Ekstrakcija proteina iz tumorskog tkiva potpomognuta sonikacijom – protokol

Ovaj protokol opisuje metodu ekstrakcije proteina iz tumorskog tkiva potpomognutu sonikacijom koja unapređuje standardni CPTAC postupak lize urejom dodavanjem kontroliranog koraka sonikacije sondom tijekom razaranja tkiva. Nadovezujući se na ustaljenu CPTAC strategiju pripreme za dubinsku analizu proteoma i fosfoproteoma, ova modifikacija poboljšava razaranje stanica i substaničnih struktura, smanjuje viskoznost uzorka i pospješuje oslobađanje proteina koje je obično teže izdvojiti samo lizom urejom, osobito proteina vezanih za membrane te proteina koji se vežu za DNA ili su povezani s jezgrom. U istraživanju na kojem se temelji ovaj protokol postupak potpomognut sonikacijom povećao je detekciju i proteina i fosfopeptida uz očuvanje kompatibilnosti s daljnjim koracima razgradnje proteina prema CPTAC pristupu, označavanja TMT-om, frakcioniranja, obogaćivanja fosfopeptida i analize LC-MS/MS.

Ekstrakcija proteina iz tumorskog tkiva potpomognuta sonikacijom za dubinsku proteomsku i fosfoproteomsku analizu

Sljedeći protokol optimiziran je za ekstrakciju proteina iz kriogeno usitnjenog tumorskog tkiva u puferu za lizu s 8 M urejom: dodani korak sonikacije sondom poboljšava izdvajanje teško dostupnih skupina proteina, osobito proteina povezanih s membranama te s DNA ili jezgrom, prije razgradnje proteina i daljnje analize LC-MS/MS. U istraživanju Li et al. (2025), na kojem se temelji ovaj protokol, dodavanje sonikacije povećalo je detekciju proteina povezanih s membranama i jezgrom te je u okviru njihova postupka omogućilo dubinsku pokrivenost s >12.000 proteina i >25.000 fosfopeptida.

Područje primjene protokola

Primijenite ovaj postupak za:

• svježe zamrznuto, kriogeno usitnjeno tumorsko tkivo
• stanične taloge ili druge biološke uzorke za koje je ekstrakcija urejom već ustaljena
• postupke globalne proteomike i fosfoproteomike koji uključuju razgradnju tripsinom i neobvezno označavanje TMT-om

U istraživanju Li et al. (2025) navodi se da je postupak primjenjiv i na druge vrste uzoraka, poput staničnih linija, krvi i urina, no ovisno o vrsti uzorka može biti potrebna optimizacija.

Optimizirani postupak pripreme uzoraka s uvedenim korakom sonikacije. Optimizirani postupak i eksperimentalni dizajn temelje se na CPTAC protokolu pripreme uzoraka za globalnu proteomsku i fosfoproteomsku analizu.
Istraživanje i shema: ©Li et al., 2025

Načelo rada

U izvornom istraživanju standardnom CPTAC postupku lize urejom dodana je sonikacija te je utvrđena poboljšana detekcija proteina povezanih s membranama i jezgrama. Autori navode da parametre sonikacije treba precizno prilagoditi veličini/koncentraciji uzorka – odabirom veličine sonotrode, unosa energije i vremenskih postavki impulsa.

Primjerice, za Hielscher UP200Ht i UP200St to znači:

• upotrebljavajte amplitudu i impulsni način rada kao glavne upravljačke varijable
• održavajte uzorke hladnima tijekom cijelog postupka (tj. na ledu)
• započnite s umjerenim postavkama
• optimizirajte prema bistrini uzorka, temperaturi, prinosu proteina i kvaliteti peptida u daljnjim koracima

 
Oba modela sonikatora Hielscher snage 200 watts, UP200Ht i UP200St, namijenjena su malim i srednjim volumenima uzoraka, s podesivom amplitudom i postavkama impulsa; oba ultrazvučna homogenizatora nude digitalno upravljanje putem dodirnog zaslona za precizno podešavanje parametara, automatsko bilježenje podataka, priključivi temperaturni senzor, daljinsko upravljanje i osvjetljenje uzorka.
 

Reagensi za ekstrakciju proteina potpomognutu sonikacijom

Pufer za lizu s urejom

Pripremite svježi pufer neposredno prije uporabe:

• 8 M ureja
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/mL aprotinina
• 10 µg/mL leupeptina
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 2, 1:100 (v/v)
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 3, 1:100 (v/v)

Ureja mora biti potpuno otopljena prije dodavanja aditiva; inhibitore treba dodati neposredno prije uporabe; pufer treba držati na ledu; nakon dodavanja aditiva preporučuje se blago kružno miješanje umjesto snažnog miješanja na vorteks-miješalici.
 

Dodatni reagensi:

• Reagensi za određivanje koncentracije proteina BCA metodom
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• Jodoacetamid
• LysC
• Tripsin
• Mravlja kiselina
• TMT reagensi, ako se primjenjuje multipleksirana kvantitativna proteomika
• IMAC reagensi, ako se provodi obogaćivanje fosfopeptida

Oprema za ekstrakciju proteina potpomognutu sonikacijom

Potrebno

Preporučeni odabir sonde

Za uzorke volumena oko 200–1000 µL upotrebljavajte sonotrodu malog promjera prikladnu za izravnu obradu malih volumena visokim intenzitetom. Hielscher nudi sonotrode različitih promjera, a manji promjeri vrha omogućuju veći intenzitet na vrhu.

Praktična napomena: Upotrebljavajte najmanju sondu koja omogućuje učinkovito miješanje bez prekomjernog pjenjenja ili dodirivanja stijenke posude.

Ako istodobno radite s više uzoraka, mogli biste razmotriti sonikator za više epruveta VialTweeter ili sonikator za mikrotitarske pločice UIP400MTP!

Upute korak po korak: postupak ekstrakcije proteina potpomognute sonikacijom

A. Prethodno hlađenje i priprema

1. Ohladite centrifugu na 4°C.
2. Pripremite svjež pufer za lizu na bazi ureje i držite ga na ledu.
3. Postavite UP200Ht ili UP200St na stalak unutar zvučno izoliranog kućišta.
4. Pripremite ledenu kupelj dovoljno veliku da epruvete s uzorcima drži uspravno i stabilno.

Priprema svježeg pufera i rukovanje pri niskoj temperaturi ključni su.

B. Početna ekstrakcija urejom

1. Držite kriogeno usitnjeno tkivo na ledu.
2. Dodajte 200 µL ohlađenog pufera za lizu na bazi ureje na svakih 50 mg vlažnog tkiva.
3. Miješajte na vorteks miješalici 5–10 s pri velikoj brzini.
4. Inkubirajte 15 min pri 4°C.
5. Ponovite korak miješanja na vorteks miješalici i inkubacije još jednom.
6. Centrifugirajte pri 20.000g tijekom 10 min na 4°C.
7. Prenesite lizat/supernatant u čistu epruvetu s niskim vezanjem proteina.

C. Sonikacija uz upotrebu uređaja UP200Ht ili UP200St

Početni uvjeti za sonikaciju

• Amplituda: započnite pri 20–30%
• Trajanje impulsa: 5 s uključeno
• Hlađenje: 2 min na ledu između impulsa
• Broj ciklusa: 4 ciklusa
• Ukupno vrijeme aktivne sonikacije: 20 s
• Ukupno vrijeme postupka uključujući hlađenje: oko 8–10 min

Koraci sonikacije

1. Prenesite lizat u epruvetu prikladnu za sonikaciju. Upotrijebite usku epruvetu tankih stijenki koja omogućuje dobru izmjenu topline i sigurno uranjanje sonde.
2. Stavite epruvetu u ledenu kupelj. U radu se hlađenje tijekom sonikacije navodi kao ključno za sprječavanje toplinskog oštećenja.
3. Uronite vrh sonde u uzorak. Držite vrh dovoljno uronjenim za stabilnu kavitaciju, ali ne dopustite da dodiruje stijenku ili dno epruvete.
4. Primijenite jedan impuls od 5 s pri početnoj amplitudi.
5. Odmah vratite uzorak u cijelosti na led na 2 min.
6. Ponavljajte dok ne dovršite 4 ciklusa.
7. Pregledajte lizat nakon ciklusa.
8. Nastavite samo ako je potrebno, primjenjujući svaki put po jedan dodatni impuls od 5 s, nakon kojeg uvijek slijedi potpuno hlađenje.
9. Zaustavite postupak kada lizat postane ujednačeniji i manje rastezljiv/viskozan.
   Krajnja točka je prozirniji lizat koji stvara kapljice umjesto neprekinutog viskoznog mlaza.
10. Centrifugirajte pri približno 16.000g tijekom 15 min na 4°C.
11. Prenesite izbistreni supernatant u novu epruvetu i izmjerite koncentraciju proteina.

Usporedba globalne proteomike i fosfoproteomike između soniciranih i nesoniciranih uzoraka.
a. Broj identificiranih proteina (globalna proteomika) u svim tumorskim tkivima PDX sa sonikacijom ili bez nje. b. Broj identificiranih fosfopeptida (obogaćivanje metodom IMAC) u svim tumorskim tkivima PDX sa sonikacijom ili bez nje. Ubrojeni su samo proteini i fosfopeptidi s omjerom zastupljenosti većim od ili jednakim 25. percentilu. Omjer zastupljenosti izračunat je između istih vrsta uzoraka.
Studija i grafikoni: ©Li et al., 2025

Naknadna digestija i analiza

Nakon sonikacije i bistrenja nastavite kako je opisano u izvornom tijeku rada prema pristupu CPTAC:

1. Razrijedite lizat u omjeru 1:3 (v/v) s 50 mM Tris-HCl pri pH 8,0 kako biste smanjili koncentraciju ureje na <2 M.
2. Dodajte LysC u količini od 1 mAU na 50 µg proteina i inkubirajte 2 h pri 25°C.
3. Dodajte tripsin u omjeru enzim:supstrat 1:49 (w/w) i provodite digestiju preko noći pri 25°C.
4. Zaustavite reakciju mravljom kiselinom do konačne koncentracije od 1%.
5. Prema potrebi nastavite s odsoljavanjem, označavanjem TMT-om, frakcioniranjem, obogaćivanjem fosfopeptida i analizom LC-MS/MS.

Diferencijalna ekspresija fosfopeptida iz MS analize s označavanjem TMT-om.
a. Bazalni podtip, s istaknutim pojedinim ljudskim fosfopeptidima (početak i kraj protein-sequence) čija je ekspresija povećana u sonikiranim uzorcima u usporedbi s nesonikiranim uzorcima. b. Luminalni podtip, s istaknutim pojedinim ljudskim fosfopeptidima (početak i kraj protein_sequence) čija je ekspresija povećana u sonikiranim uzorcima u usporedbi s nesonikiranim uzorcima. c. Obogaćeni putovi KEGG na temelju proteina kojima pripadaju fosfopeptidi s povećanom ekspresijom u sonikiranom bazalnom podtipu tumora. d. Obogaćeni putovi KEGG na temelju proteina kojima pripadaju fosfopeptidi s povećanom ekspresijom u sonikiranom luminalnom podtipu tumora.
Studija i grafikoni: ©Li et al., 2025

Projektiranje, proizvodnja i savjetovanje – kvaliteta proizvedena u Njemačkoj

Hielscher ultrazvučni uređaji poznati su po najvišim standardima kvalitete i dizajna. Robusnost i jednostavno rukovanje omogućuju nesmetanu integraciju naših ultrazvučnih uređaja u industrijska postrojenja. Hielscher ultrazvučni uređaji lako podnose teške uvjete i zahtjevna okruženja.

Hielscher Ultrasonics tvrtka je s ISO certifikatom koja poseban naglasak stavlja na ultrazvučne uređaje visokih performansi s najsuvremenijom tehnologijom i jednostavnim rukovanjem. Naravno, Hielscher ultrazvučni uređaji sukladni su zahtjevima za oznaku CE i ispunjavaju zahtjeve UL, CSA i RoHs.

Literatura / reference

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.