Ultrazvučna priprema uzoraka uz pomoć filtra (FASP): unapređenje proteomičkih radnih postupaka naprednom sonikacijom
Ultrazvučna priprema uzoraka uz pomoć filtra (FASP) sve se više ističe kao vrlo učinkovita i reproducibilna metoda u suvremenoj proteomici. Uključivanjem kontrolirane sonikacije u ustaljene radne postupke FASP-a istraživači mogu znatno poboljšati ekstrakciju proteina, učinkovitost digestije i ukupnu kvalitetu podataka. S rastućom potražnjom za pripremom uzoraka visoke propusnosti i reproducibilnosti, sonikatori s fokusiranim ultrazvukom, poput sonikatora za mikropločice UIP400MTP, dobivaju na znanstvenoj i praktičnoj važnosti.
Znanstveni kontekst: zašto je FASP važan u proteomici
Priprema uzoraka uz pomoć filtra (FASP) postala je zlatni standard u proteomici koja se temelji na pristupu odozdo prema gore zahvaljujući svojoj sposobnosti uklanjanja detergenata, soli i drugih kontaminanata uz istodobno omogućavanje učinkovite enzimske digestije. Međutim, klasični protokoli FASP-a često nailaze na ograničenja povezana s nepotpunom lizom, neujednačenom digestijom i varijabilnošću uzoraka – osobito pri radu sa složenim ili otpornim biološkim stanicama ili tkivima.
Upravo tu fokusirana ultrazvučna energija (sonikacija) pruža odlučujuću prednost. Stvaranjem mehaničkih smičnih sila i kavitacije sonikacija poboljšava više ključnih koraka u radnom postupku FASP-a bez narušavanja cjelovitosti proteina.
Sonikator za pločice s više jažica UIP400MTP olakšava pripremu uzoraka uz pomoć filtra (FASP)
Pozitivni učinci sonikacije u ultrazvučnom FASP-u
Sonikacija stvara kontroliranu akustičnu kavitaciju – nastajanje i kolaps mikroskopskih mjehurića – koja proizvodi lokalizirane smične sile i mikrostrujanje.
Sonikacija poboljšava i korak alkilacije i korak digestije u ultrazvučnom FASP-u poboljšanjem prijenosa tvari i ubrzavanjem kinetike reakcija. Primjena ultrazvučne energije stvara kavitaciju, što dovodi do lokaliziranog mikrostrujanja i prolaznih smičnih sila koje potiču brzo miješanje i učinkovito prodiranje reagensa u proteinski matriks ili okruženje filtra. Tijekom alkilacije to rezultira ujednačenijom i bržom modifikacijom cisteinskih ostataka jodoacetamidom. U koraku digestije sonikacija povećava dostupnost mjesta proteolitičkog cijepanja i poboljšava interakcije enzima i supstrata, čime ubrzava djelovanje tripsina i povećava učinkovitost digestije. Ukupno gledano, ultrazvučna obrada skraćuje vrijeme obrade uz očuvanje ili poboljšanje potpunosti i reproducibilnosti reakcije.
Pri pripremi uzoraka za proteomiku ultrazvučni FASP omogućuje:
- Učinkovitije razaranje stanica i ekstrakciju proteina, čak i u žilavim tkivima ili mikrobnim uzorcima
- Poboljšanu solubilizaciju proteina
- Bolju dostupnost proteina enzimima tijekom digestije
- Kraće vrijeme obrade i veću reproducibilnost
Za razliku od konvencionalnih mehaničkih ili kemijskih metoda lize, ultrazvučna obrada omogućuje visok stupanj kontrole i skaliranja, što je čini osobito prikladnom za standardizirane proteomičke radne postupke.
Prednosti ultrazvučnog FASP-a u odnosu na konvencionalne pristupe
Uključivanje sonikacije u protokole FASP-a pruža mjerljive prednosti koje izravno utječu na rezultate naknadne masene spektrometrije.
Ultrazvučni FASP omogućuje potpunije izdvajanje proteina, osobito iz zahtjevnih uzoraka poput vlaknastih tkiva ili biofilmova. Ujednačena raspodjela energije osigurava dosljednu obradu svih replikata, smanjujući varijabilnost – što je ključni zahtjev kvantitativne proteomike.
Osim toga, sonikacija ubrzava kinetiku digestije poboljšanjem interakcije enzima i supstrata. To često rezultira kraćim vremenom digestije i većim prinosom peptida, uz očuvanje pokrivenosti sekvence.
Sa stajališta radnog postupka, ultrazvučni sustavi smanjuju potrebu za ručnim intervencijama i uklanjaju potrebu za agresivnim kemijskim obradama, čuvajući cjelovitost uzorka i pojednostavljujući standardizaciju protokola.
Vennov dijagram koji prikazuje povećan broj identificiranih proteina primjenom ultrazvučnog FASP-a u usporedbi s FASP-om koji se provodi preko noći
Slika i istraživanje: ©Carvalho et al., 2020
Sonikator za ploče s više jažica UIP400MTP za pripremu uzoraka potpomognutu filtracijom (FASP)
Protokol: ultrazvučni FASP visokog kapaciteta obrade uzoraka uz UIP400MTP
Laboratorijima koji obrađuju velike skupine uzoraka sonikator za mikroploče UIP400MTP omogućuje istodobnu sonikaciju standardnih ploča s više jažica (npr. ploča s 96 jažica), čime se znatno povećavaju kapacitet obrade uzoraka i ponovljivost.
U ovom se formatu uzorci (obično 50–200 µL po jažici) pripremaju izravno u mikropločama kompatibilnima s ultrafiltracijom ili daljnjom obradom. Puferi za lizu slični su onima koji se upotrebljavaju u standardnim protokolima FASP-a.
UIP400MTP ravnomjerno dovodi ultrazvučnu energiju u sve jažice. Sonikacija se obično provodi pri amplitudi od 60–80% tijekom 2–4 minute, ovisno o vrsti uzorka. Pratite temperaturu pomoću priključivog temperaturnog senzora. Upotrebljavajte pulsnu sonikaciju i, po potrebi, laboratorijski rashladni uređaj.
Primjer protokola:
- Za korak alkilacije uzorci se soniciraju sonikatorom za mikroploče (UIP400MTP) pri amplitudi od 40% tijekom 7 ciklusa (30 s uključeno, 15 s isključeno; ukupno vrijeme sonikacije: 5 min 45 s).
- Nakon sonikacije otopina jodoacetamida (IAA) uklanja se centrifugiranjem. Prije digestije tripsinom uzorci se moraju isprati kako bi se uklonila preostala urea, snažno kaotropno sredstvo koje inhibira enzimsku aktivnost. Stoga se uzorci dvaput ispiru s 200 μL otopine amonijeva bikarbonata (AmBic) koncentracije 25 mM.
- Zatim se dodaje 100 μL otopine tripsina (omjer enzima i proteina 1:30) pripremljene u otopini amonijeva bikarbonata koncentracije 12,5 mM. Digestija proteina zatim se provodi uređajem UIP400MTP pod istim uvjetima sonikacije (amplituda 40%, 7 ciklusa, 30 s uključeno / 15 s isključeno; ukupno vrijeme: 5 min 45 s).
- Nakon sonikacije uzorci se prenose na filtarske ploče ili obrađuju sustavima FASP-a koji se temelje na pločama. Koraci redukcije i alkilacije provode se u ploči, čime se održava učinkovit tijek rada.
- Digestija tripsinom provodi se u kontroliranim uvjetima (npr. 37°C, 4–16 sati), uz mogućnost kratkotrajne ultrazvučne stimulacije radi ubrzavanja enzimske aktivnosti i povećanja prinosa peptida.
- Peptidi se izdvajaju centrifugiranjem i spremni su za analizu LC-MS/MS.
Ključna prednost ovog sustava jest njegova sposobnost osiguravanja jednakih uvjeta obrade u svim jažicama, čime se učinci serija svode na najmanju moguću mjeru i omogućuju pouzdane kvantitativne usporedbe u opsežnim proteomičkim istraživanjima.
Sonikator za više epruveta VialTweeter ubrzava i poboljšava pripremu uzoraka potpomognutu filtracijom (FASP) u proteomici
Znanstvena važnost
Uključivanje sonikacije u tijekove rada FASP-a nije samo tehničko poboljšanje – ono predstavlja metodološki napredak u pripremi uzoraka za proteomiku. Kako se ovo područje razvija prema većem kapacitetu obrade uzoraka, automatizaciji i ponovljivosti, ultrazvučne tehnologije rješavaju temeljna uska grla u obradi uzoraka.
Novija istraživanja sve više ističu važnost dosljedne pripreme uzoraka za pouzdano otkrivanje biomarkera i kvantitativnu proteomiku. Ultrazvučni FASP izravno pridonosi tom cilju poboljšanjem učinkovitosti ekstrakcije, dosljednosti digestije i ukupne robusnosti tijeka rada.
Nadalje, skalabilnost ultrazvučnih sustava – od pojedinačnih bočica uz VialTweeter do cijelih mikroploča uz UIP400MTP – u skladu je s rastućom potražnjom za istraživačkom proteomikom i proteomičkim istraživanjima velikih kohorti.
Nabavite sonikator kako biste olakšali svoj tijek rada FASP-a!
Ultrazvučna priprema uzoraka potpomognuta filtracijom objedinjuje dokazane prednosti FASP-a s fizikalnim prednostima sonikacije. Poboljšanjem lize i digestije te standardizacijom tijekova rada ultrazvučni sustavi nude snažno rješenje za modernu proteomiku.
Sonikator za više epruveta VialTweeter i sonikator za mikroploče UIP400MTP pokazuju kako fokusirana ultrazvučna energija može pretvoriti rutinsku pripremu uzoraka u učinkovitiji, ponovljiviji i znanstveno robusniji postupak – što u konačnici dovodi do kvalitetnijih proteomičkih podataka i dubljih bioloških spoznaja.
Odaberite najprikladniji sonikator za pripremu uzoraka potpomognutu filtracijom
| Model sonikatora | Prednosti za FASP | Najprikladnija primjena |
| Sonikator za mikroploče UIP400MTP | Ujednačena sonikacija cijelih mikroploča; visoko ponovljiv unos energije; ubrzava alkilaciju i enzimsku razgradnju u radnim procesima s velikim kapacitetom obrade uzoraka; kompatibilan s automatiziranom pripremom uzoraka. | Radni procesi FASP s velikim kapacitetom obrade uzoraka u pločama s 96 jažica ili sličnim formatima ploča, uključujući primjene probira u proteomici. |
| Sonikator za više epruveta VialTweeter | Istodobna, ujednačena sonikacija više zatvorenih epruveta; svodi unakrsnu kontaminaciju i gubitak uzorka na najmanju moguću mjeru; poboljšava prodiranje reagensa i miješanje, čime povećava učinkovitost alkilacije i razgradnje. | Paralelna obrada više uzoraka za FASP uz umjeren kapacitet obrade i visoku ponovljivost. |
| CupHorn (neizravna sonikacija u „kupelji visokog intenziteta” za hermetički zatvorene epruvete) | Neizravna sonikacija visokog intenziteta za hermetički zatvorene posude; izvrsna kontrola temperature i obrada bez kontaminacije; potiče učinkovit prijenos tvari bez izravnog kontakta sa sondom. | Obrada uzorka u različitim spremnicima za uzorke / osjetljivi ili opasni uzorci koji zahtijevaju zatvorene spremnike i ujednačenu raspodjelu energije. |
| Laboratorijski sonikatori sa sondom (izravna sonikacija) | Maksimalan ultrazvučni intenzitet i prijenos energije; brzo razaranje i ubrzavanje reakcija; učinkoviti za proteinske uzorke koji se teško razgrađuju ili su vrlo složeni. | Obrada pojedinačnih uzoraka, većih uzoraka ili zahtjevnih matrica za koje su potrebne maksimalna snaga i brzina. |
Projektiranje, proizvodnja i savjetovanje – kvaliteta proizvedena u Njemačkoj
Ultrazvučni uređaji Hielscher poznati su po najvišim standardima kvalitete i dizajna. Robusnost i jednostavno rukovanje omogućuju nesmetanu integraciju naših ultrazvučnih uređaja u industrijska postrojenja. Ultrazvučni uređaji Hielscher lako podnose teške uvjete i zahtjevna okruženja.
Hielscher Ultrasonics tvrtka je s ISO certifikatom koja poseban naglasak stavlja na ultrazvučne uređaje visokih performansi koji se odlikuju najsuvremenijom tehnologijom i jednostavnošću uporabe. Naravno, ultrazvučni uređaji Hielscher sukladni su zahtjevima za oznaku CE i ispunjavaju zahtjeve UL, CSA i RoHs.
Često postavljana pitanja
Za što se upotrebljava priprema uzoraka potpomognuta filtracijom?
Priprema uzoraka potpomognuta filtracijom (FASP) upotrebljava se za pripremu proteinskih uzoraka za proteomsku analizu temeljenu na spektrometriji masa. Omogućuje učinkovito uklanjanje detergenata, soli i drugih onečišćujućih tvari male molekulske mase uz zadržavanje proteina na filtru s graničnom vrijednošću molekulske mase, gdje se mogu denaturirati, reducirati, alkilirati i enzimski razgraditi u peptide prikladne za analizu LC–MS/MS.
Koje su prednosti metode FASP u proteomici?
Glavne prednosti metode FASP u proteomici jesu mogućnost obrade složenih uzoraka i uzoraka bogatih detergentima uz dobivanje vrlo čistih peptidnih smjesa kompatibilnih sa spektrometrijom masa. Provođenjem reakcija u ograničenom prostoru filtra poboljšava učinkovitost i ponovljivost razgradnje, smanjuje gubitak uzorka u usporedbi s metodama temeljenima na taloženju te omogućuje učinkovitu izmjenu pufera. Sveukupno, FASP poboljšava iskorištenje peptida, kvalitetu podataka i pokrivenost proteoma, što ga čini robusnim i široko prihvaćenim radnim procesom u proteomici koja se temelji na analizi peptida dobivenih razgradnjom proteina.
Literatura / reference
-
FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
- Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
- Walter, J., Monthoux, C., Fortes, C. et al. (2020): The bovine cumulus proteome is influenced by maturation condition and maturational competence of the oocyte. Scientific Reports 10, 9880 (2020).
Beskontaktni sonikator UIP400MTP olakšava FASP u pločama s 96 jažica
Hielscher Ultrasonics proizvodi ultrazvučne homogenizatore visokih performansi, od laboratorijskih do industrijskih veličina.