Proteomski tijek rada s visokoučinkovitom probavom proteina

Proteomika je ključno polje za razumijevanje bioloških procesa i sustava, a probava proteina čini ključni korak u njezinim radnim procesima. Tradicionalno, probava proteina se provodi u otopini pomoću proteolitičkih enzima poput tripsina, koji specifično hidrolizira peptidne veze na ostacima lizina i arginina. Ovaj proces stvara peptide pogodne za ionizaciju i fragmentaciju u primjenama masene spektrometrije (MS). Međutim, konvencionalne metode probave zahtijevaju 12-24 sata da se postigne završetak, stvarajući značajna uska grla u proteomskim tijekovima rada.
Ultrasonication nudi moćnu alternativu, dramatično skraćujući vrijeme probave sa sati na samo nekoliko minuta. U kombinaciji s naprednim sonikatorima za više uzoraka kao što su Hielscher CupHorn, VialTweeter i sonikator ploča s 96 jažica UIP400MTP, ultrazvučna obrada omogućuje ubrzanu proteomiku visokog protoka. Ove tehnologije pojednostavljuju tijek rada, smanjujući vrijeme pripreme uzorka i povećavajući učinkovitost bez ugrožavanja ponovljivosti ili kvalitete podataka.

Uloga ultrazvučne energije u probavi proteina

Ultrasonication koristi fokusirane ultrazvučne valove za stvaranje kavitacije - lokalizirane mikromjehuriće koji kolabiraju generirajući intenzivne sile smicanja. Ovaj fenomen pojačava prijenos mase, potiče miješanje enzima sa supstratima i razvija proteinske strukture, izlažući mjesta cijepanja proteolitičkim enzimima poput tripsina.
Rezultat? Značajno smanjenje vremena probave bez ugrožavanja učinkovitosti ili ponovljivosti.

Ultrazvučno poboljšana proteolitička probava: metodologija i rezultati

Protokol ubrzane probave

Ultrazvučno potpomognuta probava kombinira proteolitičke enzime i ultrazvučnu energiju kako bi se ubrzao tijek rada. Na primjer, korištenjem Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz), radni tijek probave odvija se na sljedeći način:

1. Redukcija: Uzorci proteina (0,5 mg/mL, 20 µL) tretirani su s DTT (2 µL, 110 mM) u puferu amonijevog bikarbonata (12,5 mM). Sonikacija se primjenjuje pri 50% amplitude tijekom 5 minuta.
2. Alkilacija: Nakon dodavanja IAA (2 µL, 400 mM), sonikacija se ponavlja pod istim uvjetima.
3. Probava: Uzorci se razrijede i inkubiraju s imobiliziranim nanočesticama tripsina. Posljednji krug sonikacije (5 minuta) dovršava probavu. Peptidi su odvojeni, osušeni i pohranjeni za MS analizu.

Ova ultrazvučna metoda smanjuje ukupno vrijeme pripreme s 12 sati na ispod 30 minuta. Unatoč ubrzanom procesu, prinos i kvaliteta peptida ostaju dosljedni tradicionalnim metodama preko noći.

Učinkovitost ultrazvučne probave proteina

U usporednim studijama s proteomima E. coli:

• Identifikacija proteina: Ultrazvučno obrađeni uzorci identificirali su 777 proteina u 5 minuta, u usporedbi s 817 u 12 sati. Zajedničke identifikacije proteina premašile su 70%.
• Ponovljivost: Ponovljene analize pokazale su vrijednosti korelacije iznad 98% unutar svake metode, pokazujući pouzdanost.
• Selektivnost: Određeni proteini su preferirano probavljeni svakom metodom, pri čemu je ultrazvučna probava pogodovala 65 proteina, a probava preko noći 54 proteina. Takve nijansirane razlike naglašavaju jedinstveni potencijal ultrazvučne obrade za specifične primjene.

Rezultati kvantifikacije proteina bez oznake sedam proteina ubačenih u E. coli
uzorak. Sljedeći proteini dodani su na dvije različite razine kao što je navedeno u stupcu
nazvan “Theo Ratio”. Theo ratio je teorijski omjer između dvije razine koje se koriste u ovome
eksperiment. Goveđi serum albumin (ALBU), β-laktoglobulin (LACB), α-S1 kazein (CASA1),
α-S2 kazein (CASA2), citokrom c (CYC), ovalbumin (OVAL) i karboanhidraza 2
(CAH2). Omjeri su izračunati pomoću LFQ intenziteta proteina dobivenog od MaxQuant
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
Studija i grafika: © Martins et al., 2019)

Tripsin imobiliziran nanočesticama

Integracija imobiliziranih nanočestica tripsina (npr. T-FMNP) s ultrazvučnom obradom dodatno poboljšava proteomičke tijekove rada. Ove nanočestice pružaju veliku površinu za interakcije enzima i supstrata, povećavajući učinkovitost. Kada se primijeni na složene proteome, kao što je E. coli, kombinirana metoda postiže:

• Ubrzati: Kompletna probava unutar 5 minuta.
• Točnost: Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• Skalabilnost: Prilagodba platformama s više jažica kao što je UIP400MTP omogućuje obradu visoke propusnosti.

Kliknite ovdje za detaljan protokol s uputama korak po korak!
(usp. Martins i sur., 2019.)

Proteolitička probava velikom brzinom i velikom propusnošću s Hielscher sonikatorima

Najbolji modeli sonikatora za proteomiku

Hielscher Ultrasonics nudi različite modele sonikatora za simultanu pripremu više uzoraka koji olakšavaju radne tijekove visoke propusnosti. Bilo da radite s bočicama, epruvetama, pločama s više jažica (npr. ploče sa 6, 24, 96 jažica) ili Petrijevim zdjelicama – nudimo vam idealne sonikatore za vaše eksperimente.

UIP400MTP sonikator ploče s više jažica

Za vrhunsku propusnost, UIP400MTP pruža mogućnost ultrazvučne obrade ploča s 96 jažica. Kompatibilan s bilo kojom standardnom mikropločicom, UIP400MTP ne zahtijeva skupe zaštićene jednokratne materijale i daje vam slobodu odabira najbolje ploče s više jažica za vaše istraživanje. Isporukom ravnomjerne energije preko ploče, omogućuje brzu redukciju, alkilaciju i probavu do 200 složenih proteoma u samo 1 satu. Ova razina automatizacije i učinkovitosti ključna je za visokoučinkovitu proteomiku i kliničke primjene. Saznajte više o sonikatoru ploče s više jažica!

VialTweeter

VialTweeter je prilagođen za laboratorije koji zahtijevaju istodobnu sonikaciju do 10 bočica ili epruveta. Njegov neinvazivni pristup eliminira rizike unakrsne kontaminacije, a istodobno osigurava ponovljivu probavu proteina. Ovaj je uređaj idealan za istraživače koji rade s ograničenim količinama uzoraka ili različitim vrstama uzoraka.
Saznajte više o sonikatoru s više cijevi VialTweeter!

Hielscher UP200St-CupHorn

CupHorn sonikator je snažan uređaj dizajniran za istodobnu obradu više uzoraka u zatvorenim spremnicima. Osigurava ravnomjernu distribuciju ultrazvučne energije i preciznu kontrolu temperature. Sposobnost obrade do pet uzoraka istovremeno, u kombinaciji s njegovom kompatibilnošću s reduciranim, alkiliranim i digestiranim tijekovima rada, čini CupHorn pouzdanim alatom za proteomiku temeljenu na MS-u.
Saznajte više o CupHorn SonoReactoru!

Protokol korak po korak za proteolitičku probavu potpomognutu ultrazvukom pomoću tripsina imobiliziranog nanočesticama

Ovaj protokol Martins et al. (2019) optimiziran je za brzu probavu proteina pomoću ultrazvučne energije i tripsina imobiliziranog nanočesticama (T-FMNP). Navedeni koraci osiguravaju učinkovitu redukciju, alkilaciju i proteolizu prikladnu za primjene masene spektrometrije (MS).
Koraci protokola

1. Redukcija disulfidnih veza
   • Dodajte 2 µL otopine DTT (110 mM) u uzorak proteina od 20 µL (0,5 mg/mL) u AmBic puferu.
   • Stavite epruvetu s uzorkom u sonoreaktor UP200St-CupHorn.
   • Sonicirajte uzorak 2,5 minute pri 50% amplitude (200 W, 26 kHz).
   • Zaustavite se u kratkom intervalu kako biste omogućili hlađenje, zatim sonicirate još 2,5 minute pod istim uvjetima.
2. Alkilacija reduciranih cisteinskih ostataka
   • Dodajte 2 µL otopine IAA (400 mM) reduciranom uzorku proteina.
   • Obrađujte ultrazvukom 2,5 minute pri 50% amplitude kako biste olakšali alkilaciju.
   • Pauza za hlađenje, zatim sonikirajte dodatne 2,5 minute.

   Napomena: Smanjite izlaganje alkiliranog uzorka svjetlu kako biste spriječili razgradnju IAA.

3. Razrjeđivanje uzorka
   • Razrijedite uzorak alkiliranog proteina do konačnog volumena od 100 µL pomoću 25 mM AmBic pufera koji sadrži 4% acetonitrila (v/v).
   • Laganim pipetiranjem temeljito promiješajte.
4. Proteolitička probava s tripsinom imobiliziranim nanočesticama
   • Dodajte 20 µL otopine T-FMNP (3 mg/mL) u razrijeđeni uzorak proteina.
   • Sonikirajte smjesu u sonoreaktoru 2,5 minute pri amplitudi od 50%.
   • Pauza za hlađenje, zatim sonikirajte još 2,5 minute pod istim uvjetima.
5. Odvajanje nanočestica tripsina
   • Pomoću magneta odvojite T-FMNP od supernatanta koji sadrži digestirane peptide.
   • Prenesite supernatant u novu epruvetu mikrocentrifuge.
6. Priprema peptida za MS analizu
   • Osušite supernatant koji sadrži peptide u vakuumskoj centrifugi.
   • Pohranite osušene peptide na -20°C do daljnje analize masenom spektrometrijom.