Proteomički radni postupci s razgradnjom proteina visoke propusnosti

Proteomika je ključno područje za razumijevanje bioloških procesa i sustava, a razgradnja proteina presudan je korak u njezinim radnim postupcima. Tradicionalno se razgradnja proteina provodi u otopini pomoću proteolitičkih enzima poput tripsina, koji specifično hidrolizira peptidne veze na ostatcima lizina i arginina. Tim procesom nastaju peptidi prikladni za ionizaciju i fragmentaciju u primjenama masene spektrometrije (MS). Međutim, za potpunu razgradnju konvencionalnim metodama potrebno je 12–24 sata, što stvara značajna uska grla u proteomičkim radnim postupcima.
Ultrazvučna obrada nudi moćnu alternativu, drastično skraćujući vrijeme razgradnje sa sati na samo nekoliko minuta. U kombinaciji s naprednim sonikatorima za više uzoraka, kao što su Hielscher CupHorn, VialTweeter i sonikator za pločice s 96 jažica UIP400MTP, ultrazvučna obrada omogućuje ubrzanu proteomiku visoke propusnosti. Te tehnologije pojednostavnjuju radne postupke, skraćuju vrijeme pripreme uzoraka i povećavaju učinkovitost bez narušavanja ponovljivosti ili kvalitete podataka.

Uloga ultrazvučne energije u razgradnji proteina

Ultrazvučna obrada koristi fokusirane ultrazvučne valove za stvaranje kavitacije – lokaliziranih mikromjehurića koji kolabiraju i stvaraju snažne smične sile. Ta pojava poboljšava prijenos mase, potiče miješanje enzima sa supstratima i odmata proteinske strukture, izlažući mjesta cijepanja proteolitičkim enzimima poput tripsina.
Rezultat? Značajno skraćenje vremena razgradnje bez narušavanja učinkovitosti ili ponovljivosti.

Proteolitička razgradnja potpomognuta ultrazvukom: metodologija i rezultati

Protokol ubrzane razgradnje

Razgradnja potpomognuta ultrazvukom kombinira proteolitičke enzime i ultrazvučnu energiju radi ubrzavanja radnih postupaka. Primjerice, pri uporabi uređaja Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz), postupak razgradnje odvija se ovako:

1. Redukcija: Uzorci proteina (0,5 mg/mL, 20 µL) obrađuju se DTT-om (2 µL, 110 mM) u puferu amonijeva bikarbonata (12,5 mM). Sonikacija se provodi pri amplitudi od 50% tijekom 5 minuta.
2. Alkilacija: Nakon dodavanja IAA (2 µL, 400 mM), sonikacija se ponavlja pod istim uvjetima.
3. Razgradnja: Uzorci se razrjeđuju i inkubiraju s nanočesticama s imobiliziranim tripsinom. Završnim ciklusom sonikacije (5 minuta) dovršava se razgradnja. Peptidi se odvajaju, suše i pohranjuju za MS analizu.

Ova ultrazvučna metoda skraćuje ukupno vrijeme pripreme s 12 sati na manje od 30 minuta. Unatoč ubrzanom procesu, prinos i kvaliteta peptida ostaju usporedivi s onima dobivenima tradicionalnim metodama koje se provode preko noći.

Učinkovitost ultrazvučne razgradnje proteina

U usporednim istraživanjima s proteomima E. coli:

• Identifikacija proteina: U ultrazvučno razgrađenim uzorcima identificirano je 777 proteina u 5 minuta, u usporedbi s 817 u 12 sati. Udio proteina identificiranih objema metodama premašio je 70%.
• Ponovljivost: Ponovljene analize pokazale su vrijednosti korelacije iznad 98% unutar svake metode, što potvrđuje pouzdanost.
• Selektivnost: Svaka je metoda preferencijalno razgrađivala određene proteine, pri čemu je ultrazvučna razgradnja pogodovala razgradnji 65 proteina, a razgradnja preko noći 54 proteina. Takve suptilne razlike naglašavaju jedinstveni potencijal ultrazvučne obrade za specifične primjene.

Rezultati kvantifikacije proteina bez obilježavanja za sedam proteina dodanih u uzorak E. coli.
Sljedeći proteini dodani su u dvije različite količine, kako je navedeno u stupcu
pod nazivom „Theo Ratio”. Theo Ratio je teorijski omjer između dviju količina upotrijebljenih u ovom
pokusu. Goveđi serumski albumin (ALBU), β-laktoglobulin (LACB), α-S1 kazein (CASA1),
α-S2 kazein (CASA2), citokrom c (CYC), ovalbumin (OVAL) i karboanhidraza 2
(CAH2). Omjeri su izračunani na temelju LFQ intenziteta proteina dobivenih analizom u programu MaxQuant.
Studentov t-test primijenjen je za usporedbu vrijednosti dobivenih svakom metodom (p>0,01, n=3, t-theoretical=4,6).
Istraživanje i grafički prikaz: © Martins et al., 2019)

Tripsin imobiliziran na nanočesticama

Kombiniranje nanočestica s imobiliziranim tripsinom (npr. T-FMNPs) sa sonikacijom dodatno poboljšava proteomičke radne postupke. Te nanočestice pružaju veliku površinu za interakcije enzima i supstrata, čime povećavaju učinkovitost. Kada se primjenjuje na složene proteome, poput proteoma E. coli, kombinirana metoda postiže:

• Brzina: Potpuna digestija unutar 5 minuta.
• Točnost: Kvantifikacija proteina usporediva s tradicionalnim metodama (p > 0,01, n=3).
• Skalabilnost: Prilagodba platformama s više jažica poput uređaja UIP400MTP omogućuje obradu velikog broja uzoraka.

Kliknite ovdje za detaljan protokol s uputama korak po korak!
(usp. Martins i sur., 2019)

Brza proteolitička digestija velikog broja uzoraka uz Hielscher sonikatore

Najbolji modeli sonikatora za proteomiku

Hielscher Ultrasonics nudi različite modele sonikatora za istodobnu pripremu više uzoraka, čime olakšava radne postupke s velikim brojem uzoraka. Bilo da radite s bočicama, epruvetama, pločama s više jažica (npr. pločama sa 6, 24 ili 96 jažica) ili Petrijevim zdjelicama – nudimo vam idealne sonikatore za vaše eksperimente.

UIP400MTP sonikator za ploče s više jažica

Za najveći kapacitet obrade, UIP400MTP omogućuje ultrazvučnu obradu ploča s 96 jažica. Kompatibilan s bilo kojom standardnom mikropločom, UIP400MTP ne zahtijeva skupi potrošni materijal specifičan za proizvođača i daje vam slobodu odabira najbolje ploče s više jažica za vaše istraživanje. Ravnomjernom raspodjelom energije po cijeloj ploči omogućuje brzu redukciju, alkilaciju i digestiju do 200 složenih proteoma u samo 1 sat. Ta razina automatizacije i učinkovitosti ključna je za proteomiku s velikim brojem uzoraka i kliničke primjene. Saznajte više o sonikatoru za ploče s više jažica!

VialTweeter

VialTweeter je prilagođen laboratorijima kojima je potrebna istodobna sonikacija do 10 bočica ili epruveta. Njegov neinvazivni pristup uklanja rizike od križne kontaminacije te istodobno osigurava reproducibilnu digestiju proteina. Ovaj je uređaj idealan za istraživače koji rade s ograničenim volumenima uzoraka ili različitim vrstama uzoraka.
Saznajte više o sonikatoru VialTweeter za više epruveta!

Hielscher UP200St-CupHorn

Sonikator CupHorn snažan je uređaj namijenjen istodobnoj obradi više uzoraka u zatvorenim spremnicima. Osigurava ravnomjernu raspodjelu ultrazvučne energije i preciznu kontrolu temperature. Mogućnost istodobne obrade do pet uzoraka, zajedno s kompatibilnošću s radnim postupcima koji uključuju redukciju, alkilaciju i digestiju, čini CupHorn pouzdanim alatom za proteomiku temeljenu na MS analizi.
Saznajte više o uređaju CupHorn SonoReactor!

Protokol korak po korak za proteolitičku digestiju potpomognutu sonikacijom uz primjenu tripsina imobiliziranog na nanočesticama

Ovaj protokol autora Martins i sur. (2019) optimiziran je za brzu digestiju proteina uz primjenu ultrazvučne energije i tripsina imobiliziranog na nanočesticama (T-FMNPs). Opisani koraci osiguravaju učinkovitu redukciju, alkilaciju i proteolizu prikladnu za primjene u masenoj spektrometriji (MS).
Koraci protokola

1. Redukcija disulfidnih veza
   • Dodajte 2 µL otopine DTT-a (110 mM) u 20 µL uzorka proteina (0,5 mg/mL) u puferu AmBic.
   • Stavite epruvetu s uzorkom u sonoreaktor UP200St-CupHorn.
   • Sonicirajte uzorak 2,5 minute pri amplitudi od 50% (200 W, 26 kHz).
   • Napravite kratku stanku kako bi se uzorak ohladio, a zatim sonicirajte još 2,5 minute pod istim uvjetima.
2. Alkilacija reduciranih cisteinskih ostataka
   • Dodajte 2 µL otopine IAA (400 mM) u reducirani uzorak proteina.
   • Sonicirajte 2,5 minute pri amplitudi od 50% kako biste olakšali alkilaciju.
   • Napravite stanku radi hlađenja, a zatim sonicirajte još 2,5 minute.

   Napomena: Svedite izlaganje alkiliranog uzorka svjetlosti na najmanju moguću mjeru kako biste spriječili razgradnju IAA.

3. Razrjeđivanje uzorka
   • Razrijedite alkilirani uzorak proteina do konačnog volumena od 100 µL koristeći 25 mM pufer AmBic koji sadržava 4% acetonitrila (v/v).
   • Temeljito promiješajte nježnim pipetiranjem.
4. Proteolitička digestija uz primjenu tripsina imobiliziranog na nanočesticama
   • Dodajte 20 µL otopine T-FMNP (3 mg/mL) u razrijeđeni uzorak proteina.
   • Sonicirajte smjesu u sonoreaktoru 2,5 minute pri amplitudi od 50%.
   • Napravite stanku radi hlađenja, zatim sonicirajte još 2,5 minute pod istim uvjetima.
5. Odvajanje nanočestica s imobiliziranim tripsinom
   • Magnetom odvojite T-FMNP-ove od supernatanta koji sadržava peptide nastale digestijom.
   • Prenesite supernatant u novu mikrocentrifugacijsku epruvetu.
6. Priprema peptida za MS analizu
   • Osušite supernatant koji sadržava peptide u vakuumskoj centrifugi.
   • Čuvajte osušene peptide na -20°C do daljnje analize masenom spektrometrijom.