Vaccini virali basati su colture cellulari – Efficace disgregazione cellulare mediante sonicazione

Domande frequenti sulla disgregazione cellulare ad ultrasuoni per la produzione di vaccini a base virale

Che cos’è la disgregazione cellulare ad ultrasuoni?

La disgregazione cellulare ad ultrasuoni utilizza ultrasuoni ad alta intensità, tipicamente compresi tra 20 e 30 kHz, per rompere le membrane cellulari e liberare il materiale intracellulare. Le onde ultrasoniche ad alta potenza creano bolle di cavitazione nel liquido. Quando queste bolle collassano, generano intense forze di taglio locali e microcorrenti che distruggono meccanicamente le cellule e favoriscono il trasferimento di massa tra l’interno della cellula e il mezzo circostante. Nella produzione di vaccini, questo processo viene utilizzato per lisare le colture cellulari infettate da virus e per rilasciare le particelle virali intracellulari e associate alla membrana nel prodotto finale.

Perché ricorrere alla sonicazione anziché alla lisi chimica o enzimatica per il recupero del virus?

La sonicazione agisce esclusivamente tramite forze meccaniche. Non sono necessari detergenti, lisozima, proteinasi K o altri reagenti di lisi che potrebbero alterare il lisato, interferire con la purificazione a valle o dover essere rimossi prima dell’ulteriore trattamento. I reagenti chimici richiedono in genere una preparazione in più fasi, che richiede molto tempo, per evitare l’inibizione dei test successivi e di altre fasi di post-trattamento. La disgregazione enzimatica richiede lunghi tempi di incubazione e spesso fornisce risultati non riproducibili. La lisi ultrasonica inoltre riunisce le fasi di risospensione, disgregazione ed estrazione in un’unica operazione continua. Laddove il vostro processo richieda una fase assistita da detergenti o enzimi, la sonicazione la potenzia anziché sostituirla: la cavitazione indebolisce le membrane e migliora l’esposizione uniforme di tutte le cellule al reagente.

In che modo la sonicazione si differenzia dai metodi di omogeneizzazione meccanica?

I sonicatori a sonda trasferiscono l’energia ultrasonica in modo diretto ed efficiente, poiché il sonotrodo è a contatto diretto con il campione. Le tecniche di omogeneizzazione ad azionamento meccanico comportano spesso un’efficienza di trasferimento dell’energia inferiore. Il trattamento a ultrasuoni non richiede l’uso di sfere di macinazione consumabili o guarnizioni rotanti nel flusso del prodotto, né ugelli o camere che possano ostruirsi a causa della massa cellulare viscosa, né comporta contaminazione incrociata tra i lotti.

La sonicazione può danneggiare il virus o l’antigene?

Questo è il compito chiave di ottimizzazione ed è controllabile. Regolando i parametri del trattamento ultrasonico, è possibile controllare con precisione gli effetti della sonicazione: un’ampiezza bassa e una sonicazione breve producono effetti molto delicati, mentre ampiezze elevate, pressione elevata e una durata più lunga della sonicazione determinano un trattamento intenso. Poiché l’intensità può essere regolata esattamente in base al campione biologico, si evitano un trattamento eccessivo, la degradazione e la perdita di resa. In pratica, l’ampiezza, il tempo di permanenza e il numero di passaggi vengono impostati al minimo necessario per raggiungere il tasso di disgregazione desiderato, con monitoraggio continuo della temperatura e raffreddamento.

Il trattamento a ultrasuoni riduce la viscosità del prodotto raccolto?

Sì. I raccolti densi, con elevata densità cellulare, sono viscosi e difficili da pompare a causa del DNA delle cellule ospiti rilasciato e non frammentato. Il trattamento ultrasonico taglia e frammenta il DNA e l’RNA, solubilizza la massa cellulare e disagglomera i detriti cellulari. Il risultato è una sospensione omogenea e pompabile che favorisce in modo più efficiente i processi di chiarificazione, centrifugazione e cromatografia. La frammentazione del DNA e dell’RNA mediante sonicazione controllata è un’applicazione di laboratorio ben consolidata della stessa tecnologia.

Posso eseguire il processo in modalità continua in linea?

Sì. I sonicatori Hielscher sono progettati per un funzionamento continuo 24 ore su 24, 7 giorni su 7, in ambienti industriali e possono essere configurati con celle di flusso e reattori per la sonicazione continua in linea, circuiti di ricircolo o integrazione in skid di produzione e linee di lavorazione. Sono possibili sia il funzionamento a passaggio singolo che a passaggi multipli.

Come posso passare dalla fase di laboratorio alla produzione su larga scala?

In modo lineare, sulla base dell’apporto energetico misurabile. Tutti i risultati di sonicazione ottenuti con un omogeneizzatore a ultrasuoni Hielscher possono essere scalati linearmente per raggiungere portate più elevate nella produzione industriale; i parametri di sonicazione sviluppati con un sonicatore da banco possono essere trasferiti direttamente a sistemi Hielscher di dimensioni maggiori. Il criterio di scalabilità è l’apporto energetico specifico per volume, insieme all’ampiezza, al tempo di permanenza e alla temperatura. La consulenza di processo di Hielscher include raccomandazioni per l’ottimizzazione dei parametri (ampiezza, energia specifica E/V, tempo di permanenza, temperatura e controllo della pressione) in relazione all’apporto energetico misurabile.

La disgregazione cellulare a ultrasuoni è adatta alla produzione in camera bianca e secondo gli standard GMP?

Gli ultrasonatori Hielscher possono essere facilmente installati in laboratori con camera bianca e impianti di produzione. Gli alloggiamenti sono realizzati in plastica antibatterica o acciaio inossidabile. Tutte le parti a contatto con il fluido, come i sonotrodi e le celle di flusso, sono realizzate in titanio o acciaio inossidabile e possono essere sterilizzate in autoclave. Sono disponibili speciali reattori a cella di flusso che soddisfano i requisiti avanzati CIP (clean-in-place) e SIP (sterilize-in-place). Il trasduttore della serie industriale UIP è classificato IP64 e può essere installato in ambienti difficili, mentre il generatore viene posizionato a distanza. Poiché i sonicatori Hielscher convertono l’energia elettrica in oscillazioni meccaniche con un’efficienza molto elevata, pari a circa l’80–90% dalla presa di alimentazione al liquido, il trasduttore può essere integrato in alloggiamenti chiusi senza feritoie e non è necessario alcun raffreddamento forzato, come aria compressa o acqua. Ciò significa anche che nessun mezzo di raffreddamento entra in contatto con il processo. La documentazione automatica del processo garantisce la tracciabilità e la riproducibilità nella produzione regolamentata.

La sonicazione può inattivare il virus anche nel caso di un vaccino inattivato?

Sì. Gli ultrasuoni ad alta potenza trovano applicazione nell’inattivazione di agenti patogeni quali batteri e virus. Con la dose e l’intensità di sonicazione appropriate, le cellule e i microbi possono essere trattati in base all’obiettivo del processo, pertanto la stessa piattaforma consente sia la lisi per la raccolta che l’inattivazione. La combinazione di sonicazione e calore, nota come termosonicazione, offre una velocità di sterilizzazione più elevata con un’intensità termica e una durata significativamente ridotte, il che è vantaggioso per preservare composti termosensibili quali proteine e antigeni. L’inattivazione ultrasonica viene generalmente utilizzata in combinazione con metodi chimici di inattivazione consolidati, e la cinetica completa di inattivazione deve essere convalidata per ogni specifico virus.

È possibile utilizzare lo stesso sistema per le fasi di formulazione successive alla raccolta?

Sì. La stessa piattaforma gestisce la dispersione degli antigeni in sospensioni, polimeri o incapsulamenti liposomiali, la deagglomerazione e la distribuzione uniforme di antigeni e adiuvanti a base di alluminio come Alhydrogel™, la formulazione di vaccini in liposomi e nanoparticelle lipidiche solide con un controllo preciso delle dimensioni del vettore, nonché la fase di degassificazione prima del riempimento in fiale o siringhe.