Vaccini virali basati su colture cellulari – disgregazione cellulare efficiente con la sonicazione

Domande frequenti sulla disgregazione cellulare a ultrasuoni per la produzione di vaccini a base virale

Che cos’è la disgregazione cellulare a ultrasuoni?

La disgregazione cellulare a ultrasuoni utilizza ultrasuoni ad alta intensità, tipicamente nell’intervallo da 20 a 30 kHz, per rompere le membrane cellulari e rilasciare il materiale intracellulare. Le onde ultrasoniche ad alta potenza creano bolle di cavitazione nel liquido. Quando queste bolle collassano, generano intense forze di taglio locali e microcorrenti che disgregano meccanicamente le cellule e favoriscono il trasferimento di massa tra l’interno della cellula e il mezzo circostante. Nella produzione di vaccini, ciò viene utilizzato per lisare colture cellulari infettate da virus e per rilasciare nel raccolto le particelle virali intracellulari e associate alla membrana.

Perché usare la sonicazione invece della lisi chimica o enzimatica per la raccolta virale?

La sonicazione funziona esclusivamente con forze meccaniche. Non sono necessari detergenti, lisozima, proteinasi K o altri reagenti di lisi che potrebbero alterare il lisato, interferire con la purificazione a valle o dover essere rimossi prima di ulteriori trattamenti. I reagenti chimici richiedono in genere una preparazione lunga e in più fasi per evitare l’inibizione dei saggi successivi e di altre fasi di post-elaborazione. La disgregazione enzimatica richiede lunghi tempi di incubazione e spesso fornisce risultati non riproducibili. La lisi a ultrasuoni sovrappone inoltre le fasi di risospensione, disgregazione ed estrazione in un’unica operazione continua. Laddove il vostro processo richieda una fase assistita da detergente o enzima, la sonicazione la intensifica anziché sostituirla: la cavitazione indebolisce le membrane e migliora l’esposizione uniforme di tutte le cellule al reagente.

Come si confronta la sonicazione con i metodi di omogeneizzazione meccanica?

I sonicatori a sonda trasferiscono l’energia ultrasonica in modo diretto ed efficiente, perché il sonotrodo è a diretto contatto con il campione. Le tecniche di omogeneizzazione ad azionamento meccanico comportano spesso una minore efficienza di trasferimento dell’energia. La lavorazione a ultrasuoni non richiede sfere di macinazione consumabili né tenute rotanti nel flusso di prodotto, né ugelli o camere che possano intasarsi con massa cellulare viscosa, e non comporta contaminazione incrociata tra i lotti.

La sonicazione può danneggiare il virus o l’antigene?

Questo è il compito chiave di ottimizzazione, ed è controllabile. Regolando i parametri della lavorazione a ultrasuoni, gli effetti della sonicazione possono essere controllati con precisione: un’ampiezza bassa e una sonicazione breve hanno effetti molto delicati, mentre ampiezze elevate, pressione elevata e una durata di sonicazione più lunga danno una lavorazione intensa. Poiché l’intensità può essere regolata con precisione sul campione biologico, si evitano l’eccesso di trattamento, la degradazione e le perdite di resa. In pratica, ampiezza, tempo di permanenza e numero di passaggi vengono impostati al minimo che raggiunga il tasso di disgregazione desiderato, con monitoraggio continuo della temperatura e raffreddamento.

Il trattamento a ultrasuoni riduce la viscosità del raccolto?

Sì. I raccolti densi, ad alta densità cellulare, sono viscosi e difficili da pompare a causa del DNA delle cellule ospiti rilasciato e non frammentato. Il trattamento a ultrasuoni taglia e frammenta DNA e RNA, solubilizza la massa cellulare e disaggrega i detriti cellulari. Il risultato è una sospensione omogenea e pompabile che alimenta in modo più efficiente la chiarificazione, la centrifugazione e la cromatografia. La frammentazione di DNA e RNA mediante sonicazione controllata è un’applicazione di laboratorio ben consolidata della stessa tecnologia.

Posso eseguire il processo in modalità continua in linea?

Sì. I sonicatori di Hielscher sono progettati per il funzionamento continuo 24/7 in ambienti industriali e possono essere configurati con celle a flusso e reattori per la sonicazione continua in linea, anelli di ricircolo o l’integrazione in skid di produzione e linee di lavorazione. Sono possibili sia il passaggio singolo sia il passaggio multiplo.

Come si passa dal laboratorio alla produzione?

In modo lineare, sulla base dell’energia immessa misurabile. Tutti i risultati di sonicazione ottenuti con un omogeneizzatore a ultrasuoni di Hielscher possono essere scalati linearmente a portate più elevate nella produzione industriale; i parametri di sonicazione sviluppati con un sonicatore da banco possono essere trasferiti direttamente a sistemi di Hielscher più grandi. Il criterio di scale-up è l’energia specifica immessa per volume, insieme ad ampiezza, tempo di permanenza e temperatura. La consulenza di processo di Hielscher comprende raccomandazioni per l’ottimizzazione dei parametri (ampiezza, energia specifica E/V, tempo di permanenza, controllo di temperatura e pressione) legate all’energia immessa misurabile.

La disgregazione cellulare a ultrasuoni è adatta alla produzione in camera bianca e in stile GMP?

Gli ultrasonicatori di Hielscher possono essere facilmente installati in laboratori a camera bianca e in impianti di produzione. Gli alloggiamenti sono realizzati in plastica antibatterica o acciaio inossidabile. Tutte le parti a contatto con il prodotto, come i sonotrodi e le celle a flusso, sono realizzate in titanio o acciaio inossidabile e possono essere sterilizzate in autoclave. Sono disponibili reattori a cella a flusso speciali che soddisfano i requisiti avanzati CIP (clean-in-place) e SIP (sterilize-in-place). Il trasduttore della serie industriale UIP ha grado di protezione IP64 e può essere installato in ambienti impegnativi mentre il generatore viene posizionato a distanza. Poiché i sonicatori di Hielscher convertono l’energia elettrica in oscillazione meccanica con un’efficienza molto elevata di circa 80–90% dalla presa di corrente al liquido, il trasduttore può essere integrato in alloggiamenti chiusi senza feritoie e non è necessario alcun raffreddamento forzato, come aria compressa o acqua. Ciò significa anche che nessun mezzo di raffreddamento entra in contatto con il processo. La documentazione automatica del processo supporta la tracciabilità e la riproducibilità nella produzione regolamentata.

La sonicazione può anche inattivare il virus per un vaccino inattivato?

Sì. Gli ultrasuoni di potenza trovano applicazione nell’inattivazione di patogeni come batteri e virus. Con la dose e l’intensità di sonicazione appropriate, cellule e microbi possono essere trattati in base all’obiettivo del processo, così che la stessa piattaforma serve sia per la lisi ai fini della raccolta sia per l’inattivazione. La combinazione di sonicazione e calore, nota come termosonicazione, offre una velocità di sterilizzazione più elevata con un’intensità e una durata termiche notevolmente ridotte, il che è vantaggioso per preservare composti sensibili al calore come proteine e antigeni. L’inattivazione a ultrasuoni viene generalmente utilizzata in combinazione con la chimica di inattivazione consolidata, e la cinetica di inattivazione completa deve essere validata per ogni specifico virus.

Lo stesso sistema può essere utilizzato per le fasi di formulazione dopo la raccolta?

Sì. La stessa piattaforma gestisce la dispersione degli antigeni in sospensioni, polimeri o incapsulamenti liposomiali, la disaggregazione e la distribuzione uniforme di antigeni e adiuvanti a base di alluminio come Alhydrogel™, la formulazione di vaccini in liposomi e nanoparticelle lipidiche solide con un controllo preciso delle dimensioni del vettore e la fase di degasaggio prima del riempimento in flaconi o siringhe.