaccini contro MPXV assistita da ultrasuoni.
Cosa troverete in questa pagina:
- Lisi a ultrasuoni per l’estrazione del virus del vaiolo delle scimmie
- Frammentazione a ultrasuoni del DNA del virus del vaiolo delle scimmie
- Applicazioni degli ultrasuoni nella produzione di vaccini contro MPXV
Questo sistema di sonicatori da 2x 1kW per il funzionamento a flusso continuo è installato in uno stabilimento di produzione di vaccini.
Lisi e frammentazione del DNA a ultrasuoni prima della reazione a catena della polimerasi (PCR)
Un’infezione da virus del vaiolo delle scimmie viene rilevata mediante test di amplificazione degli acidi nucleici (NAAT), utilizzando la reazione a catena della polimerasi (PCR) in tempo reale o convenzionale per rilevare sequenze uniche del DNA virale. Il campione (ad esempio, ottenuto da un tampone nasofaringeo o da biopsie cutanee) contiene il virus all’interno delle cellule.
Per l’analisi, il virus deve essere liberato dalle cellule e il DNA virale deve essere frammentato per la PCR.
Lisi a ultrasuoni:
La disgregazione cellulare / lisi a ultrasuoni è un metodo affidabile ed efficiente per isolare i virus dai campioni cellulari ed è pertanto una tecnica preferibile rispetto agli agenti chimici, quali lisozima, proteinasi K e diversi detergenti, utilizzati in alternativa per ottenere la lisi cellulare e il rilascio del DNA.
Tuttavia, l’uso di questi reagenti chimici richiede una preparazione dei campioni lunga e articolata in più fasi prima dell’analisi PCR, per evitare l’inibizione della reazione PCR. Poiché gli inibitori della PCR influiscono sull’efficienza dell’amplificazione, piccole variazioni della quantità di inibitori non rimossi possono determinare grandi variazioni nell’amplificazione del prodotto della PCR (Diaco, 1995).
Il vantaggio del trattamento a ultrasuoni per la lisi è che consente la completa disgregazione delle strutture cellulari e il rilascio del DNA senza la necessità di reagenti di lisi e di una preparazione dei campioni che richieda molto tempo, risultati auspicabili. (cfr. Fykse et al., 2003)
Frammentazione del DNA a ultrasuoni:
La frammentazione del DNA a ultrasuoni è semplice e affidabile, poiché produce frammenti di DNA di lunghezza regolabile (coppie di basi, bp). Utilizzando gli ultrasuoni, il DNA può essere frammentato efficacemente fino alla lunghezza desiderata. Il controllo preciso dei parametri degli ultrasuoni e le sofisticate opzioni di raffreddamento prevengono la degradazione del DNA.
Scoprite di più sulla frammentazione del DNA a ultrasuoni!
Applicazioni degli ultrasuoni nei vaccini contro il virus del vaiolo delle scimmie
I vaccini utilizzati contro il virus del vaiolo delle scimmie sono attualmente vaccini a virus vivo. I vaccini di nuova concezione potrebbero utilizzare altre piattaforme, ad esempio quelle basate sul DNA. Attualmente contiene un virus Vaccinia Ankara modificato, un orthopoxvirus attenuato e non replicante. Contiene inoltre Tris (tris-aminometano) e cloruro di sodio. Il vaccino può contenere anche piccole quantità di DNA e proteine provenienti dalle cellule di fibroblasti di embrione di pollo, utilizzate per coltivare il virus vaccinale, benzonasi e composti antibiotici come gentamicina e ciprofloxacina.
L’omogeneizzazione a ultrasuoni viene utilizzata nella produzione di vaccini a virus vivo attenuato, vaccini a DNA, cocktail di DNA multivalenti, vaccini a mRNA, vaccini a proteine ricombinanti, vaccini a particelle simil-virali ecc.
- dispersione di particelle virali e agenti
- emulsificazione
- inattivazione dei virus
- formulazione di veicoli per farmaci (NLC, SLN)
- incapsulamento
- dissoluzione di agenti
- preparazione di adiuvanti
- degasaggio / disaerazione
Protocollo per l’isolamento a ultrasuoni del virus del vaiolo delle scimmie
Il gruppo di ricerca di Stittelaar (2005) ha utilizzato la lisi a ultrasuoni per liberare il virus del vaiolo delle scimmie dalla coltura di cellule ospiti utilizzata per la crescita del virus e dalle cellule ottenute mediante tamponi faringei di primati infetti.
Preparazione del vaccino contro il vaiolo delle scimmie:
I virus del vaiolo delle scimmie sono stati coltivati su cellule di fibroblasti di embrione di pollo esenti da patogeni specifici. Dopo un’incubazione di 1–2 giorni, la sospensione di virus e cellule è stata raccolta mediante un ciclo di congelamento e scongelamento e successivamente concentrata mediante centrifugazione. Il pellet è stato risospeso e sottoposto a diversi cicli di omogeneizzazione a ultrasuoni.
Isolamento del virus del vaiolo delle scimmie da macachi vaccinati:
I campioni sono stati congelati e scongelati tre volte e sottoposti a sonicazione in un CupHorn a ultrasuoni. Due diluizioni (1:10 e 1:100) in terreno di trasporto integrato con 1% di siero fetale bovino sono state utilizzate per inoculare monostrati di cellule Vero in piastre a sei pozzetti. Dopo 1 h di incubazione a 37°C, gli inoculi sono stati rimossi e sostituiti con terreno di coltura integrato con 1% di siero fetale bovino. I monostrati sono stati coltivati per 5 giorni a 37°C e colorati con una soluzione di violetto di cristallo.
(cfr. Stittelaar et al., 2005)
Sonicatori per l’analisi dei virus e la produzione di vaccini
L’ampia gamma di prodotti di Hielscher Ultrasonics offre il sonicatore ideale per i laboratori di ricerca e di analisi e per la produzione industriale di vaccini.
Hielscher Ultrasonics è specializzata nella progettazione, produzione e distribuzione di sonicatori ad alte prestazioni e sonobioreattori per l’impiego nei laboratori di ricerca e di analisi e per l’integrazione nella produzione industriale di vaccini (ad es. vaccini, principi attivi farmaceutici).
La sonicazione può essere applicata a recipienti aperti, reattori chiusi ad agitazione continua e reattori a flusso continuo. Tutte le parti dei sistemi a ultrasuoni che entrano in contatto con il mezzo liquido sono realizzate in acciaio inossidabile, titanio o vetro. Le parti autoclavabili e i raccordi sanitari garantiscono la produzione in condizioni di grado farmaceutico.
Registrazione automatica dei dati: Un software intelligente registra automaticamente i parametri del processo di sonicazione sulla scheda di memoria SD integrata. Il controllo preciso di tutti i parametri di processo garantisce la riproducibilità, standardizzazione della produzione, e facilita il rispetto degli standard di sicurezza dei prodotti farmaceutici.
I processori a ultrasuoni di Hielscher Ultrasonics sono altamente affidabili e possono essere controllati con precisione. Tutti i sonicatori industriali possono essere regolati per fornire l’intera gamma di ampiezze, da basse a molto elevate. La robustezza dei sistemi a ultrasuoni Hielscher consente il funzionamento 24/7 in condizioni di lavoro gravose e in ambienti impegnativi.
La tabella seguente fornisce un’indicazione della capacità di trattamento approssimativa dei nostri sonicatori:
| Volume del lotto | Portata | Dispositivi consigliati |
|---|---|---|
| piastre multipozzetto / per microtitolazione | non applicabile | UIP400MTP |
| 1–500mL | 10–200mL/min | UP100H |
| 10–2000mL | 20–400mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0,1–20L | 0,2–4L/min | UIP2000hdT |
| 10–100L | 2–10L/min | UIP4000hdT |
| non applicabile | 10–100L/min | UIP16000 |
| non applicabile | superiore | gruppo di UIP16000 |
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Taglio del DNA a ultrasuoni
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Letteratura / Riferimenti bibliografici
- Stittelaar, Koert; Amerongen, Geert; Kondova, Ivanela; Kuiken, Thijs; Lavieren, Rob; Pistoor, Frank; Niesters, Hubert; Doornum, Gerard; Van der Zeijst, Bernard; Mateo, Luis; Chaplin, Paul; Osterhaus, Albert (2005): Modified Vaccinia Virus Ankara Protects Macaques against Respiratory Challenge with Monkeypox Virus. Journal of Virology 79, 2005. 7845-51.
- Shah Purvin, Parameswara Rao Vuddanda, Sanjay Kumar Singh, Achint Jain, and Sanjay Singh (2014): Pharmacokinetic and Tissue Distribution Study of Solid Lipid Nanoparticles of Zidov in Rats. Journal of Nanotechnology, Volume 2014.
- J. Robin Harris, Andrei Soliakova, Richard J. Lewis, Frank Depoix, Allan Watkinson, Jeremy H. Lakeya (2012): Alhydrogel® adjuvant, ultrasonic dispersion and protein binding: a TEM and analytical study. Micron Volume 43, Issues 2–3, February 2012, 192-200.
- Doron Melamed, Gabriel Leitner, E. Dan Heller (1991): A Vaccine against Avian Colibacillosis Based on Ultrasonic Inactivation of Escherichia coli. Avian Diseases Vol. 35, No. 1 (Jan. – Mar., 1991), 17-22.
- Huang C-F, Wu T-C, Wu C-C, Lee C-C, Lo W-T, Hwang K-S, Hsu M-L, Peng H-J. (2011): Sublingual vaccination with sonicated Salmonella proteins and mucosal adjuvant induces mucosal and systemic immunity and protects mice from lethal enteritis. APMIS 119, 2011. 468–78.
Informazioni utili
Virus del vaiolo delle scimmie
Il virus del vaiolo delle scimmie (MPV, MPXV o hMPXV) è una specie di virus a DNA a doppio filamento che causa una malattia virale zoonotica. Questa malattia è nota come infezione da vaiolo delle scimmie e può manifestarsi negli esseri umani e negli animali. Appartiene al genere Orthopoxvirus della famiglia Poxviridae. Il virus del vaiolo delle scimmie è uno degli orthopoxvirus umani, insieme ai virus del vaiolo (VARV), del vaiolo bovino (CPX) e vaccinia (VACV). Gli orthopoxvirus sono caratterizzati da grandi particelle virali a forma di mattone, contenenti un genoma a DNA a doppio filamento di circa 200.000 bp.
Saggio ELISA
ELISA è l’acronimo di Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ossia saggio immunoenzimatico con adsorbimento, ed è un saggio immunologico con marcatura considerato il metodo di riferimento per i saggi immunologici. ELISA è un test immunologico, apprezzato per la sua elevata sensibilità diagnostica, utilizzato per rilevare e quantificare molecole, tra cui anticorpi, antigeni, proteine, glicoproteine e ormoni. Il principio dell’ELISA si basa su un’interazione antigene-anticorpo. Attraverso questa interazione antigene-anticorpo, gli anticorpi specifici si legano al proprio antigene bersaglio. Solo quando avviene l’interazione, il substrato può legarsi all’enzima ed è possibile osservare una successiva conversione del substrato, il che significa che si ottiene un risultato positivo.
Hielscher Ultrasonics produce omogeneizzatori a ultrasuoni ad alte prestazioni, dalle dimensioni da laboratorio a quelle industriali.