Sonosintesi di nano-idrossiapatite

L’idrossiapatite (HA o HAp) è una ceramica bioattiva ampiamente utilizzata per scopi medici grazie alla sua struttura simile a quella del materiale osseo. La sintesi dell’idrossiapatite assistita da ultrasuoni (sonosintesi) è una tecnica efficace per produrre HAp nanostrutturata secondo i più elevati standard qualitativi. Il metodo a ultrasuoni consente di produrre HAp nanocristallina, particelle modificate, ad esempio nanosfere nucleo–guscio, e compositi.

Idrossiapatite: un minerale versatile

L’idrossilapatite o idrossiapatite (HAp, anche HA) è una forma minerale naturale di apatite di calcio con formula Ca₅(PO₄)₃(OH). Per indicare che la cella unitaria del cristallo comprende due unità, la formula viene solitamente scritta Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂. L’idrossilapatite è il termine estremo idrossilico del complesso gruppo delle apatiti. Lo ione OH- può essere sostituito da fluoruro, cloruro o carbonato, producendo fluorapatite o clorapatite. Cristallizza nel sistema cristallino esagonale. L’HAp è nota come materiale osseo, poiché fino al 50 wt% dell’osso è costituito da una forma modificata di idrossiapatite.
In medicina, l’HAp porosa nanostrutturata è un materiale interessante per applicazioni di osso artificiale. Grazie alla sua buona biocompatibilità a contatto con l’osso e alla sua composizione chimica simile a quella del materiale osseo, la ceramica porosa di HAp ha trovato un vastissimo impiego nelle applicazioni biomediche, tra cui la rigenerazione del tessuto osseo, la proliferazione cellulare e il rilascio di farmaci.
«Nell’ingegneria del tessuto osseo è stata impiegata come materiale di riempimento per difetti ossei e interventi di aumento osseo, come materiale per innesti ossei artificiali e nella chirurgia di revisione protesica. La sua elevata area superficiale conferisce un’eccellente osteoconduttività e riassorbibilità, favorendo una rapida crescita ossea al suo interno.» [Soypan et al. 2007] Pertanto, molti impianti moderni sono rivestiti di idrossilapatite.
Un’altra promettente applicazione dell’idrossilapatite microcristallina è il suo utilizzo come integratore per la «formazione ossea», con un assorbimento superiore rispetto al calcio.
Oltre al suo utilizzo come materiale di riparazione per ossa e denti, altre applicazioni dell’HAp si trovano nella catalisi, nella produzione di fertilizzanti, come componente di prodotti farmaceutici, nelle applicazioni di cromatografia delle proteine e nei processi di trattamento delle acque.

Ultrasuoni di potenza: effetti e impatto

La sonicazione è descritta come un processo in cui si utilizza un campo acustico accoppiato a un mezzo liquido. Le onde ultrasoniche si propagano nel liquido e producono cicli alternati di alta pressione/bassa pressione (compressione e rarefazione). Durante la fase di rarefazione si formano nel liquido piccole bolle di vuoto o cavità, che crescono nel corso di diversi cicli di alta pressione/bassa pressione finché la bolla non è più in grado di assorbire energia. A questo punto, le bolle implodono violentemente durante una fase di compressione. Durante questo collasso delle bolle viene rilasciata una grande quantità di energia sotto forma di onde d’urto, temperature elevate (circa 5.000K) e pressioni elevate (circa 2.000atm). Inoltre, questi «punti caldi» sono caratterizzati da velocità di raffreddamento molto elevate. L’implosione della bolla genera anche getti di liquido con velocità fino a 280m/s. Questo fenomeno è definito cavitazione.
Quando queste forze estreme, generate durante il collasso delle bolle di cavitazione, si propagano nel mezzo sottoposto a sonicazione, agiscono su particelle e goccioline – provocando collisioni tra le particelle che determinano la frantumazione del solido. Si ottengono così la riduzione delle dimensioni delle particelle mediante macinazione, la deagglomerazione e la dispersione. Le particelle possono essere ridotte a dimensioni submicrometriche e nanometriche.
Oltre agli effetti meccanici, la sonicazione ad alta potenza può creare radicali liberi, scindere molecole mediante forze di taglio e attivare le superfici delle particelle. Questi fenomeni sono noti come sonochimica.

Sonosintesi

Il trattamento a ultrasuoni della sospensione produce particelle molto fini distribuite uniformemente, creando così un maggior numero di siti di nucleazione per la precipitazione.
Le particelle di HAp sintetizzate sotto l’azione degli ultrasuoni mostrano un grado inferiore di agglomerazione. La minore tendenza all’agglomerazione dell’HAp sintetizzata mediante ultrasuoni è stata confermata, ad esempio, dall’analisi FESEM (microscopia elettronica a scansione a emissione di campo) di Poinern et al. (2009).

Gli ultrasuoni assistono e favoriscono le reazioni chimiche attraverso la cavitazione ultrasonica e i suoi effetti fisici, che influenzano direttamente la morfologia delle particelle durante la fase di crescita. I principali vantaggi del trattamento a ultrasuoni nella preparazione di miscele di reazione estremamente fini sono

1) aumento della velocità di reazione,
2) riduzione del tempo di trattamento
3) miglioramento complessivo dell’efficienza nell’utilizzo dell’energia.

Poinern et al. (2011) hanno sviluppato un metodo chimico per via umida che utilizza nitrato di calcio tetraidrato (Ca[NO3]2 · 4H2O) e diidrogenofosfato di potassio (KH2PO4) come reagenti principali. Per controllare il valore del pH durante la sintesi, è stato aggiunto idrossido di ammonio (NH4OH).
Il processore a ultrasuoni utilizzato era un UP50H (50 W, 30 kHz, sonotrodo MS7 con diametro di 7 mm) di Hielscher Ultrasonics.

Idrossiapatite di calcio dispersa mediante ultrasuoni

Idrossiapatite di calcio ridotta dimensionalmente e dispersa mediante ultrasuoni

Fasi della sintesi di nano-HAP:

Una soluzione di 40 mL di 0,32M Ca(NO₃)₂ · 4H₂O è stata preparata in un piccolo becher. Il pH della soluzione è stato quindi regolato a 9,0 con circa 2,5mL di NH₄OH. La soluzione è stata sottoposta a sonicazione con l’ UP50H con un’ampiezza impostata al 100% per 1 ora.
Al termine della prima ora, una soluzione di 60 mL di 0,19M [KH₂PO₄] è stata quindi aggiunta lentamente, goccia a goccia, alla prima soluzione durante una seconda ora di irradiazione ultrasonica. Durante il processo di miscelazione, il valore del pH è stato controllato e mantenuto a 9, mentre il rapporto Ca/P è stato mantenuto a 1,67. La soluzione è stata quindi filtrata mediante centrifugazione (~2000 g), dopodiché il precipitato bianco ottenuto è stato suddiviso in diversi campioni per il trattamento termico.
La presenza degli ultrasuoni nella procedura di sintesi prima del trattamento termico influisce significativamente sulla formazione dei precursori iniziali delle particelle di nano-HAP. Ciò è dovuto al fatto che le dimensioni delle particelle sono correlate alla nucleazione e alla modalità di crescita del materiale, che a sua volta è correlata al grado di sovrasaturazione nella fase liquida.
Inoltre, sia le dimensioni delle particelle sia la loro morfologia possono essere influenzate direttamente durante questo processo di sintesi. L’aumento della potenza ultrasonica da 0 a 50W ha dimostrato che era possibile ridurre le dimensioni delle particelle prima del trattamento termico.
L’aumento della potenza ultrasonica utilizzata per irradiare il liquido indicava la produzione di un maggior numero di bolle ed eventi di cavitazione. Ciò ha prodotto a sua volta un maggior numero di siti di nucleazione e, di conseguenza, particelle più piccole formatesi attorno a questi siti. Inoltre, le particelle esposte a periodi più lunghi di irradiazione ultrasonica mostrano una minore agglomerazione. I successivi dati FESEM hanno confermato la riduzione dell’agglomerazione delle particelle quando si utilizzano gli ultrasuoni durante il processo di sintesi.
Particelle di nano-HAp di dimensioni nanometriche e morfologia sferica sono state prodotte mediante una tecnica di precipitazione chimica per via umida in presenza di ultrasuoni. È stato riscontrato che la struttura cristallina e la morfologia delle polveri di nano-HAP ottenute dipendevano dalla potenza della sorgente di irradiazione ultrasonica e dal successivo trattamento termico utilizzato. È risultato evidente che la presenza degli ultrasuoni nel processo di sintesi favoriva le reazioni chimiche e gli effetti fisici che, dopo il trattamento termico, producevano le polveri ultrafini di nano-HAp.

Sonicazione continua con una cella di flusso in vetro

Sonicazione in una camera di reazione a ultrasuoni

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Idrossiapatite:

principale minerale inorganico di fosfato di calcio
elevata biocompatibilità
biodegradabilità lenta
osteoconduttiva
non tossica
non immunogenica
può essere combinata con polimeri e/o vetro
matrice strutturale con buona capacità di assorbimento di altre molecole
eccellente sostituto osseo

Gli omogeneizzatori a ultrasuoni sono strumenti potenti per sintetizzare e funzionalizzare particelle, come l’HAp

Sonicatore a sonda UP50H

Sintesi dell’HAp mediante metodo sol–gel a ultrasuoni

Metodo sol–gel assistito da ultrasuoni per la sintesi di particelle di HAp nanostrutturate:
Materiale:
– reagenti: nitrato di calcio Ca(NO₃)₂, idrogenofosfato diammonico (NH₄)₂HPO₄, idrossido di sodio NaOH;
– provetta da 25 ml

Sciogliere Ca(NO₃)₂ e (NH₄)₂HPO₄ in acqua distillata (rapporto molare calcio/fosforo: 1,67)
Aggiungere una piccola quantità di NaOH alla soluzione per mantenerne il pH intorno a 10.
Trattamento a ultrasuoni con un UP100H (sonotrodo MS10, ampiezza 100%)

Le sintesi idrotermali sono state condotte a 150°C per 24 h in un forno elettrico.
Dopo la reazione, l’HAp cristallina può essere recuperata mediante centrifugazione e lavaggio con acqua deionizzata.
Analisi della nanopolvere di HAp ottenuta mediante microscopia (SEM, TEM) e/o spettroscopia (FT-IR). Le nanoparticelle di HAp sintetizzate mostrano un’elevata cristallinità. Si possono osservare morfologie diverse a seconda del tempo di sonicazione. Una sonicazione più lunga può portare a nanobarre di HAp uniformi, con un elevato rapporto d’aspetto e una cristallinità estremamente elevata. [cfr. Manafi et al. 2008]

Modifica dell’HAp

A causa della sua fragilità, l’applicazione dell’HAp pura è limitata. Nella ricerca sui materiali sono stati compiuti numerosi sforzi per modificare l’HAp mediante polimeri, poiché l’osso naturale è un composito costituito principalmente da cristalli di HAp nanometrici e aghiformi (che rappresentano circa il 65wt% dell’osso). La modifica dell’HAp assistita da ultrasuoni e la sintesi di compositi con caratteristiche del materiale migliorate offrono molteplici possibilità (si vedano alcuni esempi di seguito).

Esempi pratici:

Sintesi di nano-HAp

Nello studio di Poinern et al. (2009), un sonicatore a sonda Hielscher UP50H è stato utilizzato con successo per la sonosintesi dell’HAp. All’aumentare dell’energia ultrasonica, le dimensioni dei cristalliti di HAp diminuivano. L’idrossiapatite nanostrutturata (HAp) è stata preparata mediante una tecnica di precipitazione per via umida assistita da ultrasuoni. Ca(NO₃) e KH₂₅PO₄ sono stati utilizzati come materiali principali e NH₃ come agente precipitante. La precipitazione idrotermale sotto irradiazione ultrasonica ha prodotto particelle di HAp nanometriche con morfologia sferica e dimensioni nell’intervallo nanometrico (circa 30nm ± 5%). Poinern e collaboratori hanno individuato nella sintesi sono-idrotermale un metodo economico con un’elevata capacità di aumento di scala per la produzione commerciale.

Sintesi di gelatina-idrossiapatite (Gel-HAp)

Brundavanam e collaboratori hanno preparato con successo un composito gelatina–idrossiapatite (Gel-HAp) in condizioni di sonicazione blanda. Per la preparazione della gelatina–idrossiapatite, 1g di gelatina è stato completamente sciolto in 1000mL di acqua MilliQ a 40°C. Sono stati quindi aggiunti 2mL della soluzione di gelatina preparata alla miscela Ca2+/NH₃ . La miscela è stata sottoposta a sonicazione con un sonicatore UP50H (50W, 30kHz). Durante la sonicazione, 60mL di 0,19M KH₂PO₄ sono stati aggiunti alla miscela, goccia a goccia.
L’intera soluzione è stata sottoposta a sonicazione per 1h. Il valore del pH è stato controllato e mantenuto costantemente a pH 9, mentre il rapporto Ca/P è stato regolato a 1,67. La filtrazione del precipitato bianco è stata ottenuta mediante centrifugazione, producendo una sospensione densa. Diversi campioni sono stati trattati termicamente in un forno tubolare per 2h a temperature di 100, 200, 300 e 400°C. È stata così ottenuta una polvere di Gel–HAp in forma granulare, che è stata macinata fino a ottenere una polvere fine e caratterizzata mediante XRD, FE-SEM e FT-IR. I risultati mostrano che il trattamento blando a ultrasuoni e la presenza di gelatina durante la fase di crescita dell’HAp favoriscono una minore adesione – producendo così nanoparticelle di Gel–HAp più piccole e di forma sferica regolare. La sonicazione blanda favorisce la sintesi di particelle di Gel–HAp nanometriche grazie agli effetti di omogeneizzazione ultrasonica. Le specie ammidiche e carboniliche della gelatina si legano successivamente alle nanoparticelle di HAp durante la fase di crescita attraverso un’interazione assistita sonochimicamente.
[Brundavanam et al. 2011]

Deposizione di HAp su piastrine di titanio

Ozhukil Kollatha et al. (2013) hanno rivestito piastre di Ti con idrossiapatite. Prima della deposizione, la sospensione di HAp è stata omogeneizzata con un UP400S (dispositivo a ultrasuoni da 400 watt con sonotrodo H14, tempo di sonicazione di 40 sec. al 75% di ampiezza).

HAp rivestita d'argento

Ignatev e collaboratori (2013) hanno sviluppato un metodo biosintetico in cui nanoparticelle d’argento (AgNp) sono state depositate sull’HAp per ottenere un rivestimento di HAp con proprietà antibatteriche e ridurre l’effetto citotossico. Per la deagglomerazione delle nanoparticelle d’argento e la loro sedimentazione sull’idrossiapatite è stato utilizzato un Hielscher UP400S .

Una configurazione composta da un agitatore magnetico e un sonicatore UP400S è stata utilizzata per la preparazione dell’Hap rivestita d’argento [Ignatev et al 2013]

I nostri potenti dispositivi a ultrasuoni sono strumenti affidabili per trattare particelle di dimensioni submicrometriche e nanometriche. Che desideriate sintetizzare, disperdere o funzionalizzare particelle in piccole provette per scopi di ricerca, oppure dobbiate trattare grandi volumi di sospensioni di nanopolveri per la produzione commerciale, Hielscher offre il sonicatore adatto alle vostre esigenze!

Omogeneizzatore a ultrasuoni UP400S

Bibliografia e riferimenti

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